專利名稱：抗腫瘤血管內(nèi)皮生長因子vegf－e抗原及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮生長因子抗原及其編碼基因與應用，特別是涉及一種血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E的抗原及其編碼基因與其在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗和藥物中的應用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的最重要殺手之一。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤的血管形成密切相關(guān)，對根治性切除術(shù)的術(shù)后患者來說，無微血管侵襲的患者5年復發(fā)率為11％，而存在微血管侵襲的患者5年復發(fā)率高達50％。由于腫瘤區(qū)血管具有相同的特點，因此抗血管形成治療適用于多種實體腫瘤。以血管為靶點、抑制血管形成，從而抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移已成為一條新的腫瘤治療途徑。
研究表明，血管的形成不僅僅取決于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptors，VEGF-R)，同時也受到細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白受體—整合素(integrin)的影響[Kerbel RS.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature，1997，390(6658)335-336.Ellis LM..Angiogenesis and its role incolorectal tumor and metastasis formation[J].Semin Oncol，2004，31(6)3-9.]。各種血管形成相關(guān)因子中，VEGF-E、VEGF-R2和αV β3與腫瘤血管形成的關(guān)系最為密切，可以作為抑制病理性血管形成的直接靶標。
VEGF是一種內(nèi)皮細胞特異性的絲裂源，在體內(nèi)誘導血管生成，是作用最強的血管形成因子之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長因子(placentagrowth factor，PIGF)，其中VEGF-E僅在病理性血管中高表達[Veikkola T，AlitaloK.VEGFs，receptors and angiogenesis[J].CancerBiology，1999，9(3)211-220.]。有實驗證實，應用抗VEGF的單克隆抗體可封閉已分泌的VEGF，阻斷血管形成過程的信號轉(zhuǎn)導，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[Pidgeon GP，Barr MP，Harmey JH，et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)upregulates BCL-2and inhibitsapoptosis in human and murine mammary adenocarc inoma cells[J].Br J Cancer，2001，85(2)273-278.Lichtenbeld HC，F(xiàn)erarra N，Jain RK，et al.Effectof local anti-VEGF antibody treatment on tumor microvessel permeability[J].Microvasc Res，1999，57(3)357-362.]。抗VEGF-E單克隆抗體現(xiàn)在正處于III期臨床。VEGF-E是從羊口瘡病毒感染組分離出來的，是一種分泌型二聚體糖蛋白，既可以分泌到細胞外，也可以結(jié)合到細胞表面或細胞外基質(zhì)，具有最佳的生物利用度和生物潛能。每個單體含有8個特征性的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸通過二硫鍵形成3個環(huán)狀結(jié)構(gòu)loop-1、-2和-3，構(gòu)成其主要的功能區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤血管形成作用的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原。
本發(fā)明所提供的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №1由96個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第23-30位為Loop1的氨基酸殘基序列，自氨基端第46-51位為Loop2的氨基酸殘基序列，自氨基端第68-73位為Loop3的氨基酸殘基序列。
編碼上述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍，可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №2由288個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-288位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。其中，自5’端第67-90位堿基編碼Loop1，自5’端第136-153位堿基編碼Loop2，自5’端第202-219位堿基編碼Loop3。
含有本發(fā)明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增所述抗原基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
與上述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原特異結(jié)合的抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述抗體包括單克隆抗體及多克隆抗體，均可按照常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達上述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的方法。
本發(fā)明所提供的表達上述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的方法，是將含有上述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原。
用于構(gòu)建所述重組表達載體的出發(fā)載體可為在大腸桿菌中表達外源基因的表達載體，如pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c，優(yōu)選為pGEX-4T-2。
以pGEX-4T-2為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體為pGEX-VEGFE。
上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coliTop10等。
可采用構(gòu)建工程菌所用的出發(fā)菌株的常規(guī)培養(yǎng)條件對工程菌進行培養(yǎng)，當所述工程菌為重組大腸桿菌時，需加入IPTG誘導劑，所加入IPTG的濃度為0.8-1.2mmol/L，優(yōu)選為1mmol/L，誘導溫度為35-39℃，優(yōu)選為37℃，誘導時間為2-4小時，優(yōu)選為3小時。
本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原可用于制備預防和/或治療性腫瘤疫苗，編碼血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的基因可用于制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗。
所述預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗中的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因可存在于真核表達載體中。
用于構(gòu)建攜帶有血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的真核表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可在哺乳動物中表達外源基因的表達載體，優(yōu)選為pCI-GPI，其物理圖譜見圖18。
以pCI-GPI為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶有血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體為pCI-VEGFE。
需要的時候，以血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原制備的疫苗中還可以融入顆粒白細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細胞因子的基因或蛋白質(zhì)作為分子免疫佐劑。
本發(fā)明提供了血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E的抗原及其編碼基因。以分別含有本發(fā)明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因及小鼠中相應區(qū)段的真核表達質(zhì)粒作為免疫原免疫小鼠，結(jié)果與PBS、空載體對照組相比，抗原組小鼠血清中均產(chǎn)生了較高水平的抗體，抗原組小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數(shù)量明顯增加，CD4+/CD8+的比值也明顯升高，且本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較小鼠來源的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應；免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS、空載體對照組相比，抗原組小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較小鼠的相應抗原的抑瘤效果更加顯著，抑瘤率可達80％以上。上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原及其編碼基因具有顯著的抑瘤效果，且具有表達量高，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低的優(yōu)點，可制備成預防和/或治療性腫瘤藥物及疫苗。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為用中心模板法分五步PCR擴增血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的模式2為PCR擴增血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為PCR擴增的mVEGF基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞mRNA的RT-PCR鑒定結(jié)果圖5為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測結(jié)果圖6為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Western Blotting鑒定結(jié)果圖7為血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因原核表達載體的構(gòu)建流程8為pCI-VEGFE和pGEX-4T-2質(zhì)粒SalI和NotI雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖9為原核表達及純化的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖10為免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測結(jié)果圖11為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的流式細胞儀測定結(jié)果圖12為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的柱狀13為各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間圖14為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積測量結(jié)果圖15為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤重測量結(jié)果圖16為以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果圖17為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積圖18為載體pCI-GPI的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有引物合成及測序工作均由北京三博生物有限公司完成。
實施例1、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的設計及其編碼基因的克隆一、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的設計通過大范圍文獻檢索(國內(nèi)與國外)及序列比較，獲得了一系列VEGF-E的功能性區(qū)域及這些區(qū)域在不同物種序列中的同源性差異，為制備高效的腫瘤治療性疫苗提供了侯選序列。最終選取口瘡病毒VEGF-E的核心區(qū)包含loop-1、loop-2和loop-3的由96個氨基酸殘基組成的多肽作為血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原，即序列表中的SEQ ID №1，自氨基(N)端第23-30位為Loop1的氨基酸殘基序列，自氨基端第46-51位為Loop2的氨基酸殘基序列，自氨基端第68-73位為Loop3的氨基酸殘基序列。
二、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因及其鼠源相應基因的克隆根據(jù)步驟一設計的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的氨基酸序列推導出編碼該序列的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №2，由288個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-288位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。其中，自5’端第67-90位堿基編碼Loop1，自5’端第136-153位堿基編碼Loop2，自5’端第202-219位堿基編碼Loop3。利用利用中心模板法分5步合成該基因，同時克隆出小鼠中的相應基因片斷(簡稱mVEGF)作為對照，具體方法如下1、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的克隆根據(jù)推導的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F5、R5兩端分別添加限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR V識別位點，引物序列如下F1 5’-AACTGTTAAACGATGCGGCGGTTGCTGTAATGACGACGGTCAAA-3’R1 5’-TTGTATTTCTTGTTTCAACCGCTGTACATATTTGACCGTCATCG-3’；F2 5’-ACTAACCTACAATATAATCCCCGGTGCGTAACTGTTAAACGATG-3’R2 5’-AGACACGCCGGTTACTGAAACTGTTACAGTTGTATTTCTTGTTT-3’；F3 5’-TTTATTTGGGAGAAGAATATCCAGAAAGCACTAACCTACAATAT-3’R3 5 ’-GATACACCACTATTAGTACCAGACGAACTAGACACGCCGGTTAC-3’；F4 5’-AAGTGGTTGTAAACCTAGAGATACTGTAGTATATTTGGGAGAAG-3’R4 5’-CTGTAACACTTGTTCTTTGAAGGTTAGTAGATACACCACTATTA-3’；F5 5’-GCCTCGAGTGGATGCGTACACTAGACAAAAGTGGTTGTAAACC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Xho I識別位點)R5 5’-GCGATATCACAATCGCACTTTGTGTGTTCTGTAACACTTGTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRV識別位點)采用中心模板法分五步PCR擴增目的基因，合成模式圖見圖1(F上游引物，R下游引物)，具體方法如下第一步擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)R1、F1各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸10min。
隨后四步PCR擴增均以上一步PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板進行。擴增體系同上，只是第二步PCR擴增選用引物R2和F2，第三步選用引物R3和F3，第四步選用引物R4和F4，第五步選用引物R5和F5，最后一輪PCR體系放大至100μl以備PCR產(chǎn)物的純化。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s、72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸10min。五次PCR擴增后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.PCR終產(chǎn)物(288bp)；泳道2-5.分步PCR產(chǎn)物)，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為288bp的基因片段(圖2中箭頭所指)，與預期結(jié)果相符。用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體(購自TaKaRa公司)中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結(jié)果擴增片斷具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，擴增序列正確。
2、小鼠中相應基因片斷的擴增1)設計引物根據(jù)GeneBank中小鼠的VEGF基因序列(序列號NP-035827，NM-011697)設計擴增相應區(qū)域(將該片段命名為mVEGF)的引物，并在上、下游引物的兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶XhoI和EcoRV的識別位點，引物序列如下F6(上游引物)5’-GCGCTAGCTGGATAGACGTTTATGCACGTGCC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點)R6(下游引物)5’-GCGATATCGCATTCACATTGGCTGTGTTCTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRV識別位點)。
2)制備鼠胚組織勻漿斷頸處死孕鼠，浸泡于75％乙醇中5min；無菌取出子宮及其中的胚胎、胎盤，用剪刀盡量剔除脂肪和結(jié)締組織并剪碎；將剪碎的組織放于研缽中加液氮研細至粉末狀，收集于冰預冷的玻璃勻漿器中，加入1mL Trizol，勻漿至透明；組織勻漿迅速轉(zhuǎn)入無菌RNase-free EP管中備用。
3)Trizol法提取組織勻漿的總RNA收獲組織勻漿的EP管中加入氯仿200μl，立即顛倒混勻15s，室溫靜置5min；4℃/12000rpm，離心15min；小心將上層液相移入另一新的無菌RNase-free的1.5mL EP管中，加入等量的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；4℃、12000rpm離心10min；棄上清，加入75％的乙醇1mL，顛倒混勻，4℃、7500rpm離心5min，棄上清；重復上步后徹底棄上清，將沉淀自然干燥，加入DEPC水10μl溶解沉淀，直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應。
4)逆轉(zhuǎn)錄反應將步驟3)提取的鼠胚組織的總RNA為模板，以olig(dT)20為引物，用美國Invitrogen的SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase并參照產(chǎn)品說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
5)mVEGF的PCR擴增以步驟4)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，在引物F6和R6的引導下進行PCR擴增，100μl PCR反應體系為2×GC緩沖液I(TaKaRa公司，La Taq附帶)50.0μl，dNTPs混合物(2.5mM)16.0μl，TaKaRa La Taq(5U/μl)1.0μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μl，F(xiàn)6(20μM)2.0μl，R6(20μM)2.0μl，用滅菌去離子水補充總體積至100μl。PCR反應條件先94℃預變性5分鐘；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分鐘，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.PCR產(chǎn)物)，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為288bp的基因片段，與其結(jié)果相符。用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體(購自TaKaRa公司)中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結(jié)果擴增序列正確。
實施例2、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定一、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因真核表達載體的構(gòu)建將實施例1擴增的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR V進行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pCI-GPI[在Promega公司的真核表達質(zhì)粒pCI-neo+基礎上構(gòu)建而成。主要是在pCI-neo+原多克隆位點Nhe I和Xba I酶切位點之間插入通用序列構(gòu)建而成。通用序列的基因順序為5’-Nhe I-信號肽-Xho I-EcoRV-EcoR I-IgG Fc-GPI-Xba I-3’，外源免疫分子基因可以在NheI-EcoR I之間選擇合適的酶切位點插入。pCI-GPI除含有人IgG Fc段(GenBank號Z17370)和糖基化磷脂酰肌醇GPI(GenBank號XM676434)編碼序列外，還含有pCI載體的主要骨架結(jié)構(gòu)，如CMV早期啟動子、嵌合內(nèi)含子、Neo篩選標記、SV40增強子和氨芐抗性基因Ampr+等，物理圖譜見圖18]在16℃下連接12-24小時，連接體系為10×T4DNA連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，PCR純化產(chǎn)物4μl，pCI-GPI載體1μl，加滅菌雙蒸水至10μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選。然后挑取在抗性平板上長出的單菌落進行菌落PCR鑒定將單菌落接種于3mL含100mg/mL氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)3h。培養(yǎng)結(jié)束后，取1μl菌液用100μl水稀釋，煮沸10min，12000rpm離心3min，取上清做模板，在引物F5和R5的引導下進行PCR擴增，25μl PCR反應體系為上清5μl，引物F5和R5各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應條件先94℃預變性5分鐘；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分鐘，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)PCR擴增可獲得長度約為288bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經(jīng)PCR鑒定出的陽性重組子的質(zhì)粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結(jié)果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的真核表達載體，命名為pCI-VEGFE。同時用相同方法將實施例1擴增的小鼠的mVEGF基因片段也連接入載體pCI-GPI中，得到mVEGF真核表達載體，命名為pCI-mVEGFE。
二、真核表達質(zhì)粒的鑒定1、瞬時轉(zhuǎn)染RenCa細胞將步驟一獲得的分別攜帶有真核表達載體pCI-VEGFE和pCI-mVEGFE的陽性克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)12-24小時，用QIAGEN公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒并參照產(chǎn)品說明書提取質(zhì)粒，然后用QIAGEN公司的轉(zhuǎn)染試劑SuperFectTransfection Reagent并參照產(chǎn)品說明書將pCI-VEGFE和pCI-mVEGFE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠腎癌細胞系RenCa，以pCI-neo(Promega公司)為對照。
2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選將轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)約48小時至細胞密度達到50-70％融合時，棄培養(yǎng)液，換用含有G-418(400μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)進行抗性細胞篩選培養(yǎng)，同時用未轉(zhuǎn)染的RenCa細胞作對照。當對照細胞幾乎全部死亡時，G-418濃度可降至200μg/mL以維持篩選作用。兩周后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸增大后，用0.25％(質(zhì)量百分濃度)的胰酶將細胞消化下來，用有限稀釋法挑取單克隆并進行擴大培養(yǎng)。
3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的鑒定1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞mRNA的RT-PCR鑒定用0.25％的胰酶將擴大培養(yǎng)的單克隆細胞消化制成單細胞懸液，收集于玻璃離心管中，1000rpm離心5min，棄上清；PBS洗三次后完全吸棄上清；重懸細胞并計數(shù)，使細胞的終密度為1×106/mL；取1mL細胞懸液加1mL Trizol混勻，提取細胞總RNA，然后用引物F5和R5對轉(zhuǎn)染有pCI-VEGFE質(zhì)粒的細胞進行RT-PCR鑒定，用引物F6和R6對轉(zhuǎn)染有pCI-mVEGFE質(zhì)粒的細胞進行RT-PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.pCI-VEGFE；泳道2.pCI-mVEGF)，經(jīng)擴增均獲得了長度約為288bp的片段，表明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因在轉(zhuǎn)染有pCI-VEGFE質(zhì)粒的RenCa細胞中已在mRNA水平上表達，mVEGFE基因在轉(zhuǎn)染有pCI-mVEGFE質(zhì)粒的RenCa細胞中也已在mRNA水平上表達。
2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測將步驟1)已鑒定的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(以pCI-neo+空載體轉(zhuǎn)染的RenCa細胞和未轉(zhuǎn)染的RenCa細胞分別作為陰性對照和空白對照)用0.25％的胰酶消化制備成單細胞懸液；PBS洗3次后，封閉劑(3％BSA)室溫封閉20-30分鐘；去除封閉劑，加入熒光素標記的鼠抗人IgG(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司)，4℃避光孵育12-24小時；PBS洗3次，調(diào)整細胞濃度至5×105/mL，細胞懸液滴到載玻片上，封片劑(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司)封片。檢測結(jié)果如圖5所示(1.pCI-VEGFE轉(zhuǎn)染細胞；2.pCI-mVEGF轉(zhuǎn)染細胞；3.pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞；4.RenCa細胞)，表明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因和mVEGF基因分別在各自轉(zhuǎn)染的細胞中獲得表達。
3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Western Blotting鑒定將步驟2)鑒定的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(以pCI-neo+空載體轉(zhuǎn)染的RenCa細胞和未轉(zhuǎn)染的RenCa細胞分別作為陰性對照和空白對照)用0.25％胰酶消化，收集細胞，PBS洗滌兩次；用含1％Triton X-100的TBS(50mM Tris-Cl，pH7.6，150mM NaCl)裂解細胞30min；4℃、12000rpm離心10min收集上清；對待測樣品進行15％SDS-PAGE電泳分離后，用半干轉(zhuǎn)移儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(電壓15V，轉(zhuǎn)移1小時)；用含5％脫脂奶粉的TBST(TBS+0.05％Tween 20)室溫封閉1小時；加入HRP標記的鼠抗人IgG單克隆抗體(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司，按1∶500比例稀釋)4℃孵育12-24小時；TBST洗滌后，加入二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司，按1∶2000比例稀釋)，室溫孵育2小時；TBST洗滌后，用ECL進行曝光顯色。檢測結(jié)果如圖6所示(泳道1.pCI-VEGFE轉(zhuǎn)染細胞；泳道2.pCI-mVEGF轉(zhuǎn)染細胞；泳道3.pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞；泳道4.RenCa細胞)，進一步證明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因和mVEGF基因分別在各自的轉(zhuǎn)染細胞中獲得表達。
實施例3、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的原核表達一、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因原核表達載體的構(gòu)建參見圖7構(gòu)建血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的原核表達載體，具體方法為
將純化的pCI-VEGFE質(zhì)粒和pGEX-4T-2(Pharmac ia公司)分別用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI進行雙酶切，對酶切產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖8所示(泳道M1.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-15000；泳道M2.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.pGEX-4T-2酶切前；泳道2.pGEX-4T-2酶切后；泳道3.VEGF-E)，用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化線性化的pGEX-4T-2及288bp的pCI-VEGFE的酶切片段(圖8中的箭頭所指片段)，然后將純化的目的片段和線性化pGEX-4T-2載體16℃連接12-24小時，連接體系為10×連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl，目的基因4μl，pGEX-4T-2載體1μl，用雙蒸水補充反應體系至10μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選，然后挑取在抗性平板上長出的單菌落并在引物F5和R5的引導下進行菌落PCR鑒定，經(jīng)PCR擴增可獲得長度約為288bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經(jīng)PCR鑒定出的陽性重組子的質(zhì)粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結(jié)果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的原核表達載體，命名為pGEX-VEGFE。
二、工程菌的獲得及包涵體的大量制備將pGEX-VEGFE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用與步驟一相同的方法篩選出陽性重組菌株，然后按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨芐青霉素的1000mL LB液體培養(yǎng)基中在37℃下進行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加入化學誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，4℃、6000rpm離心15min收集菌體，用100mL TE緩沖液(20mmol/L，pH8.0)重懸菌體沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室溫磁力攪拌10min；冰浴中超聲波(30秒/開，20秒/停，15個循環(huán))破碎菌體；4℃、12000rpm離心20min分別收集包涵體沉淀和上清。將包涵體沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗滌1次，4℃、12000rpm離心20min以去除包涵體中的雜蛋白，棄上清后再用TE緩沖液洗滌2次，4℃、12000rpm離心20min收集沉淀，用下述步驟進行純化。
三、目的蛋白的純化用8mol/L的脲溶解包涵體，20℃、12000rpm離心10min后添加巰基乙醇至1％(體積百分濃度)；將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(購自Pharmacia公司)用6mol/L脲的TE緩沖液平衡后上樣；用6mol/L脲的TE緩沖液洗脫出穿過峰后，用不同濃度(濃度為0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.5M和1M)的NaCl(6mol/L脲的TE緩沖液配制)洗脫，收集相關(guān)洗脫峰；每個峰取樣進行SDS-PAGE鑒定，根據(jù)電泳結(jié)果，將32KD的目的蛋白組分再進行S-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱和SephardexG-50柱(購自Pharmacia公司)進行純化，最后對經(jīng)純化的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖9所示，表明獲得了32KD經(jīng)純化的目的蛋白，即血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原。
實施例4、血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的抑瘤活性檢測一、動物的分組與免疫6周齡Balb/c小鼠分為5組，每組9只。A組為空白對照組；B組為PBS對照組；C組為pCI-neo+空載體組；F-1組為pCI-mVEGF組；F-2組為pCI-VEGFE組。
將三種質(zhì)粒DNA(pCI-neo、pCI-mVEGF(實施例2構(gòu)建)、pCI-VEGFE(實施例2構(gòu)建))分別與轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE按1∶1(m∶v)的比例混合，輕輕振蕩后室溫放置15分鐘，得到LipofectAMINE-質(zhì)粒DNA復合物，作為免疫用DNA。免疫采用股四頭肌肌肉多點注射，100μg/只首先注射100μl 0.25％布比卡因預處理接種部位，72h后在相同部位初次免疫，分別于第3周和6周各加強免疫1次。
二、血清抗體效價的ELISA檢測每組小鼠于每次免疫后2周經(jīng)尾靜脈取血，室溫放置3h后3000rpm離心10min，取上層血清用ELISA法檢測抗體滴度，以驗證抗原的體液免疫反應，同時設立免疫前鼠血清的陰性對照和PBS空白對照，ELISA檢測方法如下將實施例3純化獲得的蛋白質(zhì)用包被液稀釋至終濃度為5μg/mL，包被ELISA板，4℃靜置12-24小時；PBST洗滌甩棄ELISA板孔中的包被液，PBST洗滌1次；用2％酪蛋白液室溫封閉4h，棄去封閉液，拍干ELISA板；將免疫鼠血清用PBS倍比稀釋后加入各孔，100ul/孔，37℃靜置30min；用PBST洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司)，37℃反應20min；PBST洗滌后，用TMB顯色10min，2M硫酸終止反應；最后用SPECTRAIII酶聯(lián)儀檢測450nm的OD值。結(jié)果判定待測樣品的OD值與陰性對照的OD值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)為陽性，顯示陽性結(jié)果的最大抗體稀釋度為免疫小鼠血清的抗體效價。免疫小鼠血清中的抗體效價檢測結(jié)果如表1所示，表1免疫小鼠血清中的抗體效價

注※與PBS、pCI-neo+和小鼠同種抗原對照組相比，該組小鼠均產(chǎn)生特異性抗體(P＜0.05)※※兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價(P＜0.05)與PBS和空載體對照組相比，抗原組小鼠血清中均產(chǎn)生了較高水平的抗體，兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價，此外，本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較相應的小鼠同種抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
三、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測1、免疫小鼠脾淋巴細胞的分離每組免疫小鼠各取三只，無菌分離脾淋巴細胞，方法為斷頸處死小鼠，75％乙醇中滅菌5min，隨即放入超凈臺內(nèi)成右側(cè)臥位；無菌取出脾臟，放于平皿(內(nèi)裝預冷的8mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液)中，盡量剔除脂肪和結(jié)締組織，于200目不銹鋼網(wǎng)上用研磨棒輕輕擠壓脾組織；將脾細胞懸液8mL緩慢沿管壁緩慢加入裝有4mL Ficoll淋巴細胞分離液(購自Pharmacia公司)的透明離心管中，2000rpm水平離心20min；小心吸取白膜層，用10mL預冷的培養(yǎng)基洗2次(1000rpm、10min)，將細胞重懸于含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL。
2、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測對步驟1分離的免疫小鼠的脾淋巴細胞用Murine IFN γ和IL-4ELISPOT試劑盒并參照試劑盒說明書進行IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測，檢測結(jié)果見表2和圖10所示，表2免疫小鼠IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測

注※與B、C對照組比較，ELISPOT檢測該組小鼠斑點數(shù)增多P＜0.05，※※P＜0.01與PBS和空載體對照組相比，抗原組(F-1組和F-2組)小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數(shù)量與對照組比均明顯增加，且本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
四、免疫小鼠脾淋巴細胞的T細胞亞群測定取小鼠脾細胞1×106/mL-2×106/mL，PBS洗兩次；分別加入PE標記的抗CD4+mAb和FITC標記的抗CD8+mAb(購自北京晶美生物有限公司)各20ul，混勻后4℃避光反應30min；PBS洗兩次后，加入0.5mL熒光保存液(0.15mol/L PBS，20g/L葡萄糖，10g/L甲醛及1g/LNaN3)重懸細胞，用流式細胞儀分析T細胞亞群，免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的流式細胞儀測定結(jié)果如表3和圖11、圖12所示。
表3流式細胞儀測定的免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數(shù)的比例

注※與B、C對照組比較，該組小鼠CD4+/CD8+的比值顯著增高P＜0.05，※※P＜0.01與PBS和空載體對照組相比，抗原組(F-1組和F-2組)小鼠脾細胞中CD4+/CD8+的比值明顯升高，且本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
五、檢測免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的保護作用末次免疫后一周對各組余下6只免疫小鼠進行皮下移植瘤攻擊。收獲對數(shù)生長期的RenCa細胞，制備單細胞懸液，用生理鹽水洗兩次，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，于小鼠背部右側(cè)皮下接種100μl細胞懸液即1×106/只。皮下移植瘤攻擊后，觀察小鼠移植瘤的生長情況。待腫瘤結(jié)節(jié)形成后(可捫及，長徑約2-3mm)，記錄每組小鼠的成瘤時間，同時觀察小鼠的存活狀況。于腫瘤細胞攻擊后50天處死小鼠，拍照；用游標卡尺測量腫瘤的垂直長徑(a)和垂直短徑(b)，依照公式計算移植瘤體積；稱取瘤重，依照公式計算腫瘤的抑制率。
各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間見表4和圖13，皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積見圖17(從左到右依次是小鼠存活情況、在體顯示腫瘤體積、離體顯示腫瘤體積)，其中存活率統(tǒng)計結(jié)果見表5，瘤體積測量結(jié)果見表6和圖14，瘤重測量結(jié)果見圖15，各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果見表7，其中以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果的柱狀圖見圖16，表4各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間


注※與B、C對照組比較該組小鼠成瘤潛伏期延長(P＜0.05)表5皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況

注※與B、C對照組比較該組小鼠存活率明顯增加(P＜0.05)表6皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積

注※與B、C對照組比較該組小鼠腫瘤體積明顯縮小(P＜0.001)表7各組免疫小鼠對腫瘤的抑制作用

注※與對照組相比，該組小鼠對腫瘤的抑制作用非常顯著(P＜0.01)；※※P＜0.001免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS和空載體對照組相比，抗原組(F-1組和F-2組)小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原較小鼠的相應抗原的抑瘤效果更加顯著。
序列表<160>2<210>1<211>96<212>PRT<213>口瘡病毒<400>1Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val1 5 10 15Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn20 25 30Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Asp35 40 45Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val50 55 60Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser65 70 75 80Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys85 90 95<210>2<211>288<212>DNA<213>口瘡病毒<400>2tggatgcgta cactagacaa aagtggttgt aaacctagag atactgttgt ttatttggga 60gaagaatatc cagaaagcac taacctacaa tataatcccc ggtgcgtaac tgttaaacga 120tgcggcggtt gctgtaacga tgacggtcaa atatgtacag cggttgaaac aagaaataca 180
actgtaacag tttcagtaac cggcgtgtct agttcgtctg gtactaatag tggtgtatct 240actaaccttc aaagaacaag tgttacagaa cacacaaagt gcgattgt 288
權(quán)利要求
1.血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
5.一種表達血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原的方法，是將含有權(quán)利要求2或3所述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述重組表達載體的出發(fā)載體為pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c；以pGEX-4T-2為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體為pGEX-VEGFE；所述宿主為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coliTop10。
7.與權(quán)利要求1所述血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原特異結(jié)合的抗體。
8.權(quán)利要求1所述的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物中的應用。
9.權(quán)利要求2或3所述的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因在制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗及藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述DNA疫苗中的血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因存在于真核表達載體中；所述攜帶有血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原基因的真核表達載體為pCI-VEGFE。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗腫瘤血管內(nèi)皮生長因子VEGF－E的抗原及其編碼基因與應用。其目的是提供血管內(nèi)皮生長因子VEGF－E的抗原及其編碼基因與其在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗中的應用。該抗原具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。其編碼基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子VEGF－E抗原及其編碼基因具有顯著的抑瘤效果，且具有表達量高，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低的優(yōu)點，可制備成預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/12GK1903880SQ20061008909
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者于繼云, 閻瑾琦, 劉穎, 陳興, 修冰水, 賈銳, 劉國棟, 王浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所