專利名稱：一種生產(chǎn)γ－氨基丁酸的方法及其專用反應(yīng)柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法及其專用反應(yīng)柱。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是一種天然活性成分，它不是組成蛋白質(zhì)的常見氨基酸，故被稱為非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動植物體內(nèi)。目前研究已經(jīng)證明GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)，它是腦組織中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起作用，參與腦循環(huán)生理活動。此外γ-氨基丁酸還具有降血壓，防止動脈硬化，調(diào)節(jié)心律失常，防止皮膚老化等眾多作用。雖然GABA可由腦部的谷氨酸在專一性較強的谷氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化而成，但是年齡的增長和精神壓力的加大等諸多因素使GABA的積累異常困難，而通過日常飲食補充可有效改善這種狀況，從而促進人體健康。
化學(xué)方法合成γ-氨基丁酸容易產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，且不益用于食品和藥品。目前γ-氨基丁酸的合成方法除化學(xué)方法外，主要利用微生物或微生物所產(chǎn)生的谷氨酸脫羧酶進行生物轉(zhuǎn)化。在利用微生物轉(zhuǎn)化方面，常用乳酸菌屬、大腸桿菌屬及部分植物乳桿菌作為微生物菌種進行轉(zhuǎn)化，但是微生物轉(zhuǎn)化需要額外消耗培養(yǎng)、維持微生物生長的培養(yǎng)基等物質(zhì)，此外微生物個體不能反復(fù)利用，效率低下也是成為轉(zhuǎn)化成本升高的一個主要因素。


圖1為生產(chǎn)γ-氨基丁酸的反應(yīng)柱的縱切面示意圖。
圖2為γ-氨基丁酸的生產(chǎn)流程示意圖發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法及其專用反應(yīng)柱。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)γ-氨基丁酸的反應(yīng)柱，包括螺旋狀柵板，所述螺旋狀柵板上設(shè)有固定化酶槽。
所述反應(yīng)柱還包括外殼，所述螺旋狀柵板位于外殼內(nèi)。
所述螺旋狀柵板外緣可設(shè)有擋板。
所述反應(yīng)柱還可包括中心支持柱，所述中心支持柱位于所述螺旋狀柵板的中心軸線上。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，是將可表達谷氨酸脫羧酶的菌體破碎，用海藻酸鈉固定化，形成固定化的谷氨酸脫羧酶，使固定化的谷氨酸脫羧酶和谷氨酸或谷氨酸鹽在上述反應(yīng)柱中進行酶催化反應(yīng)，得到γ-氨基丁酸。
所述方法中，所述谷氨酸鹽為谷氨酸鈉。
所述可表達谷氨酸脫羧酶的菌株先在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再進行破碎；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基含有質(zhì)量百分含量為0.5％的谷氨酸鈉，0.01-0.05mmol/L的維生素B6。
所述固定化的谷氨酸脫羧酶可按照如下方法獲得將可表達谷氨酸脫羧酶的菌株如大腸桿菌CICC 10003接種于活化培養(yǎng)基中(液體)，30℃培養(yǎng)10-12小時，共活化2次，然后以0.5-2％的體積比接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20-24小時，離心收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次，超聲破碎(超聲功率為300W，30次，每5秒間隔10秒)。破碎后的菌體用pH4.6-4.7的醋酸鹽緩沖液懸浮(每5-10g濕菌體加100ml緩沖液)，懸浮好后另加入2-3％的海藻酸鈉，攪拌均勻，4℃冰箱靜置1小時除氣泡，除氣后混合液用注射器7號針頭滴入0.1mol/L CaCl2中，4℃冰箱靜置過夜得到固定化酶。所述活化培養(yǎng)基為含有牛肉膏1％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，葡萄糖1％，瓊脂粉1.5-2.0％(固體培養(yǎng)基中)，pH7.0。所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含有蛋白胨1％，氯化鈉1％，酵母膏0.5％，谷氨酸鈉0.5％，維生素B6(0.01-0.05mmol/L)的溶液。上述百分含量為質(zhì)量百分含量。
所述方法中還包括對得到的γ-氨基丁酸采用陽離子交換柱吸附純化、活性碳脫色、真空濃縮和重結(jié)晶的純化步驟。
所述陽離子交換柱吸附純化是進行陽離子交換樹脂吸附GABA后，用1倍到1.5倍柱體積的0.2-2mol/L氨水對吸附的GABA進行洗脫，氨水濃度優(yōu)選為0.2mol/L。
所述真空濃縮可將上述陽離子交換柱吸附純化后的洗脫液在40℃真空度0.095MPa下濃縮后，去除氨水，再于50-65℃真空度0.095MPa下濃縮，直到濃度達到結(jié)晶濃度。
所述方法中，反應(yīng)結(jié)束后的固定化的谷氨酸脫羧酶可用磷酸吡哆醛再生溶液再生；所述再生溶液為pH4.6，含0.05mol/L CaCl2，0.01-0.05m mol磷酸吡哆醛，1-2.5mmol/LGlu或谷氨酸鈉的溶液。
本發(fā)明選用高產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的優(yōu)秀菌種，通過對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，達到菌種最大程度生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶；通過固定化谷氨酸脫羧酶和酶的磷酸吡哆醛再生，使谷氨酸脫羧酶可以穩(wěn)定的反復(fù)用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸；通過專用反應(yīng)柱基本上解決了在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的二氧化碳氣體的問題，并形成了連續(xù)轉(zhuǎn)化的過程；最后通過純化處理工藝使得整個轉(zhuǎn)化可以達到最大產(chǎn)量和高純度的γ-氨基丁酸。此外，因為整個過程是利用具有生物活性的酶，只需提供合適的緩沖條件，轉(zhuǎn)化體系中參加反應(yīng)的物質(zhì)簡單，副產(chǎn)物少，無有害物質(zhì)存在，后期處理方便，不存在活菌問題，作為食品、藥品的原材料安全、可靠。底物轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)液中產(chǎn)物的濃度高，便于后期的分離、純化。固定化的酶通過酶再生技術(shù)可以反復(fù)利用節(jié)約成本，反應(yīng)的溶液在經(jīng)過離子交換柱吸附γ-氨基丁酸后依然可以回收利用，而真空蒸發(fā)所得的溶液也可反復(fù)利用，整個工藝流程消耗的物質(zhì)和能量少，產(chǎn)生的廢棄物少，有利于環(huán)保。而且本發(fā)明生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法中酶的轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的分離純化是一個連續(xù)的不間斷的過程。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、固定化酶法反應(yīng)生產(chǎn)γ-氨基丁酸大腸桿菌CICC 10003購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center ofIndustrial Culture Collection，CICC)。在瓊脂斜面保存培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱保存，每3個月傳代一次。
保存培養(yǎng)基或活化培養(yǎng)基(CICC29#培養(yǎng)基)牛肉膏1％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，葡萄糖1％，瓊脂粉1.5-2.0％(固體培養(yǎng)基中)，調(diào)節(jié)pH7.0。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨1％，氯化鈉1％，酵母膏0.5％，谷氨酸鈉0.5％，維生素B6(0.01-0.05mmol/L)。
固定化酶再生溶液pH4.6，含0.05mol/L CaCl2，0.01-0.05mM磷酸吡哆醛，1-2.5mm/L谷氨酸鈉。
一、γ-氨基丁酸的生產(chǎn)生產(chǎn)工藝流程如下菌種培養(yǎng)—超聲破碎—酶固定化—酶解反應(yīng)—離子交換—碳粒脫色—過濾—真空濃縮—結(jié)晶沉淀—分離—烘干—成品1、固定化谷氨酸脫羧酶的生產(chǎn)將大腸桿菌CICC 10003接種于活化培養(yǎng)基中(液體)，30℃培養(yǎng)10小時，共活化2次，然后按1％的體積比接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20小時，離心收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次，用pH4.7的醋酸鈉緩沖液懸浮(每5g濕菌體加100ml緩沖液)超聲破碎(參數(shù)為超聲功率為300W，30次，每5秒間隔10秒)。破碎后另加入2％的海藻酸鈉，攪拌均勻，4℃冰箱靜置1小時除氣泡。除氣后混合液用注射器7號針頭滴入0.1mol/L CaCl2中，4℃冰箱靜置過夜得到固定化谷氨酸脫羧酶。
2、反應(yīng)柱的制備反應(yīng)柱縱切面示意圖如圖1所示；該反應(yīng)柱設(shè)有外殼4，外殼4內(nèi)部有螺旋狀柵板1，螺旋狀柵板1上設(shè)有固定化酶槽，螺旋狀柵板1外緣設(shè)有擋板2，中心支持柱3位于螺旋狀柵板1中心軸線。其中圖1中所示箭頭為反應(yīng)液流的方向，固定化酶槽用于放置酶珠，擋板2防止酶珠流出。
反應(yīng)柱的設(shè)計基本上解決了在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的二氧化碳氣體的問題，并形成了連續(xù)轉(zhuǎn)化的過程。反應(yīng)液自反應(yīng)柱上端流入后反復(fù)與置于固定化酶槽中的酶珠進行反應(yīng)，反應(yīng)生成的二氧化碳氣體通過帶有柵格的柱的空腔自行排除，解決了在普通柱反應(yīng)中，反應(yīng)生產(chǎn)的二氧化碳無法排除的問題；此外，罐式反應(yīng)器反應(yīng)不能實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，一批原料需在反應(yīng)罐中反應(yīng)完全后才能進入到下一道工序，而該反應(yīng)柱中，反應(yīng)液逐步自上而下的轉(zhuǎn)化，從下端流出的反應(yīng)液直接進入到后續(xù)離子交換柱等工藝步驟，而與此同時柱上端又在轉(zhuǎn)化新的反應(yīng)液，即實現(xiàn)了連續(xù)化的生產(chǎn)。即用柱反應(yīng)器實現(xiàn)了連續(xù)化生產(chǎn)，又通過柱內(nèi)特定的柵格結(jié)構(gòu)解決了反應(yīng)中產(chǎn)生的二氧化碳難以排除反應(yīng)柱的問題是本發(fā)明的重要特色之一。
3、γ-氨基丁酸的生產(chǎn)生產(chǎn)流程示意圖如圖2所示，圖中5為單向泵，6為閥門，具體生產(chǎn)步驟如下將步驟1)得到的固定化谷氨酸脫羧酶(酶珠)裝入反應(yīng)柱中固定化酶槽內(nèi)，從反應(yīng)柱頂端泵入底物液(含有5％谷氨酸鈉的水溶液pH4.6-4.7)，反應(yīng)柱外通37℃循環(huán)水保溫進行反應(yīng)。
反應(yīng)柱排出的液體(反應(yīng)液)進入到陽離子交換柱中(采用強酸性陽離子交換樹脂001*7(732))進行純化。具體方法如下取樹脂，浸濕，用1mol/L HCl浸泡10-15分鐘，蒸餾水清洗至中性后，用1mol/L NaOH浸泡10-15分鐘，再用蒸餾水清洗至中性后裝柱，用1到1.5倍體積的1mol/L HCl過柱，蒸餾水清洗至中性后吸附反應(yīng)生成的γ-氨基丁酸，過柱液回收再次利用。用1倍柱體積的2mol/L氨水洗脫，收集洗脫液按1％體積加入提前處理好的活性碳粒并攪拌1h，過濾。
4、真空濃縮將步驟3得到的過濾液在40℃真空度0.095MPa下先濃縮(主要蒸發(fā)的是氨水)，再于50-65℃真空度0.095MPa下先濃縮(主要蒸發(fā)的是水)，當濃度達到結(jié)晶濃度時即停止。濃縮液經(jīng)結(jié)晶干燥后可得γ-氨基丁酸的純品。經(jīng)計算，γ-氨基丁酸的產(chǎn)率為0.5795g γ-氨基丁酸/g谷氨酸鈉。
反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)柱固定化酶可用再生液浸泡，使谷氨酸脫羧酶可以穩(wěn)定的反復(fù)用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸。
二、上述γ-氨基丁酸的檢測將步驟一得到的γ-氨基丁酸采用高效液相色譜法檢測其純度，色譜柱為Hypersil ODS C18柱(125mm×4.0mm，5μm)，流動相A為20mmol/L乙酸鈉+0.02％三乙胺(pH7.3)；流動相B為100mmol/L乙酸鈉(pH 7.2)∶乙腈∶甲醇(100∶175∶225)梯度洗脫；檢測波長為338nm。衍生劑配制為OPA衍生試劑(取鄰苯二甲醛(OPA)20mg，加3-巰基丙酸(3-MPA)20μl和乙腈5ml制成OPA衍生劑)和硼酸緩沖液(0.4mol/L，pH值為10.4)。
精密量取硼酸緩沖液100μL，OPA衍生劑20μL和供試液(0.05g步驟一得到的γ-氨基丁酸，用100ml去離子水溶解)20μL混合反應(yīng)5min后，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，通過建立的標準曲線獲得供試液中γ-氨基丁酸的含量。
結(jié)果表明，供試液(0.05g步驟一得到的γ-氨基丁酸)含有0.0475gγ-氨基丁酸，表明步驟一得到的γ-氨基丁酸的純度為95％。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的反應(yīng)柱，包括螺旋狀柵板，所述螺旋狀柵板上設(shè)有固定化酶槽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)柱，其特征在于所述反應(yīng)柱還包括外殼，所述螺旋狀柵板位于外殼內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反應(yīng)柱，其特征在于所述螺旋狀柵板外緣設(shè)有擋板。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反應(yīng)柱，其特征在于所述反應(yīng)柱還包括中心支持柱，所述中心支持柱位于所述螺旋狀柵板的中心軸線上。
5.一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，是將可表達谷氨酸脫羧酶的菌體破碎，用海藻酸鈉固定化，形成固定化的谷氨酸脫羧酶，使固定化的谷氨酸脫羧酶和谷氨酸或谷氨酸鹽在權(quán)利要求1-4中任一所述反應(yīng)柱中進行酶催化反應(yīng)，得到γ-氨基丁酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述谷氨酸鹽為谷氨酸鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括對得到的γ-氨基丁酸采用陽離子交換柱吸附純化、活性碳脫色、真空濃縮和重結(jié)晶的純化步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述陽離子交換柱吸附純化是用強酸性陽離子交換樹脂001*7(732)吸附反應(yīng)生成的γ-氨基丁酸，用1倍到1.5倍柱體積的0.2-2mol/L氨水洗脫；所述氨水濃度優(yōu)選為0.2mol/L；所述真空濃縮是將權(quán)利要求6所述陽離子交換柱吸附純化后的洗脫液在40℃真空度0.095MPa下濃縮后，去除氨水，再于50-65℃真空度0.095MPa下濃縮，直到濃度達到結(jié)晶濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述可表達谷氨酸脫羧酶的菌先在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進行破碎；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基含有質(zhì)量百分含量為0.5％的谷氨酸鈉，0.01-0.05mmol/L維生素B6。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述固定化的谷氨酸脫羧酶用磷酸吡哆醛再生溶液再生；所述再生溶液為pH4.6，含0.05M/L CaCl2，0.01-0.05mM磷酸吡哆醛，1-2.5mmol/L谷氨酸或谷氨酸鈉的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)γ－氨基丁酸的方法。該方法，是將可表達谷氨酸脫羧酶的菌體破碎，用海藻酸鈉固定化，形成固定化的谷氨酸脫羧酶，使固定化的谷氨酸脫羧酶和谷氨酸或谷氨酸鹽在反應(yīng)柱中進行酶催化反應(yīng)，得到γ－氨基丁酸。本發(fā)明的方法利用具有生物活性的酶，只需提供合適的緩沖條件，轉(zhuǎn)化體系中物質(zhì)少，副產(chǎn)物少，無有害物質(zhì)存在，作為食品、藥品的原材料安全、可靠。整個工藝流程消耗的物質(zhì)和能量少，產(chǎn)生的廢棄物少，有利于環(huán)保。
文檔編號C12P13/00GK1896259SQ20061008948
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者孫君社, 喬春楠, 劉萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)