專利名稱：一種利用超聲波直接轉化蘋果屬植物獲得轉基因苗木的方法
技術領域：
本發(fā)明“一種利用超聲波直接轉化蘋果屬植物獲得轉基因苗木的方法”屬于生物工程育種領域，專用于提高蘋果基因工程的外源基因的轉化效率。
背景技術：
1超聲波的特性和發(fā)生原理頻率超過能聽到的聲波范圍(50～2×104次/秒)的聲波被稱為超聲波，其波長短于普通電波，可以在固體內部傳播。超聲波包括縱波和橫波兩種振動方式，質點振動方向與波的傳播方向一致的稱為縱波，垂直的稱為橫波，它們同時對物體產(chǎn)生影響，并很容易相互交換。
產(chǎn)生超聲波的原理是當電壓加至具有伸縮特征的材料上時，材料就會按照電壓的正負和大小進行振動，產(chǎn)生超聲波。在儀器中超聲波產(chǎn)生的原理是一個短而持續(xù)時間的脈沖電壓去激勵換能器，從而產(chǎn)生短的超聲脈沖。通常用來作脈沖激勵源的電路是電容放電回路，并由換能器把電能轉變成超聲脈沖。
2超聲波的生物學效用一般認為超聲波的生物學效應主要有機械作用、熱化作用以及空化作用。
由于生物組織大多數(shù)屬于軟組織，因而在超聲波的機械力作用下，其細微結構發(fā)生形變。這種形變將隨著超聲波強度的增強而增大，當增加到一定強度時，細胞就會被擊穿。生物組織在超聲波機械能的作用下由于黏滯吸收，將一部分超聲轉化為熱能，使生物組織的溫度上升，稱為超聲波的熱化作用。在超聲波作用下，還會產(chǎn)生空化作用，表現(xiàn)出空泡湮滅過程。小泡內部產(chǎn)生高溫高壓，甚至產(chǎn)生電離效應及放電，推測這可能是導致空泡周圍細胞壁和質膜破損或可逆的質膜透性改變的主要機理，從而使細胞內外發(fā)生物質交換。
超聲波的生物學效應根據(jù)不同的條件而會產(chǎn)生不同的結果。它即可以引起生物大分子甚至細胞的破壞，也可以促進生物大分子的合成和生物體的生長。這些條件包括超聲波處理的頻率、強度、作用時間和生物體的結構功能狀態(tài)。
3超聲波直接轉導外源基因技術在植物遺傳轉化育種中的應用情況超聲波處理植物組織能在植物組織表形成大量的小孔，外源DNA分子可以以此為通道進入帶壁的植物細胞，完成和植物基因組的整合，實現(xiàn)基因的轉化。自從1990年，Joersbo和Brunstedt首次應用該方法將CAT基因轉化進入甜菜基因組后，已經(jīng)在諸多植物的遺傳轉化中得到了應用，詳見下表
3.3超聲波直接轉導外源基因技術在植物遺傳轉化中的應用存在的問題和前景展望將超聲波技術應用于植物遺傳轉化中大大提高了遺傳轉化效率，而且超聲波具有價格便宜，操作簡單，不受宿主范圍限制等諸多優(yōu)點，因此具有巨大的應用潛力。但是超聲波轉化技術中也存在著一些不足之處亟待提高。
首先，諸多報道中雖然指出了超聲波處理的具體參數(shù)，但是沒有給出合理的指定參數(shù)的依據(jù)。而且在研究中使用的超聲波儀器的型號均不同，這樣就造成了實驗參數(shù)沒有普遍應用的價值。
其次，目前的研究僅僅限于對超聲波參數(shù)研究，而很少涉及超聲波參數(shù)和其它影響植物遺傳轉化效率的因素的互作效應的研究。
第三，超聲波的應用范圍還很窄，轉化的植物大多是模式植物，轉化的外源基因大多是報告基因。從超聲波技術在果樹遺傳育種中的應用情況來看，目前只在番木瓜的遺傳轉化中得到了應用，而且所轉化的外植體還是有性的胚，而不是可以可以使性狀得到保持的無性外植體。

發(fā)明內容技術問題 本發(fā)明的目的是針對目前在蘋果等木本植物基因工程育種中存在遺傳轉化效率較低的現(xiàn)狀，提供利用超聲波直接轉導外源基因獲得轉基因株系的育種新方法。此種方法可作為商業(yè)用途的蘋果外源基因轉化在生產(chǎn)上直接使用。
技術方案一種利用超聲波直接轉化蘋果屬植物獲得轉基因苗木的方法，其特征在于1)將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)一個月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有體積比為5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC質粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉移到再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進行抗性篩選，并獲得50mg·L-1卡那霉素抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；2)通過GUS染色、PCR及Southern blotting分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉基因八棱海棠抗性苗。
有益效果本發(fā)明針對超聲波技術目前在植物遺傳轉化中存在的問題，在前人研究的基礎上，首次將超聲波技術應用到重要的經(jīng)濟作物蘋果的遺傳轉化上。
在發(fā)明中首次給出了制定合理的超聲波處理參數(shù)的依據(jù)，并將超聲波直接轉導法首次應用在對蘋果葉片的遺傳轉化上。
該發(fā)明大大提高了蘋果的遺傳轉化效率，具有重要的科研和生產(chǎn)意義。
本發(fā)明首次將超聲波技術應用在蘋果的遺傳轉化上，大大提高了蘋果轉基因的效率。應用超聲波直接轉導法轉導rolC基因轉化蘋果砧木八棱海棠，獲得了1.85％的轉化效率，大大高于普通農桿菌介導法0.1～0.8％的轉化效率。


圖1prolC1質粒圖譜圖2超聲波處理對質粒完整性的影響圖3轉基因八棱海棠植株圖4gus染色結果圖5轉基因八棱海棠的PCR檢測C陰性對照，Z陽性對照，1-8轉化株系1-8圖6轉基因八棱海棠的Southern雜交檢測C陰性對照，Z陽性對照，1-8轉化株系1-8(五)具體實施方法1超聲波直接轉化法1)超聲波處理功率和時間對蘋果葉片再生情況影響將蘋果屬八棱海棠葉片切成小塊放在含有MS液體培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，選擇不同的超聲波功率和時間組合進行超聲波處理。將處理后的葉片轉移到再生培養(yǎng)基上觀察葉片生長情況和再生率。選擇對葉片的生長和再生率影響較小的超聲波時間和功率處理組合作為基因轉化的參數(shù)。
確定超聲波處理時間的上限之后，將超聲波的處理功率和時間進行不同組合，研究其對八棱海棠葉片再生的影響。結果表明不同的超聲波處理組合對葉片再生率有顯著的區(qū)別。(表1)遺傳轉化需要再生率較高的葉片再生系統(tǒng)，因此我們選擇八棱海棠葉片平均再生率在95％以上的14個處理組合進行后繼的轉化試驗(T1，T5，T6，T9，T10，T11，T13，T14，T15，T16，T17，T18，T19，T20)。
表1不同超聲波處理對八棱海棠葉片再生率的影響
2)超波處理功率和時間對轉化質粒完整性的影響選擇不同的超聲波功率和時間的組合對將用于轉化的含有目的基因的質粒進行處理。將處理后的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察質粒的完整性。選擇對質粒的完整性沒有影響的超聲波功率和時間組合作為基因轉化的參數(shù)。
在超聲波處理功率為100w的條件下，分別處理質粒DNA 5，10，20，30，40min。結果發(fā)現(xiàn)質粒DNA在30min之內均能保持完整，而處理40min后發(fā)生降解(圖2)。用超聲波進行外源基因的直接遺傳轉化需要質粒的完整性，因此處理時間只能維持在30min之內。
3)確定超聲波處理最佳參數(shù)選擇第1)部分和第2)部分所確定的參數(shù)組合的交集，對蘋果葉片進行超聲波直接轉化，將轉化后的葉片轉移到再生培養(yǎng)基上預表達后，用GUS染色法對轉化葉片進行染色，計算外源基因的瞬間表達率，選擇瞬間表達率最高的超聲波功率和時間處理組合為最佳處理組合。
表2不同超聲波處理時間和處理功率對gus基因瞬間表達的影響
14個超聲波處理組合均能保持質粒的完整性，并能使八棱海棠的葉片再生率在95％以上，但是對gus基因瞬間表達的研究卻發(fā)現(xiàn)，不同的超聲波處理組合之間該基因的瞬間表達存在顯著差異(表2)。
處理功率為60w的組合T17，T18，T19，T20的葉片gus染色陽性比率顯著低于其它8個處理組合；處理時間為5min的組合T1，T5，T9，T13，T17的葉片gus染色陽性比率顯著低于其它處理功率相同但處理時間較長的組合；處理組合T11和T16的葉片gus染色陽性比率顯著高于其它的處理組合，即在保持質粒的完整性和葉片較高再生率的前提下，較長的處理時間和較高的處理功率有利于gus基因的瞬間表達。
4)確定最佳的DMSO(二甲基亞砜)濃度選擇超聲波處理最佳組合對蘋果葉片進行超聲波處理，在超聲波緩沖液(5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC質粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉)中加入不同濃度的DMSO，對蘋果葉片進行超聲波直接轉化，將轉化后的葉片轉移到再生培養(yǎng)基上預表達后，用GUS染色法對轉化葉片進行染色，計算外源基因的瞬間表達率，選擇瞬間表達率最高的DMSO濃度處理作為最佳的DMSO處理濃度。
選擇最佳處理功率和處理時間組合T11和T16，結合不同DMSO濃度處理，以篩選出最佳的超聲波處理條件(表3)。
當DMSO濃度為5％時，處理T11和T16的gus基因瞬間表達率均得到顯著的提高；但是當DMSO濃度提高到10％以上時，gus基因瞬間表達率反而顯著降低。因表3不同DMSO濃度對gus基因瞬間表達的影響
此5％為最佳的DMSO處理濃度。此外，DMSO濃度均為5％時，處理T11的gus基因瞬間表達率顯著高于處理T16。
綜合以上結果，可以得出處理功率80w，處理時間20min，DMSO濃度為5％是超聲波直接轉導prolC1質粒轉化八棱海棠的最佳處理組合。
5)超聲波直接轉化外源基因并獲得轉化苗1)按超聲波最佳參數(shù)處理組合以及最佳的DMSO濃度對蘋果葉片進行直接轉化，將轉化后的葉片轉移到再生培養(yǎng)基上，使抗性基因得到表達后，再轉移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上從而獲得抗性苗(圖3)。
將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)(QU Shen-Chun，HUANG Xiao-De，ZHANG Zhen，YAO Quan-HONG，TAO Jian-Min，QIAO Yu-Shan，ZHANG Jun-Yi.
Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J]，Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(3)235-240)一個月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有5％(體積比)DMSO、20μl·ml-1包含目的基因rolC的質粒DNA((圖1)見文獻孫愛君，房經(jīng)貴，盛炳成。農桿菌介導rolC基因轉化煙草植株的研究章鎮(zhèn)，南京農業(yè)大學學報，2001，24(1)25～29)、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉、其余為水的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉移到再生培養(yǎng)基(MS+6-BA(6-芐氨基嘌呤)8.0mg·L-1+NAA(萘乙酸)0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1)上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 8.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+Km(卡那霉素)50mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1)上繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進行抗性篩選，并獲得在該抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；通過GUS染色、PCR及Southern blotting等分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉基因八棱海棠抗性苗。
在上述條件下，對486片八棱海棠葉片進行外源rolC基因的直接轉化，共得到237個抗性愈傷組織和9株抗性芽，轉化率為1.85％；對轉化抗性苗的分子檢測結果GUS染色對得到的9株抗性芽葉片進行GUS染色，染色結果均呈陽性(圖4)。
PCR檢測對9個GUS染色陽性芽進行PCR檢測，其中8株的擴增結果呈陽性(圖5)。
Southern blotting雜交對8個PCR陽性轉rolC基因八棱海棠株系的基因組用內切酶EcoR I和Hind III進行雙酶切，與含有rolC基因的探針雜交后，均顯示出特異的雜交帶，而對照植株無雜交條帶出現(xiàn)，證明rolC基因已經(jīng)成功轉入八棱海棠基因組中(圖6)。
權利要求
1.一種利用超聲波直接轉化蘋果屬植物獲得轉基因苗木的方法，其特征在于1)將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)一個月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有體積比為5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC的質粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉移到再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進行抗性篩選，并獲得50mg·L-1卡那霉素抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；2)通過GUS染色、PCR及Southern blotting分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉基因八棱海棠抗性苗。
全文摘要
本發(fā)明“一種利用超聲波直接轉化蘋果屬植物獲得轉基因苗木的方法”屬于生物工程育種領域。超聲波直接轉化法是將蘋果屬八棱海棠葉片切成小塊在含有5％DMSO和20μl·ml
文檔編號C12N15/87GK1944656SQ20061008539
公開日2007年4月11日 申請日期2006年6月13日 優(yōu)先權日2006年6月13日
發(fā)明者陶建敏, 章鎮(zhèn), 王三紅, 喬玉山, 徐長寶, 王紅霞 申請人:南京農業(yè)大學