專利名稱：飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因與該蛋白的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因與該蛋白的表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
目前，飛蝗是我國乃至全世界范圍內(nèi)的重要害蟲。飛蝗之所以能形成蝗災(zāi)，在很大程度上是由于它的某些生物學(xué)行為，尤其是其聚集及遷飛行為，而飛蝗的聚集、遷飛等行為主要依賴于昆蟲的信息接受系統(tǒng)，尤其是感受化學(xué)信息的嗅覺系統(tǒng)。在嗅覺感受器淋巴液中有一大類小分子量可溶性蛋白的大量存在。這種可溶性蛋白包括兩大類氣味分子結(jié)合蛋白(Odorant-binding Proteins，OBPs)和化學(xué)感受蛋白(Chemosensory Proteins，CSPs)。化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)等電點(diǎn)低，分子量較小(12-20kDa)，可逆地結(jié)合氣味分子，與蝗蟲對(duì)信息素的接受密切相關(guān)。
通過常規(guī)的蛋白分離純化方法，主要為凝膠過濾層析、超濾、透析、離子交換層析等方法對(duì)CSPs進(jìn)行分離純化，盡管能夠得到比較純化的目的蛋白，但蛋白的損失量都較大，很難達(dá)到深入研究所需的蛋白量。因此建立一種高效大量表達(dá)蛋白的體系勢(shì)在必行。隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)可以通過異質(zhì)系統(tǒng)得到異源蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)昆蟲化學(xué)感受蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和生化特性等方面的研究成為可能，為探索昆蟲氣味感受機(jī)制提供可能。
國內(nèi)外都對(duì)蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)，尤其在昆蟲嗅覺傳導(dǎo)中起協(xié)同運(yùn)送外界化學(xué)信息物作用的化學(xué)感受蛋白的原核表達(dá)方法及其條件進(jìn)行了研究。但其表達(dá)量大約在10～20mg/L之間，且以包涵體的形式存在，需要利用超聲波破碎或較強(qiáng)的變性劑溶解蛋白，仍不能簡便快捷地為昆蟲嗅覺機(jī)理的研究提供高豐度蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的飛蝗化學(xué)感受蛋白，名稱為LmigCSP，來源于飛蝗(Locustamigratoria)，是具有序列表中的SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中SEQ ID №1的由109個(gè)氨基酸殘基組成，含有4個(gè)半胱氨殘基，以二硫鍵的形式順次連接，分子量約為12kDa，等電點(diǎn)為5.4。而且能夠與氣味分子(配基)結(jié)合。
上述飛蝗化學(xué)感受蛋白的基因(LmigCSP)，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由330個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)飛蝗化學(xué)感受蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)飛蝗化學(xué)感受蛋白的方法是將上述飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因插入原核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到飛蝗化學(xué)感受蛋白。
所述原核宿主優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)。
所述原核細(xì)胞表達(dá)載體有選為pET-5b。
所述含有飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體為將所述的飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因插入pET-5b的EcoRI和NdeI的識(shí)別位點(diǎn)間得到的飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因重組表達(dá)載體，名稱為pET-5b-LmigCSP。
本發(fā)明的飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因可作為蝗災(zāi)防治的潛在靶標(biāo)。本發(fā)明的表達(dá)方法在原有原核系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白的基礎(chǔ)上，從感受態(tài)細(xì)胞的制備條件入手，摸索出不同于原有表達(dá)系統(tǒng)所適用的條件，使重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到60mg/L，為飛蝗化學(xué)感受蛋白的純化和生理功能的深入研究提供充足蛋白量。本發(fā)明的表達(dá)方法簡單、成本低、省時(shí)，并且表達(dá)量高，可簡便快捷地為昆蟲嗅覺機(jī)理的研究提供高豐度蛋白。


圖1為LmigCSP表達(dá)流程圖。
圖2為pET-5b載體物理圖譜。
圖3為表達(dá)載體pET-5b-LmigCSP酶切鑒定電泳圖。
圖4為LmigCSP原核表達(dá)鑒定SDS-PAGE電泳圖。
圖5為LmigCSP蛋白的熒光特性。
圖6為LmigCSP蛋白在飛蝗化學(xué)感受器官中的分布圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因的獲得根據(jù)已知沙漠蝗中CSPsg4(accession no.AF070964)及飛蝗中OS-D2(accessionno.AJ251076)和OS-D5(accession no.AJ251079)的N端和C端序列設(shè)計(jì)兼并引物，設(shè)計(jì)如下引物CSPsg4(accession no.AF070964)正向引物5’-GAR GAR AAR TAY ACN AC-3’反向引物5’-YTG RTG NAG YTC YTT YTC-3’；OS-D2(accession no.AJ251076)正向引物5’-GCN GCN GCN TAY ACN AC-3’反向引物5’-NGC NCT NAG NAG YTC NGG-3’；OS-D5(accession no.AJ251079)正向引物5’-GCN GCN GCN TAY ACN AC-3’反向引物5’-NGC NCT NAC YCT YTT NAG-3’。
其中，R為A或G，Y為T或C，N為A或T或C或G，以飛蝗(Locusta migratoria)觸角為材料，用Trizol提取總RNA，經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性。單鏈cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成單鏈cDNA。將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應(yīng)的模板20μl體系，內(nèi)含10×PCR緩沖液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μM的正向引物和反向引物各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。在PE 9700儀上擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min 30sec，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸4min，將獲得的PCR產(chǎn)物，作1％瓊脂糖凝膠電泳。將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T，測(cè)序，結(jié)果表明得到的PCR產(chǎn)物具有SEQ ID №2的DNA序列，其編碼具有SEQ ID №1的氨基酸序列的蛋白，即飛蝗化學(xué)感受蛋白LmigCSP。將得到的含有LmigCSP基因的pGEM-T載體，命名為pGEM-T-LmigCSP。
實(shí)施例2、飛蝗化學(xué)感受蛋白的表達(dá)1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的篩選以上述pGEM-T-LmigCSP為模板，引物為5’端5’-TACATATG GCT GCT GCG TAC ACC ACC-3’3‘端5’-AATTGAATTC TTA TTA CGC GGA GAC CCT CTT GA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到LmigCSP基因的PCR產(chǎn)物。將得到的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-5b(圖2，購自Novagen，Darmstadt，Germany)分別用NdeI、EcoRI酶切后，在室溫下連接10小時(shí)，將得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，具體方法如下加1μL連接產(chǎn)物于100μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃水浴熱激90s，立即置冰上5min。加入400μL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)60min。涂布LB/agar平板(含有100μg/mL氨芐青霉素，20μg/mL X-gal和IPTG)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時(shí)。挑取單菌落提質(zhì)粒，利用NdeI、EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明得到330bp的LmigCSP基因片段，將含有該LmigCSP基因片段的質(zhì)粒命名為pET-5b-LmigCSP。圖3中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為pET-5b-LmigCSP用NdeI、EcoRI酶切的片段。將含有pET-5b-LmigCSP的大腸桿菌BL21(DE3)作為表達(dá)LmigCSP的工程菌。
其中，大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞按如下方法制備將大腸桿菌BL21(DE3)在37℃培養(yǎng)到OD600為0.4～0.6時(shí)，離心，棄上清，將沉淀用0.1M CaCl2溶解。再次離心，棄上清，用0.1M CaCl2再次溶解沉淀，分裝，0.1ml/管，-70℃貯存?zhèn)溆谩?br> 2、飛蝗化學(xué)感受蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取步驟1中的表達(dá)LmigCSP的工程菌pET-5b-LmigCSP單菌落在LB培養(yǎng)液中大量培養(yǎng)，在OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入IPTG(以未加入IPTG誘導(dǎo)的pET-5b-LmigCSP作為對(duì)照)，其終濃度為0.2umol/L，25～28℃培養(yǎng)3小時(shí)。分別取200ul誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，離心后得到沉淀，用30ul SDS-PAGE樣品緩沖液溶解沉淀，100℃沸水浴3-5min(這一步的作用是使蛋白質(zhì)變性，與SDS結(jié)合形成帶有負(fù)電荷的橢圓形體，使蛋白質(zhì)的遷移率僅與分子量有關(guān))，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示，得到12kDa的條帶，與LmigCSP的大小一致，表明得到了LmigCSP。圖4中泳道EX為pET-5b-LmigCSP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；泳道CK(對(duì)照)pET-5b-LmigCSP未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；泳道Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下為BSA(66kDa)，ovalbumin(45kDa)，carbonic anhydrase(29kDa)，trypsin inhibitor(20kDa)，和lactalbumin(14kDa)。
3、重組蛋白的裂解純化以上誘導(dǎo)表達(dá)所得到的沉淀(大腸桿菌)，每克沉淀(濕重)加入3ml裂解緩沖液(10mmol/L Tris，8mol/L Urea)，1mM PMSF在37℃重懸沉淀，取上清，將沉淀進(jìn)一步進(jìn)行超聲波破碎(500w，50次，每次超聲4s/間隔8s)(得到的蛋白不再以包涵體的形式存在，而是溶解在上清夜中)。用Superose-12及Mono-Q分離純化上清。將得到的上清液進(jìn)行15％SDS-PAGE，將得到的電泳圖譜進(jìn)行掃描后利用Image Master軟件分析計(jì)算得到飛蝗化學(xué)感受蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明所得到的飛蝗化學(xué)感受蛋白的表達(dá)量為60mg/ml。
將按照步驟1中的方法制備的表達(dá)LmigCSP的工程菌和除熱激擊轉(zhuǎn)化條件為42℃熱激120s外，按照步驟1中的方法制備的表達(dá)LmigCSP的工程菌，分別按照表1的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以比較步驟2的表達(dá)方法和傳統(tǒng)表達(dá)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯)的差異，結(jié)果表明本發(fā)明的表達(dá)方法大幅度增加了LmigCSP表達(dá)量，使得LmigCSP的表達(dá)量提高至傳統(tǒng)方法的4-6倍。
表1.本發(fā)明的表達(dá)方法與傳統(tǒng)表達(dá)方法的比較

實(shí)施例3、飛蝗化學(xué)感受蛋白的功能驗(yàn)證1、熒光檢測(cè)和結(jié)合實(shí)驗(yàn)在25℃用Jasco FP-750熒光色譜儀記錄熒光發(fā)射光譜。所用的容器為1cm寬的石英杯，壁厚5nm。實(shí)施例2表達(dá)的LmigCSP蛋白用pH為7.4的50mM Tris-HCl溶解，使其終濃度為5μmol/L。從翅中提取的內(nèi)源性配基油酸酰氨(oleoamide)溶于1mM的甲醇溶液中，濃度為2μM遞增到20μM。在295nm激發(fā)1μM實(shí)施例2表達(dá)的LmigCSP，在300-360nm發(fā)射光譜處測(cè)定實(shí)施例2表達(dá)的LmigCSP中色氨酸的熒光強(qiáng)度。在油酸酰氨(oleoamide)濃度為4-20μM時(shí)測(cè)定色氨酸的熒光的猝滅。熒光檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，295nm激發(fā)蛋白時(shí)，在330nm發(fā)射光譜處產(chǎn)生熒光峰值，這表明色氨酸(Trp)存在于蛋白內(nèi)部疏水環(huán)境中(曲線A)。油酸酰氨(oleoamide)濃度為4μM(曲線B)和20μM(曲線C)時(shí)，蛋白內(nèi)部色氨酸所發(fā)熒光被猝滅，表明油酸酰氨(oleoamide)結(jié)合于蛋白內(nèi)部。說明LmigCSP結(jié)構(gòu)中有疏水性的內(nèi)部環(huán)境，能夠與內(nèi)源性配基油酸酰氨(oleoamide)結(jié)合，說明其是感受蛋白。
2、飛蝗化學(xué)感受蛋白在飛蝗化學(xué)感受器官中的分布收集飛蝗的9種化學(xué)感受器官觸角、跗節(jié)、產(chǎn)卵器、生殖器、上唇、下唇、下唇須、下顎須，提取蛋白。利用實(shí)施例2中步驟3得到的LmigCSP作為抗原免疫大白兔得到抗血清，進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)，明確LmigCSP在9種化學(xué)感受器官中的分布，如圖6。LmigCSP在9種化學(xué)感受器官中均有分布，這種分布特點(diǎn)是表明LmigCSP的感受功能。
序列表1<160>2<210>1<211>109<212>PRT<213>飛蝗(Locusta migratoria)<400>2Ala Ala Ala Tyr Thr Thr Lys Tyr Asp Asn Ile Asp Leu Asp Asp Val1 5 10 15Leu His Asn Asp Arg Leu Leu Lys Lys Tyr His Glu Cys Leu Leu Ser20 25 30Asp Ser Asp Ala Ser Cys Thr Pro Asp Gly Lys Glu Leu Lys Ala Ala35 40 45Ile Pro Asp Ala Leu Thr Asn Glu Cys Ala Gln Cys Asn Glu Lys Gln50 55 60Lys Ala Gly Ala Glu Lys Val Ile Lys Phe Leu Ile Lys Glu Lys Pro65 70 75 80Asp Leu Trp Glu Pro Leu Glu Lys Lys Tyr Asp Pro Thr Gly Ser Phe85 90 95Arg Gln Lys Tyr Asp Gln Glu Leu Lys Arg Val Ser Ala100 105<210>2<211>330<212>cDNA<213>飛蝗(Locusta migratoria)<400>2gctgctgcgt acaccaccaa gtacgacaac atcgacctgg acgacgtact gcacaacgac 60
cgcctgctca agaagtacca cgagtgcctc ctgtccgaca gcgacgcttc ctgcacccca 120gacgggaagg agctcaaggc cgccattcct gatgcgctca ccaacgagtg cgcccagtgc 180aacgagaagc agaaggcggg agcggagaag gtgatcaagt tcctcatcaa ggagaagccc 240gacctgtggg agcctctaga gaagaagtac gaccccactg gcagcttcag gcagaagtac 300gaccaggagc tcaagagggt ctccgcgtaa。 330
權(quán)利要求
1.飛蝗化學(xué)感受蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述飛蝗化學(xué)感受蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述的飛蝗化學(xué)感受蛋白的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的飛蝗化學(xué)感受蛋白的原核表達(dá)方法，是將飛蝗化學(xué)感受蛋白的編碼基因插入到原核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到飛蝗化學(xué)感受蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的制備化學(xué)感受蛋白的方法，其特征在于所述原核宿主為大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET-5b。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述含有飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體為pET-5b-LmigCSP；所述的pET-5b-LmigCSP是將所述飛蝗化學(xué)感受蛋白編碼基因插入pET-5b的EcoRI和NdeI的識(shí)別位點(diǎn)間得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法中用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所述IPTG的濃度為0.2umol/L，誘導(dǎo)溫度為25～28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為1～3小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因與該蛋白的表達(dá)方法。本發(fā)明所提供的飛蝗化學(xué)感受蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)序列表中的SEQ ID №1，具有四個(gè)保守的半胱氨酸，以二硫鍵的形式順次連接。本發(fā)明的飛蝗化學(xué)感受蛋白及其編碼基因可作為蝗災(zāi)防治的潛在靶標(biāo)。本發(fā)明表達(dá)飛蝗化學(xué)感受蛋白的方法簡單、成本低、省時(shí)，并且表達(dá)量高，可簡便快捷地為昆蟲嗅覺機(jī)理的研究提供高豐度蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1884534SQ20061008937
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日
發(fā)明者于艷雪, 張龍, 班麗萍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)