專利名稱：檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測牛傳染病病毒的基因芯片。芯片的制備方法、檢測方法和檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
狂犬病由狂犬病病毒引起，又稱恐水癥，特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度興奮和嚴(yán)重意識(shí)障礙，有陣發(fā)性興奮和沖擊動(dòng)作，最后因呼吸神經(jīng)麻痹而死亡。病死率極高，人和各種畜禽都有易感性。在我國發(fā)病率持續(xù)上升，目前世界重點(diǎn)流行地區(qū)仍在亞洲，以東南亞國家為主，近年世界流行趨勢還有所上升。
牛病毒性腹瀉是由粘膜病病毒引起的牛、羊傳染病。以消化道黏膜糜爛壞死、腹瀉為特征。病畜和帶毒者的鼻腔分泌物、乳汁、眼淚、尿、糞、精液等都含有病毒，通過直接、間接接觸和消化道、呼吸道感染。
口蹄疫是由蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物的急性接觸性傳染病。以口腔黏膜、蹄部出現(xiàn)水皰和潰爛為特征，牛最易感，人也可患病。死亡率高達(dá)30％-50％?？谔阋呤峭ㄟ^直接和間接接觸傳播。易感動(dòng)物的呼吸道、消化道和損傷的皮膚、粘膜都可以是感染門戶。
牛瘟俗稱“爛腸瘟”、“膽脹瘟”，是由牛瘟病毒引起牛的一種急性經(jīng)過的傳染病。其病理特征是消化道黏膜的出血炎性壞死性變化。晚期腹瀉、脫水，導(dǎo)致循環(huán)障礙，衰竭死亡。牛瘟常呈暴發(fā)性流行，發(fā)病率可達(dá)100％，死亡率可達(dá)90％以上。
牛蘭舌病是以昆蟲為傳染媒介的反芻動(dòng)物的一種病毒性傳染病。發(fā)病后，舌、口、齒黏膜充血腫脹，出現(xiàn)淤點(diǎn)，以后變?yōu)榍嘧仙?br> 這些病毒性疾病是對養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的一類疾病，不僅可造成大批牲畜死亡，也會(huì)給我們健康帶來威脅，尤其現(xiàn)代化的養(yǎng)殖業(yè)，牲畜飼養(yǎng)高度集中，調(diào)度頻繁，更易受到病毒的侵襲，因此病毒的防治和研究已在獸醫(yī)學(xué)科中占據(jù)首位(參見蔡寶祥，家畜傳染病學(xué)，1，2005)。由于病毒是非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微生物，只能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，所以要求抗病毒藥物既能穿入細(xì)胞選擇性抑制病毒復(fù)制，又不損傷宿主細(xì)胞，但目前為止尚無理想抗病毒藥物(參見陳忠斌，生物芯片技術(shù)，386，2005)，因此，快速鑒定對病毒感染的早期診斷、鑒別診斷、控制傳播具有極其重要的意義。現(xiàn)在病毒的檢測一般方法有病原體單獨(dú)分離鑒定、免疫化學(xué)法、酶免法、分子生物學(xué)技術(shù)等(參見Clinica Chimica Acta35149-63(2005).)。
病原單獨(dú)分離鑒定要取特定部位新鮮材料，所用器械應(yīng)盡可能嚴(yán)格消毒，再將樣品處理后，接種于動(dòng)物體內(nèi)或者組織細(xì)胞內(nèi)，觀察其生長情況，此法在免疫化學(xué)法結(jié)果不確定時(shí)可采用。病原的分離過程至少18h得到結(jié)果。
免疫學(xué)診斷包括血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和變態(tài)反應(yīng)。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)是用已知的抗原來測定被檢動(dòng)物血清中的特異性抗體，或用已知的抗體來測定被檢材料中的抗原。具體有中和實(shí)驗(yàn)，凝集實(shí)驗(yàn)，沉淀實(shí)驗(yàn)，溶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等。變態(tài)反應(yīng)是機(jī)體對病原體的再次進(jìn)入產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，注入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)可引起局部或全身反應(yīng)。此方法廣泛應(yīng)用于各種檢測，發(fā)展迅速。
上述檢測方法一次只能確定一種或排除一種病毒，不能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高通量的檢測。另一方面，由于人體對外來的病毒產(chǎn)生免疫有一定的時(shí)滯，因此對無應(yīng)答者和檢測體內(nèi)病毒數(shù)量的變化存在困難，所以誕生了分子生物學(xué)診斷技術(shù)，分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括核酸探針技術(shù)，PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)。PCR技術(shù)主要檢測病原，做早期診斷和傳染源的鑒定。具有高度敏感性，敏感性可達(dá)0.1pg(參見蔡寶祥，家畜傳染病院學(xué)，24，2005)方法簡便，快速，目前建立了反轉(zhuǎn)錄RT-PCR，毛細(xì)管PCR、套式PCR等方式，只要知道病原微生物特異的核酸序列，就可以檢測。
核酸探針技術(shù)涉及三部分，即待測核酸，固相載體(硝酸纖維素膜)和用同位素，酶，熒光標(biāo)記的核酸探針。核酸探針技術(shù)有原位雜交(直接在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行雜交反應(yīng))，斑點(diǎn)雜交(將待測的核酸或細(xì)胞裂解物，經(jīng)過變性后直接點(diǎn)到固相膜上)，Southern雜交等，利用酶底物反應(yīng)或放射自顯影可見預(yù)期條帶。探針技術(shù)敏感性高，檢測一個(gè)單基因需104拷貝，能檢測低至10-13gDNA。特異性強(qiáng)，可以從混合標(biāo)本中正確鑒定出目的病原微生物。(參見蔡寶祥，家畜傳染病院學(xué)，25，2005)。
基因芯片技術(shù)是在核酸雜交，測序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，把已知序列的探針有序地固定在膜上，每個(gè)點(diǎn)就代表某個(gè)特定基因，然后將樣本中的靶基因進(jìn)行生物素標(biāo)記，與基因芯片進(jìn)行雜交，來對基因序列及功能進(jìn)行研究?；蛐酒夹g(shù)包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)芯片制備，樣品制備，生物分子反應(yīng)及信號的檢測與分析。在整個(gè)過程中，基因芯片就猶如一面超高倍率放大鏡，能迅速發(fā)現(xiàn)病原體的有無。
總的來說，因芯片技術(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。基因芯片技術(shù)具有高度并行性、多樣性、微型化和自動(dòng)化這四大特點(diǎn)。高度并行性有利于基因芯片所示圖譜的快速對照和閱讀，效率大為提高；多樣性則提供了多種樣品測定；微型化的好處在于對樣品的需要量非常少，而且還能節(jié)省試劑用量，降低成本；自動(dòng)化使得人力投入減少并保證了質(zhì)量。同時(shí)，它還具有操作簡便、信息綜合處理能力強(qiáng)、結(jié)果可靠和儀器配套齊全等優(yōu)勢，它集中了現(xiàn)在所有病毒診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，降低了假陽性和假陰性的發(fā)生率問題，提高了特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測牛傳染病病毒的基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的檢測方法技術(shù)存在的不足。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測牛傳染病病毒的基因芯片的制備方法。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種利用上述基因芯片來快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測牛傳染病病毒的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于檢測牛傳染病病毒的試劑盒。
為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的檢測牛傳染病病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，芯片樣品點(diǎn)的布局為低密度布局，樣品點(diǎn)少于200個(gè)；所述的寡聚核苷酸檢測探針是從牛狂犬病毒、牛腹瀉病毒、?？谔阋卟《?、牛瘟病毒和牛蘭舌病毒中的對應(yīng)病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA或cDNA片段。
其中所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從牛狂犬病毒、牛腹瀉病毒、?？谔阋卟《?、牛瘟病毒和牛蘭舌病毒基因組的核苷酸序列中對應(yīng)選取的DNA或cDNA段。
其中所述的從?？袢《净蚪M的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO6所示的堿基序列；從牛腹瀉病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO2或SEQ ID NO7所示的堿基序列；從?？谔阋卟《净蚪M的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示的堿基序列；從牛瘟病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO4或SEQ ID NO9所示的堿基序列；從牛蘭舌病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO5或SEQ ID NO10所示的堿基序列。
本發(fā)明檢測牛傳染病病毒的基因芯片的制備方法，包括以下的步驟(1)探針的設(shè)計(jì)根據(jù)所述的牛的五種病毒中的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對，選擇出種內(nèi)保守性高、種間特異性高的序列作為探針，所述的探針分別具有如下所述的序列，從?？袢《净蚪M的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO1或SEQID NO6所示的堿基序列；從牛腹瀉病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQID NO2或SEQ ID NO7所示的堿基序列；從牛口蹄疫病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示的堿基序列；從牛瘟病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO4或SEQ ID NO9所示的堿基序列；從牛蘭舌病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO5或SEQ ID NO10所示的堿基序列；(2)探針的合成設(shè)計(jì)好的探針片段序列分割為寡聚核苷酸片段，人工合成上述的寡聚核苷酸片段，再將合成的寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)連接出所需要的目的探針片段；(3)芯片的制備包括切膜、貼膜，然后將上述得到的目的探針點(diǎn)膜，再經(jīng)烤膜、存膜即得芯片，其中點(diǎn)膜后得樣品點(diǎn)直徑在50μm-2000μm。
其中探針序列SEQ ID NO1分割成如SEQ ID NO11～NO16所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO2分割成如SEQ ID NO17～NO22所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO3分割成如SEQ ID NO23～NO28所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO4分割成如SEQ ID NO29～NO32所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO5分割成如SEQ ID NO33～NO38所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO6分割成如SEQ IDNO39～NO44所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO7分割成如SEQ ID NO45～NO50所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO8分割成如SEQ ID NO51～NO56所示的寡聚核苷酸(oligo)片段，探針序列SEQ ID NO9分割成如SEQ ID NO57～NO60所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO10分割成如SEQ ID NO61～NO66所示的寡聚核苷酸片段。
其中上述步驟(2)所述的合成的寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)的第二步PCR反應(yīng)的引物如下合成SEQ ID NO1～SEQ ID NO5探針?biāo)玫拿繉σ锓謩e為SEQ IDNO67～NO76所示的序列；合成SEQ ID NO6～NO10的探針?biāo)玫囊锓謩e為SEQ IDNO77～NO86所示的序列。其中上述步驟(2)所述的合成的寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)的第二步PCR反應(yīng)的引物如下合成SEQ ID NO1～SEQ ID NO5探針?biāo)玫拿繉σ锓謩e為SEQ ID NO67和NO68、SEQ ID NO69和NO70、SEQ ID NO71和NO72、SEQID NO73和NO74、SEQ ID NO75和NO76所示的序列；合成SEQ ID NO6～NO10的探針?biāo)玫拿繉σ锓謩e為SEQ ID NO77和NO78、SEQ ID NO79和NO80、SEQ ID NO81和NO82、SEQ ID NO83和NO84、SEQ ID NO85和NO86所示的序列。
本發(fā)明牛傳染病病毒的檢測方法，包括以下的步驟(1)待測樣本處理采用常規(guī)方法提取待測樣品的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記PCR擴(kuò)增(2)雜交顯色；將步驟(1)得到的標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1所述的基因芯片進(jìn)行雜交，然后顯色；(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。
本發(fā)明用于檢測牛傳染病病毒的試劑盒，包括上述的基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交、顯色試劑和說明書。
由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明首次將基因芯片技術(shù)引入牛五種病毒的檢測領(lǐng)域，創(chuàng)造了一種快速、靈敏、高準(zhǔn)確性、重復(fù)性強(qiáng)的病毒檢測芯片及其檢測方法，利用本發(fā)明的基因芯片可以達(dá)到檢測常見的牛五種病毒的目的，由于操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)無論對于實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)鑒定還是對于生產(chǎn)實(shí)踐研究和診斷都具有重要的意義。


圖1為芯片布局示意圖；圖為2牛五種病毒檢測陰性結(jié)果；圖為3牛五重模板濃度為0.002pg的顯色結(jié)果；圖4為牛五重模板濃度為0.02pg的顯色結(jié)果；圖5為牛五重模板濃度為0.2pg的顯色結(jié)果；圖6為牛五重模板濃度為2pg的顯色結(jié)果。
為進(jìn)一步說明本發(fā)明用于檢測牛五種病毒的基因芯片及其檢測方法，特舉以下的實(shí)施例進(jìn)行說明，該實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1狂犬病毒探針的設(shè)計(jì)與合成一、設(shè)計(jì)文獻(xiàn)檢索及美國國家生物信息中心(NCBI)的比對獲得狂犬病毒候選特異性探針序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，如果該序列種內(nèi)保守性高、種間特異性高，即可以設(shè)計(jì)為探針。
以下是選取的狂犬病毒基因組的兩個(gè)核酸序列片段1CCGGAGAAGT AGTCCTCGTC ATCAGAGTTG ACAGTTCCAT CATCCGCCAA TGCCACATCA GTCTTTGTCAGTTCAGCCGC CTCATATTCT TGAAGTTCTT TCTCATCTCT GAAGAATCTT CTTTCAAATG TCCCTTTCCCGAAGAATTCC TCTCCCAGAT AGCCCCCTAA AACAGACATC TCATGAGGAG CACATGCGGC GATAACTGTTGCATTTAGGG ATCTGACTTG ACCCATATAG CATCCAACAA AGTGAATGAG ATTAAACACG TGACCAACGGCATTCGATGA ATAAGGAGACTTCCCACTCA AGCCTAGTGA ACGGAAGTGA ATGAAATACG AGTGAGGAAC
片段2ATATCAGG ACAGAACACT GGCAACTATA AGACAAACAT TGCAGATAGG ATAGAGCAGA TTTTTGAGAC AGCCCCTTTT ATTAAAATCG TGGAGCACCA TACTCTAATG ACAACTCACA AAATGTGTGC TAATTGGAGT ACTATACCGA ATTTCAGATT TTTGGCCGGA ACCTACGACA TGTTTTTCTC CCGGATTGAG CATCTATATT將上述病毒片段1和片段2輸入軟件Primo Multiplex 3.4 Multiplex PCR PrimerDesign，設(shè)定好參數(shù)，運(yùn)行程序，(5’PRIMER 0-200 3’PRIMER-200-0 TM57℃ TM FormulaNearest N ％GC 50 ANYCheck primer-primer dimmer Avoid backgroung primingMultiplex PCR 5 Specificity Medium其余參數(shù)為默認(rèn)值.)選取長度合適的計(jì)算結(jié)果，最終作為病毒探針片段。
二、合成合成長片段DNA的成本高，因此我們利用生物信息學(xué)工具將目的片段分割成幾個(gè)寡聚核苷酸(寡核苷酸片段)。將已經(jīng)設(shè)計(jì)好的探針目的片段輸入網(wǎng)站http://publish.yorku.ca pjohnson/AssemblyPCR寡聚核苷酸maker.html，(設(shè)定參數(shù)Nearest N，Monovalent cation concentration 50.0mM，DNA concentration 0.5uM，Length 60bp，Annealing temperature 57℃，Overlaping Melting temperature 40℃)利用其上述工具進(jìn)行分割片段1分割成下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 15’-GTACACCACAGTACCGCGATATGTGGCAACCCAGGGTTACC-3’oligo 25’-GCACAGGGTGTGTCATCGAAATTTGAAATGAGGTAACCCTGGGTTGCCACAT-3’oligo 35’-AATTTCGATGACACACCCTGTGCATTCACTCCGGAGGGCACTATCAGTAGTC-3’oligo 45’-AGCAGTGGGCTCATTGGGTATAATGCATTTTGACTACTGATAGTGCCCTCCG-3’oligo 55’-ATTATACCCAATGAGCCCACTGCTCCAAGAATGTTTCCGCGGGTCAACCAGG-3’oligo 65’-GACCAGTGTACGAGCGCATGACCTGGTTGACCCGCGGAAA-3’片段2分割為下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 75’-ATATCAGGACAGAACACTGGCAACTATAAGACAAACATTGCAGATAGG-3’oligo 85’-AATAAAAGGGGCTGTCTCAAAAATCTGCTCTATCCTATCTGCAATGTTTGTCTTATAGT-3’oligo 95’-GATTTTTGAGACAGCCCCTTTTAAAATCGTGAGCACCATACTCTAATGACAACTC-3’
oligo 105’-TCGGTATAGTACTCCAATTAGCACACATTTTGTGAGTTGTCATTAGAGTATGGTGCTCC-3’oligo 115’-GTGTGCTAATTGGAGTACTATACCGAATTTCAGTTTTTGGCCGGAACCTACGACATG-3’oligo 125’-AATATAGATGCTTCAATCCGGGAGAAAAACATGTCGTAGGTTCCGGCC-3’將上述分割的多個(gè)寡聚核苷酸片段及引物送商業(yè)公司處合成。將合成的多個(gè)寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)，連接出我們需要的目的探針片段。根據(jù)片段1和片段2設(shè)計(jì)的擴(kuò)增探針片段的每對引物分別為P1和P2、P3和P4；；P15’-GTACACCACAGTACCGCGA-3’P25’-GACCAGTGTACGAGCGCA-3’P35′-ATATCAGGACAGAACACTGGCAAC-3′P45′-AATATAGATGCTCAATCCGGGAGA-3′片段1的合成第一步PCR反應(yīng)體系

第二步PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)程序，第一步PCR

第二步PCR

片段2的合成
除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo7～Oligo12，引物替換為P3和P4外，其反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同片段1。
實(shí)施例2牛腹瀉病毒探針的設(shè)計(jì)與合成方法同實(shí)施例1，選取的牛腹瀉病毒基因組的兩個(gè)核酸序列片段3TTGGATG GCTGAAGCCC TGAGTACAGG GTAGTCGTCA GTGGTTCGAC GCCTTAGGATCTGAGGCCTC GAGATGCCAC GTGGACGAGG GCATGCCCAC AGCACATCCT ATTCCGGACGAGGGTCGCCC GGAAGAAAGC GGTTGTACTA ACCGTTATGG ACACGGCCTG ATAGG片段4GTCCAACGGG CGATGTTCCA AAGAAACGTG AGTAGGAGCC TGCACGGGAT TTGGCCTGAAAGAATATGTGCCGGTGTCCC CTCCCATCTA GCCACTGATA CTGAACTGAA AACGATTCTTGGTATGATGG ATGCAAGTGAGAAGACCAAT TATACCTGTT GCAGGCTCCA GCGCCACGAATGGAACAAAC ATGGCTGGTG CAACTGGTTTAATATAGAAC CTTGGCTTCT CCTAATGAACAAAACCCAGG CCAATCTGAC CCAGGGCCAA CCACCAAGAGAGTGTGCAGT CACATGTAGATATGATAGGG ACTCTGACTT AAATGTGGTG ACGCAGGCCA GGGACAGCCC片段3分割成下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 135’-TTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTG-3”oligo 145’-AGGCCTCAGATCCTAAGGCGTCGAACCACTGACGACTACCCTGTACTCA-3’oligo 155’-CGCCTTAGGATCTGAGGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATG-3’oligo 165’-GACCCTCGTCCGGAATAGGATGTGCTGTGGGCATGCCCTCGTCCACG-3’oligo 175’-CATCCTATTCCGGACGAGGGTCGCCCGGAAGAAAGCGGTTGTACTAACCG-3’oligo 185’-CCTATCAGGCCGTGTCCATAACGGTTAGTACAACCGCTTTCTT-3’片段4分割為下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 195’-TGTGCCGGTGTCCCCTCCCATCTAGCCACTGATACTGAACTGAAAAC-3’oligo 205’-CTTCTCACTTGCATCCATCATACCAAGAATCGTTTTCAGTTCAGTATCAGTGGCTAGA-3’oligo 215’-GGTATGATGGATGCAAGTGAGAAGACCAATTATACCTGTTGCAGGCTCCAGCGC-3
oligo 225’-CCAGTTGCACCAGCCATGTTTGTTCCATTCGTGGCGCTGGAGCCTGCAAC-3’oligo 235’-CATGGCTGGTGCAACTGGTTTAATATAGAACCTTGGCTTCTCCTAATGAACAAAAC-3’oligo 245’-GCCCTGGGTCAGATTGGCCTGGGTTTTGTTCATTAGGAGAAGCCAAGGT-3’根據(jù)片段3和片段4設(shè)計(jì)的探針片段的每對引物分別為P5和P6、P7和P8；P55′-TTGGATGGCTGAAGCCCTG-3′P65′-CCTATCAGGCCGTGTCCATAAC-3′P75′-TGTGCCGGTGTCCCCT-3P85′-GCCCTGGGTCAGATTGGC-3′片段3的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo13～Oligo18，引物替換為P5和P6外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
片段4的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo19～Oligo24，引物替換為P7和P8外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
實(shí)施例3口蹄疫病毒探針的設(shè)計(jì)與合成方法同實(shí)施例1，選取的口蹄疫病毒基因組的兩個(gè)核酸序列片段5CGGGGCCAAAAGCCACGTCCAGATGGACCCACCATGTGTG CAACCCCAGC ACGGCAACCTTACTGCGAACACCACCTTAACGTGACACTGATACTGGTAC TCGGTCACTG GTGACAGACTAAGGATGCCCTTCAGGTACCCCGAGGTAACACGGGACACT CGGGATCTGA GAAGGGGATTGGGACTTCTTTAAAAGTGTCCAATTTAAAAAGCTTCTATG TCTGAATAGG CGACCGGAGGCCGGCGCCTTTCCATTACCTACTACTAAATCCATGAATACGACTGACTGTTTTATCGCTCTGCTACACATTCTCAGAGAGATCAAAGCAC TGTTTCTGTCGCGAACACAA片段6GATCTCAA CGACCCCGGT AAGTACAAGG AGGCCAAGGA ATGGCTGGAC AACGCGCGCC AAGCGTGTCT GAAGAGCGGG AACGTCCACA TTGCCAACCT GTGCAAAGTG GTTGCTCCAG CGCCCAGCAA GTCGAGGCCC GAACCAGTGG TCGTGTGTCT TCGCGGCAAA TCCGGCCAAG GGAAGAGTTT CCTCGCGAAC GTTCTCGCACAGGCAATCTC CACCCACTTC ACTGGCAG
片段5分割成下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 255’-ACCACCTTAACGTGACACTGATACTGGTACTCGGTCACTGGTG-3’oligo 265’-CTCGGGGTACCTGAAGGGCATCCTTAGTCTGTCACCAGTGACCGAGTACCAG-3’oligo 275’-CCCTTCAGGTACCCCGAGGTAACACGGGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGATT-3’oligo 285’-CATAGAAGCTTTTTAAATTGGACACTTTTAAAGAAGTCCCAATCCCCTTCTCAGATC-3’oligo 295’-TTCTTTAAAAGTGTCCAATTTAAAAAGCTTCTATGTCTGAATAGGCGACCGGAGGCC-3’oligo 305’-TTTAGTAGTAGGTAATGGAAAGGCGCCGGCCTCCGGTCGCC-3’片段6分割為下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 315’-GATCTCAACGACCCCGGTAAGTACAAGGAGGCCAAGGAATGGCTGGAC-3’oligo 325’-GTGGACGTTCCCGCTCTTCAGACACGCTTGGCGCGCGTTGTCCAGCCATTCCTTGGC-3’oligo 335’-AGAGCGGGAACGTCCACATTGCCAACCTGTGCAAAGTGGTTGCTCCAGCGCCCAG-3’oligo 345’-GCCGCGAAGACACACGACCACTGGTTCTCGACTTGCTGGGCGCTGGAGCA-3’oligo 355’-TCGTGTGTCTTCGCGGCAAATCCGGCCAAGGGAAGAGTTTCCTCGCGAACGTTCTCG-3’oligo 365’-CTGCCAGTGAAGTGGGTGGAGATTGCCTGTGCGAGAACGTTCGCGAGGAA-3’根據(jù)片段5和片段6設(shè)計(jì)的探針片段的每對引物分別為P9和P10、P11和P12；P95′-TTCAGGTACCCCGAGGTAACA-3′P105′-ATTTAGTAGTAGGTAATGGAAAGGCGC-3′P115′-GATCTCAACGACCCCGGTAAG-3′P125′-CTGCCAGTGAAGTGGGTGG-3′片段5的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo25～Oligo30，引物替換為P9和P10外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
片段6的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo31～Oligo36，引物替換為P11和P12外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
實(shí)施例4牛瘟病毒探針的設(shè)計(jì)與合成方法同實(shí)施例1，選取的牛瘟病毒基因組的兩個(gè)核酸序列
片段7CTCTCAGAAA TTAAGGGGGT GATAGTACAC CGTCTGGAGG GTGTCTCTTA CAATATAGGGTCACAAGAGTGGTACACCAC AGTACCGCGA TATGTGGCAA CCCAGGGTTA CCTCATTTCAAATTTCGATG ACACACCCTGTGCATTCACT CCGGAGGGCA CTATCAGTAG TCAAAATGCATTATACCCAA TGAGCCCACT GCTCCAAGAATGTTTCCGCG GGTCAACCAG GTCATGCGCTCGTACACTGG TCTCTGGGTC CATAGGGAAT AGGTTTATCCTATCTAAGGG GAACCTCATTGCTAACTGTG CCTCTATTTT GTGCAAGTGT TACACCACTG GCTCAATAAT AAGTCAAGAT片段8T TCGCAGGAGT GGTTTTGGCT GGTGCAGCTC TCGGAGTTGC AACCGCAGCCCAGATCACAG CAGGGATCGC CCTTCATCAG TCAATGATGA ATTCCCAGGC CATCGAAAGTCTCAAGGCAAGTCTGGTAAC AACCAATCAA GCGATTGAGG A片段7分割成下述的4個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 375’-CCCTATCTTTTTAGGTTCAATGCATTACGATATAACTTATGAAGCTCTGAAGA-3’oligo 385’-CAATTCATCATCGTAAACTATCCGCTGCGCATTATTCTTCAGAGCTTCATAAGTTATATCGTAATGC-3’Oligo395’-CAGCGGATAGTTTACGATGATGAATTGCAAATGCATATACTTAGAGGACCGTTACACTTCCAG-3’oligo 405’-TTAACGCACCTAATATTGCTCGGCGCTGGAAGTGTAACGGTCCTCTAAGT-3’片段8分割為下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 415’-TTCGCAGGAGTGGTTTTGGCTGGTGCAGCTCTCGGAGTTGCAACCGC-3’oligo 425’-TCATTGACTGATGAAGGGCGATCCCTGCTGTGATCTGGGCTGCGGTTGCAACTCCGAG-3’oligo 435’-GATCGCCCTTCATCAGTCAATGATGAATTCCCAGGCCATCGAAAGTCTCAAGGCAAGTCT-3’oligo 445’-TCCTCAATCGCTTGATTGGTTGTTACCAGACTTGCCTTGAGACTTTCGA-3’根據(jù)片段7和片段8設(shè)計(jì)的探針片段的每對引物分別為P13和P14、P15和P16；P135’-CCCTATCTTTTTAGGTTCAATGCATTACG-3’P145’-TTAACGCACCTAATATTGCTCGGC-3’P155′-TTCGCAGGAGTGGTTTTGGC-3′P165′-TCCTCAATCGCTTGATTGGTTGT-3′
片段7的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo37～Oligo40，引物替換為P13和P14外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
片段8的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo41～Oligo44，引物替換為P15和P16外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
實(shí)施例5牛蘭舌病毒探針的設(shè)計(jì)與合成方法同實(shí)施例1，選取的牛蘭舌病毒基因組的兩個(gè)核酸序列片段9AGAGGCAGCG GAAAGAAGTG AAGATGAAAT CAAAATGGTA AAAGAGTATA GACAGAAGAT TGATGCGCTTAAAAGTGCGA TAGAGATTGA GCGTGATGGA ATGCAGGAAG AGGCTATACA AGAGATCGCT GGAATGACAGCAGACGTGCT AGAGGCGGCA TCAGAAGAAG TGCCTTTGAT AGGTGCCGGT ATG片段10TTTCGATTTC GAGCACGTTC AGTAGCGCAA TACATGCGAG GCGTATGATA AGATCACGCG CTGTACACCCTATCTTTTTA GGTTCAATGC ATTACGATAT AACTTATGAA GCTCTGAAGA ATAATGCGCA GCGGATAGTTTACGATGATG AATTGCAAAT GCATATACTT AGAGGACCGT TACACTTCCA GCGCCGAGCA ATATTAGGTGCGTTAAAATT CGGAGTTAAG ATATTAGGCG ATAAGATAGA TGTTCCCCTC TTCTTACGAA ATGCTTGAACGCAGCGGGGG AGGACCTTCC片段9分割成下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 455’-AGAGGCAGCGGAAAGAAGTGAAGATGAAATCAAAATGGTAAAAGAGTATAG-3’oligo 465’-CACTTTTAAGCGCATCAATCTTCTGTCTATACTCTTTTACCATTTTGATTTCATCTCAC-3’oligo 475’-CAGAAGATTGATGCGCTTAAAAGTGCGATAGAGATTGAGCGTGATGGAATGCAG-3’oligo 485’-GCTGTCATTCCAGCGATCTCTTGTATAGCCTCTTCCTGCATTCCATCACGCTCAA-3’oligo 495’-TACAAGAGATCGCTGGAATGACAGCAGACGTGCTAGAGGCGGCATCAGAAGAAG-3’oligo 505’-CATACCGGCACCTATCAAAGGCACTTCTTCTGATGCCGCCTC-3’片段10分割為下述的6個(gè)寡聚核苷酸序列oligo 515’-ATCTTTTTAGGTTCAATGCATTACGATATAACTTATGAAGCTC-3’oligo 525’-AACTATCCGCTGCGCATTATTCTTCAGAGCTTCATAAGTTATATCGTAATGCATTG-3’oligo 535’-GAAGAATAATGCGCAGCGGATAGTTTACGATGATGAATTGCAAATGCATATACTTAGA-3’
oligo 545’-CGCTGGAAGTGTAACGGTCCTCTAAGTATATGCATTTGCAATTCATCATCGTAAAC-3’oligo 555’-GACCGTTACACTTCCAGCGCCGAGCAATATTAGGTGCGTTAAAATTCGGAG-3’oligo 565’-CGCCTAATATCTTAACTCCGAATTTTAACGCACCTAATATTGC-3’根據(jù)片段9和片段10設(shè)計(jì)的探針片段的每對引物分別為P17和P18、P19和P20；P175′-AGAGGCAGCGGAAAGAAGTG-3′P185′-CATACCGGCACCTATCAAAGGC-3′P195’-ATCTTTTTAGGTTCAATGCATTACGATATAACTTATG-3’P205’-CGCCTAATATCTTAACTCCGAATTTTAACG-3’片段9的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo45～Oligo50，引物替換為P17和P18外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
片段10的合成除Oligo片段相應(yīng)的替換為Oligo51～Oligo56，引物替換為P19和P20外，合成時(shí)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
實(shí)施例6待測樣品的處理與反轉(zhuǎn)錄待測樣品的處理樣本來源牛糞便。以滅菌的棉拭子從直腸深處或泄殖腔粘膜上蘸取糞便，將拭子一并放入盛有500μl PBS的1.5ml EP管中，加蓋編號密封好的樣本放在干冰環(huán)境下冷凍，送入處理病毒的P3級實(shí)驗(yàn)室。
1.取滅菌的1.5ml EP管，為被檢樣品處理管；陰性對照由試劑盒提供，在試劑盒中已標(biāo)出，另裝于試劑盒中1.5ml EP管。陽性對照由試劑盒提供，在處理樣本前加入被檢樣品管作為陽性內(nèi)參。
2、每樣品管加600μl預(yù)冷的裂解液，陰性對照相同操作，一份樣本換用一個(gè)吸頭，再加入200μl三氯甲烷，混勻器上震蕩混勻5s，冰上靜置15min，于4℃、12000r/min離心20min。
3、取與1步相同數(shù)量的1.5ml EP管，加入500μl異丙醇，做標(biāo)記，吸取本標(biāo)準(zhǔn)2步各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清也應(yīng)吸取500μl，不能吸取中間層，顛倒混勻。-20℃放置5min沉淀RNA。
4、于4℃、12000r/min離心15min，小心棄去上清液，加入700μl 75％乙醇，顛倒洗滌。
5、于4℃、12000r/min離心10min，小心倒去上清液，空氣中晾干6、加入12μl的DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，若需長期保存須放置-70℃冰箱。樣品存放制備的樣品在2℃-8℃條件下保存不超過24小時(shí)，若需長期保存應(yīng)置-70℃以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成取經(jīng)過處理的含有RNA的12μl樣品溶液管，及陰性對照溶液管。同時(shí)平行進(jìn)行以下操作。
1.取與逆轉(zhuǎn)錄步驟相同數(shù)量的0.2ml RNase-free PCR管，吸取提取RNA的各樣品管8.5μl總RNA轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入2μl隨機(jī)引物(1.5μg/μl)。小心混勻。
2.75℃保溫5分鐘。
3.迅速放置于冰上10分鐘，高速離心5秒鐘，將所有溶液收集到管底。
4.按次序分別加入下列試劑4μl 5X First-Strand Buffer0.5μl Ribonuclease inhibitor(RNA酶抑制劑)2μl dNTP mix(10mM)2μl 50mmol/L MgCl21μl AMV Reverse Transcriptase(逆轉(zhuǎn)錄酶)(25U/μl)總體積20μl5.小心混勻，42℃保溫1小時(shí)。
6.90℃處理5分鐘，滅活A(yù)MV逆轉(zhuǎn)錄酶。冰上冷卻5min，室溫高速離心5秒鐘，將所有溶液收集到管底。
7.20μl反應(yīng)產(chǎn)物可直接作為模板用于PCR標(biāo)記擴(kuò)增，然后進(jìn)入雜交步驟。
實(shí)施例7牛五種病毒芯片制備過程和雜交顯色過程
1、探針定量經(jīng)膠回收后用凝膠成像儀定量FMDV44.374ng/μlBVDV31.636ng/μlRV 55.342ng/μlRPV 76.5260ng/μlBTV 65.343ng/μl探針稀釋，用10％海藻糖稀釋，點(diǎn)膜DNA量分別為FMDV，RV，BTV為1ng，BVDV，RPV為1.5ng。
空白對照，10％海藻糖。
陰性對照(牛看家基因GAPDH基因)CTGACCCTGCTTCCTTGTGTCCACAGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGCGTCCCCACTCCCAACGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACCTGTGAGTTTGGGTTGGAGCAGCTTCGATGGCCTGCGGGGCCAGCGCGGGGGAGTTGCAAGACTGGAACTCCTGTGACCA陽性對照(人工合成序列)ACAGTCAATACCCGCTACGCGCGTCTGAGTTCAACTTGGTTGAGCCGTTAAACTGCATTCAGATTCGCCAGCTTCGGATTGCTACAGTGGGTCGATATCTGAGAACATCACGACGTCGATATGGGTCTTTCTACCCTCGAGGTGGCGCGATGAAGGTTTTTCATCTACTCAGACCGCTGATCCCT得到純化的探針片斷后，配置探針溶液，準(zhǔn)備芯片點(diǎn)樣。
2、芯片制作2.1、切膜選用合適的硝酸纖維素膜或尼龍膜，于切膜機(jī)中準(zhǔn)確裁剪成方形芯片。規(guī)格1.5cm×1.5cm。
2.2貼膜將芯片用膠固定于芯片方皿中，使之緊貼皿底，放置，待膠凝固，用一15.0×15.0mm方形模具輕壓芯片，使之緊貼芯片方皿底部，放置2分鐘，使膠凝固，芯片平整地貼于芯片方皿底部，并在芯片方皿的邊框上作一定向標(biāo)志或編號。
2.3點(diǎn)膜對探針分布進(jìn)行合理布局，設(shè)陽性、陰性對照點(diǎn)。再將已配制好的探針溶液逐個(gè)加入與已布局好的點(diǎn)樣針相應(yīng)位置的探針盤孔中。每種探針點(diǎn)兩針，點(diǎn)樣時(shí)將點(diǎn)樣儀推拉桿推到吸樣位置，點(diǎn)樣針與探針盤孔對準(zhǔn)，按下頂部按鈕，吸取探針(樣品)液，停留3-5秒，吸樣完畢，放松按鈕，點(diǎn)樣針架自動(dòng)彈起。然后將點(diǎn)樣儀推拉桿推到點(diǎn)樣位置，此時(shí)已吸液的點(diǎn)樣針對準(zhǔn)芯片方皿中的膜片，按下按鈕，停留3-5秒，放松按鈕，點(diǎn)樣針架自動(dòng)彈起。重復(fù)此操作1-3次，點(diǎn)樣完畢。
芯片探針排布如圖11和5FMDV2和6BVDV3和7RV4和8RPV9和13 BTV11陰性對照CTGACCCTGCTTCCTTGTGTCCACAGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGCGTCCCCACTCCCAACGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACCTGTGAGTTTGGGTTGGAGCAGCTTCGATGGCCTGCGGGGCCAGCGCGGGGGAGTTGCAAGACTGGAACTCCTGTGACCA15陽性對照ACAGTCAATACCCGCTACGCGCGTCTGAGTTCAACTTGGTTGAGCCGTTAAACTGCATTCAGATTCGCCAGCTTCGGATTGCTACAGTGGGTCGATATCTGAGAACATCACGACGTCGATATGGGTCTTTCTACCCTCGAGGTGGCGCGATGAAGGTTTTTCATCTACTCAGACCGCTGATCCCT10、12、14和16空白10％海藻糖2.4烤膜點(diǎn)樣完畢，待芯片自然干燥，將芯片方皿放置鼓風(fēng)干燥箱中，80℃、120分鐘，靜至室溫，封裝，4℃保存待用。
3、樣本PCR產(chǎn)物標(biāo)記反應(yīng)體系30μl

以上試劑混合均勻，置熱蓋PCR儀中，進(jìn)行35個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增。程序如下

4、樣本PCR標(biāo)記產(chǎn)物變性將用生物素標(biāo)記好的PCR循環(huán)后的產(chǎn)物置PCR儀中100℃加熱變性10分鐘，然后迅速放入-20℃冰箱中驟冷10分鐘。
5、雜交5.1預(yù)雜交在裝有基因芯片的方形小皿上寫上樣品編號，向小皿中加入450μl預(yù)雜交液，置雜交儀上，于40℃預(yù)雜交45分鐘，振蕩頻率IV。使用真空泵吸去預(yù)雜交液。
5.2雜交取變性完成的PCR擴(kuò)增標(biāo)記物30μl，置1.5ml離心管中，加入400μl雜交液，振蕩混勻，加入已經(jīng)過預(yù)雜交的基因芯片的小皿中，置雜交儀上，于52℃振蕩雜交1小時(shí)，振蕩頻率IV。用真空泵吸去雜交液。
5.3洗滌分別用2×SSC和0.1×SSC洗滌液將雜交芯片洗滌2次(加入洗滌液450μl)，洗滌時(shí)振蕩，吸去余液。時(shí)間五分鐘。
5.4封閉向雜交芯片中加入400μl封閉液，置雜交儀上，于42℃封閉30min，振蕩頻率IV，吸去封閉液。
5.5酶聯(lián)取400μl酶聯(lián)緩沖液，按酶聯(lián)緩沖液SAv-AP＝1200∶1的比例加入SAv-AP，振蕩混勻，加入雜交芯片中，置雜交儀上，于42℃酶聯(lián)反應(yīng)15min，振蕩頻率IV。吸去反應(yīng)液，用酶聯(lián)緩沖液450μl將雜交芯片洗滌3次，吸去洗滌液。
5.6顯色加入顯色液顯色(400μl底物液+2μl BCIP+2μl NBT)，置雜交儀上，避光、常溫或42℃顯色，振蕩頻率IV，隨時(shí)觀察雜交芯片上各點(diǎn)顯色情況及本底深淺。
5.7終止顯色用0.5M EDTA液終止顯色，或者用自來水及蒸溜水終止顯色并反復(fù)沖洗芯片，觀察顯色狀況。每次3分鐘。
6、結(jié)果觀察顯色結(jié)果見圖2至圖6由圖可以看出，顯色效果隨模板的濃度的增加越來越清晰，2pg顯色效果明顯好于0.002pg。
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9SEQUENCE LISTING<110>北京愛普益生物科技有限公司<120>檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒<130>SGF111<160>88<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>350<212>DNA<213>狂犬病毒<400>1ccggagaagt agtcctcgtc atcagagttg acagttccat catccgccaa tgccacatca 60gtctttgtca gttcagccgc ctcatattct tgaagttctt tctcatctct gaagaatctt120ctttcaaatg tccctttccc gaagaattcc tctcccagat agccccctaa aacagacatc180tcatgaggag cacatgcggc gataactgtt gcatttaggg atctgacttg acccatatag240catccaacaa agtgaatgag attaaacacg tgaccaacgg cattcgatga ataaggagac300ttcccactca agcctagtga acggaagtga atgaaatacg agtgaggaac 350<210>2<211>172<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>2ttggatggct gaagccctga gtacagggta gtcgtcagtg gttcgacgcc ttaggatctg 60aggcctcgag atgccacgtg gacgagggca tgcccacagc acatcctatt ccggacgagg120gtcgcccgga agaaagcggt tgtactaacc gttatggaca cggcctgata gg172<210>3<211>350<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>3cggggccaaa agccacgtcc agatggaccc accatgtgtg caaccccagc acggcaacct 60tactgcgaac accaccttaa cgtgacactg atactggtac tcggtcactg gtgacagact120aaggatgccc ttcaggtacc ccgaggtaac acgggacact cgggatctga gaaggggatt180gggacttctt taaaagtgtc caatttaaaa agcttctatg tctgaatagg cgaccggagg240ccggcgcctt tccattacct actactaaat ccatgaatac gactgactgt tttatcgctc300tgctacacat tctcagagag atcaaagcac tgtttctgtc gcgaacacaa 350<210>4<211>360<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>4ctctcagaaa ttaagggggt gatagtacac cgtctggagg gtgtctctta caatataggg 60tcacaagagt ggtacaccac agtaccgcga tatgtggcaa cccagggtta cctcatttca120aatttcgatg acacaccctg tgcattcact ccggagggca ctatcagtag tcaaaatgca180
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9ttatacccaa tgagcccact gctccaagaa tgtttccgcg ggtcaaccag gtcatgcgct240cgtacactgg tctctgggtc catagggaat aggtttatcc tatctaaggg gaacctcatt300gctaactgtg cctctatttt gtgcaagtgt tacaccactg gctcaataat aagtcaagat360<210>5<211>193<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>5agaggcagcg gaaagaagtg aagatgaaat caaaatggta aaagagtata gacagaagat 60tgatgcgctt aaaagtgcga tagagattga gcgtgatgga atgcaggaag aggctataca120agagatcgct ggaatgacag cagacgtgct agaggcggca tcagaagaag tgcctttgat180aggtgccggt atg 193<210>6<211>208<212>DNA<213>狂犬病毒<400>6atatcaggac agaacactgg caactataag acaaacattg cagataggat agagcagatt 60tttgagacag ccccttttat taaaatcgtg gagcaccata ctctaatgac aactcacaaa120atgtgtgcta attggagtac tataccgaat ttcagatttt tggccggaac ctacgacatg180tttttctccc ggattgagca tctatatt 208<210>7<211>350<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>7gtccaacggg cgatgttcca aagaaacgtg agtaggagcc tgcacgggat ttggcctgaa 60agaatatgtg ccggtgtccc ctcccatcta gccactgata ctgaactgaa aacgattctt120ggtatgatgg atgcaagtga gaagaccaat tatacctgtt gcaggctcca gcgccacgaa180tggaacaaac atggctggtg caactggttt aatatagaac cttggcttct cctaatgaac240aaaacccagg ccaatctgac ccagggccaa ccaccaagag agtgtgcagt cacatgtaga300tatgataggg actctgactt aaatgtggtg acgcaggcca gggacagccc 350<210>8<211>236<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>8gatctcaacg accccggtaa gtacaaggag gccaaggaat ggctggacaa cgcgcgccaa 60gcgtgtctga agagcgggaa cgtccacatt gccaacctgt gcaaagtggt tgctccagcg120cccagcaagt cgaggcccga accagtggtc gtgtgtcttc gcggcaaatc cggccaaggg180aagagtttcc tcgcgaacgt tctcgcacag gcaatctcca cccacttcac tggcag236<210>9<211>152<212>DNA<213>牛瘟病毒檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<400>9ttcgcaggag tggttttggc tggtgcagct ctcggagttg caaccgcagc ccagatcaca 60gcagggatcg cccttcatca gtcaatgatg aattcccagg ccatcgaaag tctcaaggca120agtctggtaa caaccaatca agcgattgag ga 152<210>10<211>300<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>10tttcgatttc gagcacgttc agtagcgcaa tacatgcgag gcgtatgata agatcacgcg 60ctgtacaccc tatcttttta ggttcaatgc attacgatat aacttatgaa gctctgaaga120ataatgcgca gcggatagtt tacgatgatg aattgcaaat gcatatactt agaggaccgt180tacacttcca gcgccgagca atattaggtg cgttaaaatt cggagttaag atattaggcg240ataagataga tgttcccctc ttcttacgaa atgcttgaac gcagcggggg aggaccttcc300<210>11<211>41<212>DNA<213>狂犬病毒<400>11gtacaccaca gtaccgcgat atgtggcaac ccagggttac c 41<210>12<211>52<212>DNA<213>狂犬病毒<400>12gcacagggtg tgtcatcgaa atttgaaatg aggtaaccct gggttgccac at 52<210>13<211>52<212>DNA<213>狂犬病毒<400>13aatttcgatg acacaccctg tgcattcact ccggagggca ctatcagtag tc 52<210>14<211>52<212>DNA<213>狂犬病毒<400>14agcagtgggc tcattgggta taatgcattt tgactactga tagtgccctc cg 52<210>15<211>52<212>DNA<213>狂犬病毒<400>15attataccca atgagcccac tgctccaaga atgtttccgc gggtcaacca gg 52<210>16<211>40<212>DNA<213>狂犬病毒檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<400>16gaccagtgta cgagcgcatg acctggttga cccgcggaaa 40<210>17<211>40<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>17ttggatggct gaagccctga gtacagggta gtcgtcagtg 40<210>18<211>49<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>18aggcctcaga tcctaaggcg tcgaaccact gacgactacc ctgtactca 49<210>19<211>46<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>19cgccttagga tctgaggcct cgagatgcca cgtggacgag ggcatg46<210>20<211>47<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>20gaccctcgtc cggaatagga tgtgctgtgg gcatgccctc gtccacg 47<210>21<211>50<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>21catcctattc cggacgaggg tcgcccggaa gaaagcggtt gtactaaccg50<210>22<211>43<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>22cctatcaggc cgtgtccata acggttagta caaccgcttt ctt 43<210>23<211>43<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>23accaccttaa cgtgacactg atactggtac tcggtcactg gtg 43<210>24<211>52<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>24ctcggggtac ctgaagggca tccttagtct gtcaccagtg accgagtacc ag 52
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<210>25<211>53<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>25cccttcaggt accccgaggt aacacgggac actcgggatc tgagaagggg att53<210>26<211>57<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>26catagaagct ttttaaattg gacactttta aagaagtccc aatccccttc tcagatc57<210>27<211>57<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>27ttctttaaaa gtgtccaatt taaaaagctt ctatgtctga ataggcgacc ggaggcc57<210>28<211>41<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>28tttagtagta ggtaatggaa aggcgccggc ctccggtcgc c 41<210>29<211>53<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>29ccctatcttt ttaggttcaa tgcattacga tataacttat gaagctctga aga53<210>30<211>67<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>30caattcatca tcgtaaacta tccgctgcgc attattcttc agagcttcat aagttatatc 60gtaatgc 67<210>31<211>63<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>31cagcggatag tttacgatga tgaattgcaa atgcatatac ttagaggacc gttacacttc 60cag 63<210>32<211>50<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>32
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9ttaacgcacc taatattgct cggcgctgga agtgtaacgg tcctctaagt50<210>33<211>51<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>33agaggcagcg gaaagaagtg aagatgaaat caaaatggta aaagagtata g 51<210>34<211>60<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>34cacttttaag cgcatcaatc ttctgtctat actcttttac cattttgatt tcatcttcac 60<210>35<211>54<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>35cagaagattg atgcgcttaa aagtgcgata gagattgagc gtgatggaat gcag 54<210>36<211>55<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>36gctgtcattc cagcgatctc ttgtatagcc tcttcctgca ttccatcacg ctcaa 55<210>37<211>54<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>37tacaagagat cgctggaatg acagcagacg tgctagaggc ggcatcagaa gaag 54<210>38<211>42<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>38cataccggca cctatcaaag gcacttcttc tgatgccgcc tc42<210>39<211>48<212>DNA<213>狂犬病毒<400>39atatcaggac agaacactgg caactataag acaaacattg cagatagg 48<210>40<211>59<212>DNA<213>狂犬病毒<400>40aataaaaggg gctgtctcaa aaatctgctc tatcctatct gcaatgtttg tcttatagt 59
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<210>41<211>59<212>DNA<213>狂犬病毒<400>41gatttttgag acagcccctt ttattaaaat cgtggagcac catactctaa tgacaactc 59<210>42<211>59<212>DNA<213>狂犬病毒<400>42tcggtatagt actccaatta gcacacattt tgtgagttgt cattagagta tggtgctcc 59<210>43<211>58<212>DNA<213>狂犬病毒<400>43gtgtgctaat tggagtacta taccgaattt cagatttttg gccggaacct acgacatg 58<210>44<211>47<212>DNA<213>狂犬病毒<400>44aatatagatg ctcaatccgg gagaaaaaca tgtcgtaggt tccggcc 47<210>45<211>47<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>45tgtgccggtg tcccctccca tctagccact gatactgaac tgaaaac 47<210>46<211>58<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>46cttctcactt gcatccatca taccaagaat cgttttcagt tcagtatcag tggctaga 58<210>47<211>54<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>47ggtatgatgg atgcaagtga gaagaccaat tatacctgtt gcaggctcca gcgc 54<210>48<211>50<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>48ccagttgcac cagccatgtt tgttccattc gtggcgctgg agcctgcaac50<210>49<211>56<212>DNA
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<213>牛腹瀉病毒<400>49catggctggt gcaactggtt taatatagaa ccttggcttc tcctaatgaa caaaac 56<210>50<211>49<212>DNA<213>牛腹瀉病毒<400>50gccctgggtc agattggcct gggttttgtt cattaggaga agccaaggt 49<210>51<211>48<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>51gatctcaacg accccggtaa gtacaaggag gccaaggaat ggctggac 48<210>52<211>57<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>52gtggacgttc ccgctcttca gacacgcttg gcgcgcgttg tccagccatt ccttggc57<210>53<211>55<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>53agagcgggaa cgtccacatt gccaacctgt gcaaagtggt tgctccagcg cccag 55<210>54<211>55<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>54gccgcgaaga cacacgacca ctggttcggg cctcgacttg ctgggcgctg gagca 55<210>55<211>57<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>55tcgtgtgtct tcgcggcaaa tccggccaag ggaagagttt cctcgcgaac gttctcg57<210>56<211>50<212>DNA<213>口蹄疫病毒<400>56ctgccagtga agtgggtgga gattgcctgt gcgagaacgt tcgcgaggaa50<210>57<211>47<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>57
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9ttcgcaggag tggttttggc tggtgcagct ctcggagtg caaccgc47<210>58<211>58<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>58tcattgactg atgaagggcg atccctgctg tgatctgggc tgcggttgca actccgag 58<210>59<211>60<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>59gatcgccctt catcagtcaa tgatgaattc ccaggccatc gaaagtctca aggcaagtct 60<210>60<211>49<212>DNA<213>牛瘟病毒<400>60tcctcaatcg cttgattggt tgttaccaga cttgccttga gactttcga 49<210>61<211>43<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>61atctttttag gttcaatgca ttacgatata acttatgaag ctc 43<210>62<211>56<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>62aactatccgc tgcgcattat tcttcagagc ttcataagtt atatcgtaat gcattg 56<210>63<211>58<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>63gaagaataat gcgcagcgga tagtttacga tgatgaattg caaatgcata tacttaga 58<210>64<211>56<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>64cgctggaagt gtaacggtcc tctaagtata tgcatttgca attcatcatc gtaaac 56<210>65<211>51<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>65gaccgttaca cttccagcgc cgagcaatat taggtgcgtt aaaattcgga g 51
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<210>66<211>43<212>DNA<213>牛蘭舌病毒<400>66cgcctaatat cttaactccg aattttaacg cacctaatat tgc 43<210>67<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67gtacaccaca gtaccgcga 19<210>68<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68gaccagtgta cgagcgca 18<210>69<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>69ttggatggct gaagccctg 19<210>70<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>70cctatcaggc cgtgtccata ac 22<210>71<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71ttcaggtacc ccgaggtaac a 21<210>72<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<223>引物<400>72atttagtagt aggtaatgga aaggcgc 27<210>73<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>73ccctatcttt ttaggttcaa tgcattacg 29<210>74<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74ttaacgcacc taatattgct cggc24<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>75agaggcagcg gaaagaagtg 20<210>76<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>76cataccggca cctatcaaag gc 22<210>77<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>77atatcaggac agaacactgg caac24<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>78
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9aatatagatg ctcaatccgg gaga24<210>79<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>79tgtgccggtg tcccct 16<210>80<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>80gccctgggtc agattggc 18<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>81gatctcaacg accccggtaa g 21<210>82<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>82ctgccagtga agtgggtgg 19<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>83ttcgcaggag tggttttggc 20<210>84<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>84tcctcaatcg cttgattggt tgt 23
檢測牛傳染病病毒的基因芯片、檢測方法、試劑盒8.9<210>85<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>85atctttttag gttcaatgca ttacgatata acttatg 37<210>86<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>86cgcctaatat cttaactccg aattttaacg 30<210>87<211>185<212>DNA<213>人工合成序列<400>87acagtcaata cccgctacgc gcgtctgagt tcaacttggt tgagccgtta aactgcattc 60agattcgcca gcttcggatt gctacagtgg gtcgatatct gagaacatca cgacgtcgat120atgggtcttt ctaccctcga ggtggcgcga tgaaggtttt tcatctactc agaccgctga180tccct185<210>88<211>183<212>DNA<213>?？醇一?amp;lt;400>88ctgaccctgc ttccttgtgt ccacaggaag ctcactggca tggccttccg cgtccccact 60cccaacgtgt ctgttgtgga tctgacctgc cgcctggaga aacctgtgag tttgggttgg120agcagcttcg atggcctgcg gggccagcgc gggggagttg caagactgga actcctgtga180cca 18權(quán)利要求
1.一種檢測牛傳染病病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，其特征在于芯片樣品點(diǎn)的布局為低密度布局，樣品點(diǎn)少于200個(gè)；所述的寡聚核苷酸檢測探針是從?？袢《?、牛腹瀉病毒、?？谔阋卟《尽⑴Ｎ敛《竞团Ｌm舌病毒中的至少一種病毒基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA或cDNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測牛傳染病病毒的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從牛狂犬病毒、牛腹瀉病毒、牛口蹄疫病毒、牛瘟病毒和牛蘭舌病毒基因組的核苷酸序列中對應(yīng)選取的DNA或cDNA片段。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測牛傳染病病毒的基因芯片，其特征在于所述的從?？袢《净蚪M的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO6所示的堿基序列；從牛腹瀉病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO2或SEQ ID NO7所示的堿基序列；從牛口蹄疫病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示的堿基序列；從牛瘟病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO4或SEQ ID NO9所示的堿基序列；從牛蘭舌病毒基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQ ID NO5或SEQ ID NO10所示的堿基序列。
4.制備權(quán)利要求1所述的檢測牛傳染病病毒的基因芯片的方法，其特征是包括以下的步驟(1)探針的設(shè)計(jì)根據(jù)所述的牛的五種病毒中的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對，選擇出種內(nèi)保守性高、種間特異性高的序列作為探針，它們分別具有如權(quán)利要求3所述的堿基序列；(2)探針的合成設(shè)計(jì)好的探針片段序列分割為寡聚核苷酸片段，人工合成上述的寡聚核苷酸片段，再將合成的寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)連接出所需要的目的探針片段；(3)芯片的制備包括切膜、貼膜，然后將上述得到的目的探針點(diǎn)膜，再經(jīng)烤膜、存膜即得芯片，其中點(diǎn)膜后得樣品點(diǎn)直徑在50μm-2000μm。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測牛傳染病病毒的基因芯片制備方法，其特征在于探針序列SEQ ID NO1分割成如SEQ ID NO11～NO16所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQID NO2分割成如SEQ ID NO17～NO22所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO3分割成如SEQ ID NO23～NO28所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO4分割成如SEQ ID NO29～NO32所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO5分割成如SEQ IDNO33～NO38所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO6分割成如SEQ ID NO39～NO44所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO7分割成如SEQ ID NO45～NO50所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO8分割成如SEQ ID NO51～NO56所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO9分割成如SEQ ID NO57～NO60所示的寡聚核苷酸片段，探針序列SEQ ID NO10分割成如SEQ ID NO61～NO66所示的寡聚核苷酸片段。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測牛傳染病病毒的基因芯片的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的合成的寡聚核苷酸片段進(jìn)行兩步PCR反應(yīng)的第二步PCR反應(yīng)的引物如下合成SEQ ID NO1～SEQ ID NO5探針?biāo)玫拿繉σ锓謩e為SEQ ID NO67和NO68、SEQ ID NO69和NO70、SEQ ID NO71和NO72、SEQ ID NO73和NO74、SEQ ID NO75和NO76所示的序列；合成SEQ ID NO6～NO10的探針?biāo)玫拿繉σ锓謩e為SEQ IDNO77和NO78、SEQ ID NO79和NO80、SEQ ID NO81和NO82、SEQ ID NO83和NO84、SEQ ID NO85和NO86所示的序列。
7.一種牛傳染病病毒的檢測方法，其特征是包括以下的步驟(1)待測樣本處理采用常規(guī)方法提取待測樣品的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記PCR擴(kuò)增；(2)雜交顯色；將步驟(1)得到的標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1所述的基因芯片進(jìn)行雜交，然后顯色；(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。
8.用于檢測牛傳染病病毒的試劑盒，其特征是包括權(quán)利要求1所述的基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交、顯色試劑和說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測牛傳染病病毒的基因芯片，其中基因芯片包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，寡聚核苷酸探針是從牛狂犬病毒、牛腹瀉病毒、?？谔阋卟《?、牛瘟病毒和牛蘭舌病毒的核苷酸序列中選取的DNA片段。本發(fā)明還涉及芯片的制備方法、利用上述的芯片檢測牛五種傳染病病毒的檢測方法，包括合成探針，制備芯片，與處理標(biāo)記好的待測樣品進(jìn)行雜交的過程。上述芯片和樣品處理試劑、雜交、顯色試劑、說明書組成牛傳染病病毒的檢測試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片可達(dá)到同時(shí)檢測五種病毒的目的，操作簡便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)，對于實(shí)驗(yàn)室研究和生產(chǎn)實(shí)踐都具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/70GK1958808SQ200610089239
公開日2007年5月9日 申請日期2006年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日
發(fā)明者周騁, 馬立人 申請人:北京愛普益生物科技有限公司