專利名稱：一種利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法，具體涉及到一種利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
甘草(Glycyrrhiza)是豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(PapiliantaeTaub.)甘草屬植物，是一種應(yīng)用極廣的中藥材，素有“十方九草”之稱。國內(nèi)外學(xué)者對甘草的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了許多研究，認(rèn)為其主要有效成分是甘草酸和黃酮類化合物。到目前為止，國內(nèi)外對甘草酸的研究已經(jīng)很深入，現(xiàn)已形成規(guī)模化生產(chǎn)。而對甘草黃酮的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用上，對它的提取研究較少。所以在甘草有效成分的生產(chǎn)和開發(fā)中，將黃酮作為次要成分隨藥渣棄去，造成資源的極大浪費。隨著對甘草的深入研究，人們逐步認(rèn)識到從甘草中提取這兩種物質(zhì)的重要性，并已做了初步研究，但這些研究大多是利用常規(guī)的提取方法，時間長、成本高、效率低，這些都制約著黃酮工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。
甘草黃酮在醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品添加劑等行業(yè)上有優(yōu)良作用，國內(nèi)外市場需求日益增大。不少企業(yè)投資擬建甘草黃酮生產(chǎn)廠，但目前大部分甘草加工企業(yè)為傳統(tǒng)加工，多為原料級粗產(chǎn)品生產(chǎn)，規(guī)模效益低，生產(chǎn)水平差，企業(yè)粗放經(jīng)營，粗加工生產(chǎn)附加值低，主要產(chǎn)品單一，產(chǎn)品多限于甘草切片、甘草膏、甘草霜、甘草酸粉等甘草類制品。甘草作為一種重要藥用資源，過于簡單的原料加工，是對資源的一種嚴(yán)重浪費，而重要有益的甘草黃酮類物質(zhì)成分隨著甘草廢渣一起丟棄，無疑是對企業(yè)、國家都是一種重巨大的損失。面對21世紀(jì)天然產(chǎn)物藥物提取、藥理研究的大浪潮，藥用植物的深度開發(fā)、應(yīng)用是每個中草藥加工企業(yè)生存的必然要求。
甘草作為國家重點保護(hù)的二級野生藥材物種。保護(hù)甘草資源，合理開發(fā)利用，不僅對現(xiàn)有脆弱的生態(tài)環(huán)境具有重要意義，而且對國民經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用。甘草黃酮作為一類生物活性較強的成分，在醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品添加劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價值，其市場需求日益強勁。開發(fā)出從甘草渣中提取中提取黃酮類物質(zhì)的研究，有利于資源的科學(xué)利用，對提高產(chǎn)品副加值，農(nóng)民增收等具有重要的意義。
傳統(tǒng)的黃酮提取方法有水浸法、酸堿浸提法、醇提法等，其利用簡單的物理方法提取甘草中的黃酮，效率低且易造成環(huán)境污染。而近來利用微波、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃提法等新型物理儀器提取黃酮的方法，因提取效率較高而受到廣泛關(guān)注，但由于在生產(chǎn)應(yīng)用中存在一次性投資過大、操作煩瑣，使其在工業(yè)應(yīng)用中受到一定程度的制約。
面對上述各種方法存在的問題和缺點，各國科技工作者開始考慮利用酶法輔助提取黃酮類物質(zhì)。如王曉、李林波等人利用酶法提取的山楂葉中總黃酮研究；王暉、劉佳佳銀杏黃酮的酶法提取工藝研究，發(fā)現(xiàn)它在常規(guī)的醇水浸提之前對原料進(jìn)行酶預(yù)處理，可大大提高總黃酮得率，簡單易行。但以上研究僅從預(yù)處理著手，缺少相配套的后繼研究工作，得到的黃酮產(chǎn)品仍為粗提產(chǎn)品，產(chǎn)品雜質(zhì)較多；并且酶的添加在提高得率的同時也必然增加了產(chǎn)物中蛋白雜質(zhì)含量，進(jìn)而降低了產(chǎn)品的等次。
為了解決產(chǎn)物雜質(zhì)較多，純化工藝不足的問題。人們利用活性碳法、硅膠層析、大孔樹脂法等方法進(jìn)行黃酮產(chǎn)品的提取純化。但由于活性碳法、硅膠層析法提取純化都因吸附率低、得率低或再生困難，日益被淘汰。而大孔吸附樹脂作為20世紀(jì)發(fā)展起來的一類不含離子交換基團(tuán)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的吸附性能，解吸附容易，機械強度好，可反復(fù)使用和流體阻力小等優(yōu)點。近幾年大孔吸附樹脂在天然藥物化學(xué)成分的提取、分離純化、制劑工藝改革等方面有較廣泛的應(yīng)用研究。作為一項提取分離純化的新技術(shù)，已得到了極大重視。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，甘草渣中的黃酮類物質(zhì)多為交聯(lián)或吸附在細(xì)胞壁上，傳統(tǒng)的處理方法不易打開這種結(jié)構(gòu)，或在極度的條件下容易破壞甘草黃酮。如何充分利用酶法提取的高效、環(huán)保特點，同時利用大孔樹脂吸附純化的優(yōu)點，克服了前者因加入酶而產(chǎn)生的蛋白雜質(zhì)以及粗提產(chǎn)品中其它雜質(zhì)，且所得的甘草酮產(chǎn)品品質(zhì)好，提取率高具有重要意義，市場亟待這樣綜合的技術(shù)方案。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前國內(nèi)外甘草渣中的黃酮類物質(zhì)多為交聯(lián)或吸附在細(xì)胞壁上，傳統(tǒng)的處理方法不易打開這種結(jié)構(gòu)，或在極度的條件下容易破壞甘草黃酮的現(xiàn)狀。本發(fā)明充分利用酶法提取的高效、環(huán)保特點，同時利用大孔樹脂吸附純化的優(yōu)點，建立一整套利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)因加入酶而產(chǎn)生的蛋白雜質(zhì)以及粗提產(chǎn)品中其它雜質(zhì)，獲得的甘草酮產(chǎn)品品質(zhì)好，提取率高。
本發(fā)明提供一種利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法。具體方法步驟如下1.制備甘草渣提取液，通過以氯仿∶甲酸∶甲醇＝5∶0.5∶1為展層劑，以8％AlCl3為顯色劑，進(jìn)行硅膠薄板層析分析，確定甘草黃酮含量；2.以中性纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶在5mMol/L、pH6.0的磷酸緩沖液下，55℃作用2h處理甘草渣提取液，其中，中性纖維素酶的最適酶活為PH4.5-6.3，最適溫度為55℃，添加量為50U/ml，果膠酶的最適酶活為PH4.0-6.1，最適溫度為57℃，添加量為100U/ml；3.將提取液加無水乙醇，采用料液比為1∶14，配制成80％乙醇溶液，煮沸1h，提取時間為40min，進(jìn)行醇提，濃縮回收溶劑；4.采用膨脹率為1.67的SP825樹脂，其吸附率為91.04(mg/g)，在pH4.0-8.0條件下吸附濃縮后的甘草渣提取液；5.選用高徑比1∶15的層析柱，通過乙醇與水交替反復(fù)洗脫，采用乙酸乙酯為最佳洗脫溶劑，用量為樹脂體積的2-3倍，在10-50℃的靜態(tài)條件下，洗脫流速為10ml/h，過柱液的濃度2％，加液量為柱體積1/3，加樣流速為20ml/h，交替洗脫2-3次，保持樹脂分離使用前狀態(tài)，同時收集總黃酮物質(zhì)。
本發(fā)明具體提供一種以甘草廢渣為原料，通過復(fù)合酶體系的處理，經(jīng)醇提取，再將濃縮后提取液用大孔吸附樹脂吸附，經(jīng)有機溶液洗脫收集總黃酮的方法。
1、對甘草渣處理對所得的提取液進(jìn)行了薄板硅膠層析，通過與標(biāo)樣的對照分析確定提取液的主要成份。
本發(fā)明可通過以氯仿∶甲酸∶甲醇按照5∶0.5∶1為展層劑，硅膠薄板層析，以8％AlCl3為顯色劑，利用黃酮類物質(zhì)與AlCl3作用在紫外光下有特異的綠色熒光，確定甘草黃酮存在。
2、復(fù)合酶預(yù)處理體系反應(yīng)條件的確定。確定中性纖維素酶最適酶活PH4.5-6.3，最適溫度55℃，果膠酶最適酶活PH4.0-6.1，最適溫度57℃，中性纖維素酶添加量為50U/ml，果膠酶100U/ml，在5mMol/L、pH6.0的磷酸緩沖液下，55℃作用2h，對甘草黃酮提取效果明顯。
3、復(fù)合酶預(yù)處理后的醇提體系的確定。醇提的參數(shù)是將酶預(yù)處理液加無水乙醇配制成80％乙醇溶液，料液比為1∶14，煮沸醇提時間為40min，過濾去濾渣，利用比色法測定甘草黃酮提取量。(以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對照品，采用分光光度法510nm測定OD，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程Y＝73.00A-0.03003，Y的單位為mg/L)4、選用日本三菱化學(xué)公司的SP825，確定了樹脂的參數(shù)。樹脂經(jīng)過預(yù)處理的膨脹率為1.67，吸附率為91.04(mg/g)，在pH4.0-8.0，通過乙醇與水交替反復(fù)洗脫，可除去樹脂中的殘留物，洗脫溶劑用量為樹脂體積的2-3倍，交替洗脫2-3次，最終以水洗脫后，保持分離前使用前的狀態(tài)。樹脂的再生，使用甲醇、丙酮、或酸堿、水的反復(fù)處理，即可恢復(fù)樹脂的吸附能力。
5、洗脫條件的選擇及大孔樹脂柱層析條件的確定。本發(fā)明設(shè)計選用了高徑比1∶15層析柱，確定過柱液的濃度2％，加液量為柱體積1/3，流速為20ml/h。以乙酸乙酯為洗脫劑，控制洗脫流速為10ml/h，洗脫效果最佳。
通過以上技術(shù)發(fā)明，可達(dá)到如下技術(shù)效果該方法實現(xiàn)，以甘草或甘草傳統(tǒng)加工提取甘草浸膏等粗提取物后的廢渣為原料，經(jīng)復(fù)合酶體系處理后進(jìn)行醇提取，濃縮后用大孔吸附樹脂吸附，經(jīng)有機溶液洗脫收集總黃酮，其所得甘草總黃酮含量達(dá)到20％以上，雜質(zhì)含量低，濃縮回收溶劑可以反復(fù)使用。


1.利用分光光度計掃描定量分析測定甘草渣中總黃酮類物質(zhì)。
2.不同方法預(yù)處理甘草黃酮類物質(zhì)的效果，圖中數(shù)字具體含義為，1為沸水法，2為醇提法，3為超聲預(yù)處理，4為纖維素酶處理，5為果膠酶處理，6為強堿處理。
3.不同濃度果膠酶添加量對提取的影響。
4.復(fù)合酶體系處理黃酮類物質(zhì)的配比關(guān)系。
5.酶預(yù)處理溫度對提取的影響。
6.酶預(yù)處理pH對提取的影響。
7.酶預(yù)處理時間對提取的影響。
8.不同料液比對提取的影響。
9.不同乙醇濃度對提取的影響。
10.以乙酸乙酯為洗脫劑，對PH對解吸的影響。
11.以乙酸乙酯為洗脫劑，對溫度對解吸的影響。
12.提取液濃度對層析柱吸附的影響。
13.加樣速度對層析柱吸附的影響。
14.洗脫流速的確定。
具體實施例方式
下面，通過參考實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。
實施例一甘草渣中黃酮類物質(zhì)的定性、定量測定定性分性以氯仿∶甲酸∶甲醇＝5∶0.5∶1為展層劑，硅膠薄板層析，以8％AlCl3為顯色劑，利用黃酮類物質(zhì)與AlCl3作用在紫外光下有特異的綠色熒光，確定甘草黃酮存在。
定量分析以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，吸取1ml80％乙醇溶解的適量蘆丁加入10ml的容量瓶中，加0.4ml 5％NaNO2搖均放置6Min，加0.4ml 10％Al(NO3)搖均放置6Min，再加4ml 4％NaOH，加80％乙醇定容至10ml搖均放置15Min，用掃描分光光度計掃描，可見其在350、505nm各有一個峰，其中505處為黃酮類物質(zhì)特有吸收峰，因此確定最佳測定波長為505nm，參見附圖1。
實施例二單酶及復(fù)合酶體系處理甘草廢渣提取液反應(yīng)條件的對比試驗現(xiàn)有的工業(yè)級用酶纖維素酶一般最適酶活PH4.5-7.8，最高作用溫度65℃，果膠酶最適酶活PH4.0-7.3，63℃。選用寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的中性纖維素酶最適酶活PH4.5-6.3，最適溫度55℃，果膠酶最適酶活PH4.0-6.1，57℃，且其纖維素酶中有較高的木質(zhì)素酶酶活，符合本發(fā)明需要，因此確定纖維素酶，果膠酶。同時本發(fā)明根據(jù)選用不同廠家中性纖維素酶和果膠酶處理，在以上選用中性纖維素酶和果膠酶參數(shù)進(jìn)行處理，其提取的甘草黃酮的效果相同。
選用不同的方法預(yù)處理后，其它條件相同，作用1h后，將提取液加無水乙醇配制成80％乙醇溶液，測定甘草黃酮提取量得知，選用復(fù)合酶處理甘草渣，對于有效提取甘草渣中交聯(lián)或吸附在細(xì)胞壁上的黃酮類物質(zhì)效果顯著。由附圖2可以看出在以上各種方法中加入纖維素酶處理和果膠酶處理效果較其它處理方法好，其中果膠酶作用更突出，因此選用纖維素酶處理和果膠酶作為預(yù)處理方法。
實施例三復(fù)合酶體系處理甘草渣提取液條件的確定采用中性纖維素酶最適酶活PH4.5-6.3，最適溫度55℃，果膠酶最適酶活PH4.0-6.1，57℃，考慮到PH對甘草黃酮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，同時考慮到鹽濃度對后提取分離的影響。因此本發(fā)明優(yōu)先選擇作用條件為5mMol/L、pH6.0的磷酸緩沖液下，55℃處理。
由附圖2可以看出在以上各種方法中加入纖維素酶和果膠酶處理的效果較其它處理方法好，其中果膠酶作用更突出，因此選用纖維素酶處理和果膠酶作為預(yù)處理方法。
由不同濃度果膠酶添加量對提取影響可以看出當(dāng)添加量為100U/ml時，提取幾乎達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)增大濃度，提取影響不大，考慮成本選用果膠酶添加量為100U/ml，參見附圖3。
以果膠酶添加量為100U/ml，分別加入不同比例的酶，不同時間取樣。加無水乙醇于樣品配制成80％乙醇溶液，煮沸1h，測定甘草黃酮提取量。
可以看到，當(dāng)纖維素酶與果膠酶添加比為0.5∶1時提取量基本達(dá)到最大值，雖然繼續(xù)增大纖維素的添加量提取量有一定增加，但效果不明顯，考慮成本問題確定選用0.5∶1，即纖維素酶添加量為50U/ml，果膠酶100U/ml，參見附圖4。
通過反復(fù)多次實驗表明，本發(fā)明最終確定中性纖維素酶添加量為50U/ml，果膠酶100U/ml，在5mMol/L、pH6.0的磷酸緩沖液下，55℃作用2h，參見附圖5、附圖6、附圖7。
實施例四醇提條件的確定本發(fā)明通過加無水乙醇于樣品配制成80％乙醇溶液，煮沸1h，測定甘草黃酮提取量。
實驗表明甘草渣醇提的條件為乙醇濃度為80％，采用確定料液比為1∶14，提取時間為40min，甘草渣中黃酮的提取率可達(dá)到2.0％左右。參見附圖8、附圖9。
實施例五大孔樹脂的靜態(tài)條件確定1.大孔樹脂的選型選用了三菱化學(xué)公司的SP825。
2.樹脂的膨脹率取50℃，過夜烘干的樹脂1.12g(2.4ml)，加酒精浸泡，其體積變化為4.0ml。膨脹率＝4.0/2.4＝1.673.樹脂的處理預(yù)處理，通過乙醇與水交替反復(fù)洗脫，可除去樹脂中的殘留物，一般洗脫溶劑用量為樹脂體積的2-3倍，交替洗脫2-3次，最終以水洗脫后，保持分離前使用前的狀態(tài)。
樹脂的再生，使用甲醇、丙酮、或酸堿、水的反復(fù)處理，即可恢復(fù)樹脂的吸附能力4.樹脂的吸附率
稱取樹脂0.4g，加甘草提取液5ml靜止吸附20小時，間歇用手搖動。
吸附率＝ΔC×V/m＝7.34×5/0.4＝91.04(mg/g)

其中C0-提取液初，Ct-吸附后，ΔC＝C0-Ct5.提取液濃度對吸附的影響稱取樹脂0.4g，加甘草提取液(不同稀釋倍數(shù))5ml靜止吸附20小時，間歇用手搖動。

由表可以看出在靜態(tài)條件下，提取液黃酮濃度越高樹脂吸附量越高。
6.提取液pH對吸附的影響稱取樹脂0.4g，加甘草提取液4ml(初始濃度12.6mg/ml)調(diào)節(jié)不同pH，并用乙醇加至5ml，靜止吸附20小時，間歇用手搖動。


由表可以看出，提取液在pH4.0-8.0對吸附率影響不大且成不規(guī)則擺動。
實施例六洗脫條件的確定1.洗脫劑的選擇吸附如前所述(吸附量為26.7mg)。用濾紙濾去上清液，分別使用極性不同的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯作洗脫劑。測洗脫得率。

實驗發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯效果最好，其原因為甘草黃酮易溶于極性較小的試劑中，所以更易洗脫。
2.以乙酸乙酯為洗脫劑，對PH和溫度對解吸的影響由附圖10、附圖11可以看出，洗脫液pH對洗脫影響不大。在10-50℃下解吸率隨著溫度的增加，效率增加，但過了50℃后解吸效果明顯下降，表明在一定溫度下溫度升高分子運動加大，甘草黃酮的溶解度增加有利于解吸。而達(dá)到一定溫度后可能因為樹脂內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化及其它條件影響不利于解吸。
3.不同樹脂性能的比較

由上表可以看出，作為黃酮類物質(zhì)提取常用的ADS97A、DM130的大孔樹脂與SP825相比，其各項性能都比后者低，因此本研究選用SP825是正確的。
實施例七大孔樹脂柱層析條件的確定根據(jù)樹脂層析柱要求范圍在1∶5-1∶20之間，考慮到吸附體積、分離效果和實際應(yīng)用，自行設(shè)計選用了徑高比1∶15層析柱。
確定提取液濃度對柱吸附的影響。以加液量為柱體積1/3，流速為5ml/h加樣。分別以1％、2％、3％、4％的濃度加樣，測定其流出液的濃度，其結(jié)果參見附圖12可以看出，隨著樣濃度的增加，其滲露點提前。但濃度過小不能發(fā)揮層析柱的全部工效，綜合考慮選擇以2％左右為上柱濃度。
采用乙酸乙酯為洗脫劑時，分別以5、10、15、20ml/h測定其流出液的濃度，及洗脫體積。
確定加樣速度對柱吸附的影響。以2％甘草黃酮溶液為上柱濃度，分別以5、10、15、20、25ml/h上樣速度，測定其流出液的濃度。由附圖13可以看出，隨著流速的增大其滲露點提前，其原因可能為流速增大不利于樹脂的完全吸附，從而導(dǎo)致滲露點提前。但在20ml/h以下相對變化較慢，綜合考慮確定以20ml/h為加樣速度。
由附圖14可以看出隨著吸脫速度增加其洗脫體積較大，其濃度偏低，這勢必為甘草黃酮的后加工帶來麻煩。綜合考慮確定洗脫流速為10ml/h。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法，其方法步驟如下，(1).制備甘草渣提取液，通過以氯仿∶甲酸∶甲醇＝5∶0.5∶1為展層劑，以8％AlCl3為顯色劑，進(jìn)行硅膠薄板層析分析，確定甘草黃酮含量；(2).以中性纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶在5mMol/L、pH6.0的磷酸緩沖液下，55℃作用2h處理甘草渣提取液，其中，中性纖維素酶的最適酶活為PH4.5-6.3，最適溫度為55℃，添加量為50U/ml，果膠酶的最適酶活為PH4.0-6.1，最適溫度為57℃，添加量為100U/ml；(3).將提取液加無水乙醇，采用料液比為1∶14，配制成80％乙醇溶液，煮沸1h，提取時間為40min，進(jìn)行醇提，濃縮回收溶劑；(4).采用膨脹率為1.67的SP825樹脂，其吸附率為91.04(mg/g)，在pH4.0-8.0條件下吸附濃縮后的甘草渣提取液；(5).選用高徑比1∶15的層析柱，通過乙醇與水交替反復(fù)洗脫，采用乙酸乙酯為最佳洗脫溶劑，用量為樹脂體積的2-3倍，在10-50℃的靜態(tài)條件下，洗脫流速為10ml/h，過柱液的濃度2％，加液量為柱體積1/3，加樣流速為20ml/h，交替洗脫2-3次，保持樹脂分離使用前狀態(tài)，同時收集總黃酮物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用復(fù)合酶法從甘草廢渣提取黃酮類物質(zhì)的方法。通過以甘草廢渣為原料，經(jīng)醇提取，濃縮后用大孔吸附樹脂吸附，經(jīng)有機溶液洗脫收集總黃酮。濃縮回收溶劑，干燥后即得甘草總黃酮，其所得甘草總黃酮含量達(dá)到20％以上，雜質(zhì)含量低，濃縮回收溶劑可以反復(fù)使用。采用該方法操作簡便，可以充分利用或部分利用甘草加工企業(yè)原有設(shè)備，投資較少，且提取甘草總黃酮效率較高。
文檔編號C12P19/00GK101082055SQ200610084958
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者張志東, 茆軍, 唐琦勇, 歐提庫爾, 王瑋, 楚敏, 婁愷 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所