專利名稱：：一種生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的電化學(xué)生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。背豕技術(shù)電化學(xué)生物傳感器是迅速發(fā)展中的前沿分析技術(shù)，其以結(jié)構(gòu)靈巧、成本較低和靈敏、快速的原位分析監(jiān)測為特色而廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理、醫(yī)療、材料、環(huán)保、食品和工業(yè)過程自動控制等領(lǐng)域。用酶的天然電子傳遞體——氧來溝通酶與電極之間的電子通道，直接檢測酶反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的生成的傳感器，稱為第一代電化學(xué)生物傳感器。這類傳感器已有產(chǎn)品面市，但它有許多缺點如電極對溶液中氧含量、氧的擴(kuò)散速度及濃度梯度等依賴性較大，因此檢測易受環(huán)境中氧分壓波動的影響；電極響應(yīng)時間較長且難以進(jìn)行活體分析；此外該傳感器的靈敏度也不太高。由于直接測定氧含量存在上述弊端，于是人們又選擇了直接測定反應(yīng)產(chǎn)物H202的含量，但是在金屬或碳電極上11202直接氧化的電極電位均較高，一般在+0.6+0.8V(vs.Ag/AgCl)。在這樣高的電極電位下，共存于被測樣品中的其他電化學(xué)活性物質(zhì)(如抗壞血酸、尿酸、乙酰氨基酚等)也能夠同時被氧化，從而產(chǎn)生干擾電流。為了克服第一代電化學(xué)生物傳感器的局限性，電子媒介體被用來替代氧作為電子受體，起到在酶與電極之間進(jìn)行電子傳輸?shù)淖饔?。這種采用電子媒介體代替氧的傳感器稱為第二代電化學(xué)生物傳感器。電子媒介體的引入大大降低了反應(yīng)電位，從而提高了生物傳感器的靈敏度和抗干擾能力。常用的電子媒介體有二茂鐵及其衍生物、四硫富瓦烯及各種有電化學(xué)行為的染料等。電子媒介體大多是加在被測溶液中，但這種方法媒介體消耗量大，測定過程也極不方便，因此人們采用多種方法把媒介體固定在電極上。但是，大多數(shù)媒介體易溶于水，在反應(yīng)過程中容易從電極上泄漏出來。層狀無機(jī)化合物層間離子具有可交換性，可被用作電子媒介體的固定化。在文獻(xiàn)(l)FreseniusJAnalChem，19訴，361:115中，Y油gFeng等人成功地把甲苯胺藍(lán)插入到O"磷酸鋯中，并以此為電子媒介體制備了辣根過氧化酶生物傳感器。用這種方法固定化的甲苯胺藍(lán)在電極表面實現(xiàn)了可逆的氧化還原反應(yīng)，循環(huán)伏安和計時安培實驗證明甲苯胺藍(lán)在層間具有良好的穩(wěn)定性并有效實現(xiàn)了辣根過氧化酶和電極之間的電子轉(zhuǎn)移。制得的電化學(xué)生物傳感器對過氧化氫的最低檢測限為3.0xlO^M。但該傳感器的檢測電位為-0.25Vvs.SCE(相當(dāng)于-0.23Vvs.Ag/AgCl)，而一般認(rèn)為電化學(xué)生物傳感器的檢測電位在-0.10Vvs,Ag/Aga時干擾最??；此外該傳感器的穩(wěn)定性只能保持兩周左右，而且沒有進(jìn)行抗干擾實驗。在文獻(xiàn)(2)AnalChimActa,2004，523:89中，AngelicaM.Lazarin等人把亞甲基藍(lán)插入到磷酸鋇層間，然后把這種插層化合物加入到碳糊電極中，并以此電極研究還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NADH)的電化學(xué)氧化反應(yīng)。該電極對NADH的響應(yīng)電位只有-0.08V(vs.SCE)，對NADH的最低檢測限為3.9xl(^M,但這種材料沒有應(yīng)用于生物傳感器的制作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用層狀二氧化錳剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料，并將其引入到電化學(xué)生物傳感器敏感膜中，提供一種含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料的生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料修飾的電極對底物的檢測電位接近OVvs.Ag/AgCl，可以有效降低溶液中電化學(xué)活性物質(zhì)的干擾(一般認(rèn)為電化學(xué)生物傳感器的檢測電位在-0.10Vvs.Ag/AgCl時干擾最小)；亞甲基藍(lán)位于二氧化錳層間并得到有效固定，避免了測試過程中電子媒介體的流失；二氧化錳具有良好導(dǎo)電性，有利于測試過程中電子傳遞，可以提高電化學(xué)生物傳感器信號響應(yīng)的靈敏度；二氧化錳比表面積大且表面帶負(fù)電荷，可與帶正電荷的陽離子型生物相容性聚合物通過靜電作用結(jié)合，而陽離子型生物相容性聚合物中的大量氫鍵可以進(jìn)一步穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象，給酶提供生物相容性良好的微環(huán)境，從而提高酶存活的長期性及酶功能膜的穩(wěn)定性。因此本發(fā)明提供的含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料的酶功能敏感膜可提高電化學(xué)生物傳感器的綜合性能。本發(fā)明提供的含有亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的生物傳感器復(fù)合酶功能敏感膜是由亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料、生物活性物質(zhì)、陽離子型生物相容性聚合物和高分子成膜物質(zhì)組成。該復(fù)合膜各成分的含量分別是亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料為0.0020.2mg/cm2，生物活性物質(zhì)為0.15.0mg/cm2,陽離子型生物相容性聚合物為0.052.0mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。所述的亞甲基藍(lán)插層二氧化錳具有超分子插層結(jié)構(gòu)(見圖l)，層間距為1.4mn;所述生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細(xì)胞色素C中的一種；所述陽離子型生物相容性聚合物是陽離子纖維素和陽離子瓜爾膠中的-種所述高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、殼聚糖(Chitosan)中的—種。本發(fā)明含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的復(fù)合酶功能敏感膜的制備方法是A采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.按OH'與Mn"摩爾比為3:l4:l，11202與Mn"摩爾比為6:18:1，將含有0.60.8mol/LNaOH和1.01.5mol/L11202的混合溶液快速加入到0.30.4mol/L的Mn(N03)2溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)2030分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，按OIT與Mn02摩爾比為2:14:1且裝滿度40%，加入濃度為23mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在150160'C水熱處理1520小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為89，將濾餅在7080'C空氣氣氛中干燥69小時，得到層狀二氧化錳；A-2.按照H+與層狀二氧化錳摩爾比為10:115:1，將上述層狀二氧化錠固體粉末加入濃度為1.01.5mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)35天，其間每隔24小時更換一次新的1.01.5mol/LHNO3溶液，將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為67，將濾餅在7080'C空氣氣氛中干燥6~9小時，得到氫交換的二氧化鈸；A-3.按四甲基氫氧化銨與二氧化錳摩爾比為2:14:1，將上述氫交換的二氧化錳加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%2.0%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)710天，將混合液在1000012000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心510分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在0.12.0mg/mL;A4.按亞甲基藍(lán)與剝層二氧化錳的摩爾比為1:51:15,將2.010.0mg/mL的亞甲基藍(lán)溶液與上述剝層二氧化銩溶膠混合，3070卩攪拌反應(yīng)1830小時，過濾，分別用去離子水和丙酮洗滌沉淀至濾液無色，然后在40801C空氣氣氛中干燥915小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳。B.含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的復(fù)合酶功能敏感膜的制備B-l.將亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料配成0.11.0mg/mL的乙醇分散液，按0.52.0ML/mm2的用量將該溶液滴涂在潔凈的固體電極表面，在室溫下干燥1020小時；B-2.將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%~2.0%的陽離子型生物相容性聚合物的水溶液與濃度為1100mg/mL的生物活性物質(zhì)的二次蒸餾水溶液按體積比為1:14:1的比例混合均勻，按0.52.0^/皿!12的用量將混合液滴涂在上述亞甲基藍(lán)插層二氧化鈸修飾的電極表面，在28'C冷凍干燥1030小時，干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55.0。/o的高分子成膜物質(zhì)的溶液中保持120分鐘，用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，在28r冰箱中放置1030小時使溶劑全部揮發(fā)，即在電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜。所述生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細(xì)胞色素C中的一種；所述陽離子型生物相容性聚合物是陽離子纖維素和陽離子瓜爾膠中的一種；所述高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、殼聚糖(Chitosan)中的一種。上述的高分子成膜物質(zhì)溶液中，聚乙烯醇縮丁醛、全氟磺酸聚合物的溶劑為無水乙醇，殼聚糖的溶劑為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.52%的醋酸二次蒸餾水溶液；固體電極為玻碳電極、鉑盤電極和金盤電極中的一種。本發(fā)明的效果可以從利用本發(fā)明提供的酶膜制做的電化學(xué)生物傳感器看出。采用上述方法在玻碳電極上制備含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的辣根過氧化物酶膜并以其作為工作電極，以Ag/AgCl電極作為參比電極，Pt電極作為對電極組成辣根過氧化酶電化學(xué)生物傳感器。將該傳感器的三電極體系置于pH值為5.5~8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用CHI660B電化學(xué)工作站對含亞甲基藍(lán)插層二氧化錠材料的復(fù)合酶功能敏感膜修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果表明該傳感器可以實現(xiàn)辣根過氧化物酶對過氧化氫的良好的催化作用(如圖2所示)。采用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)測試其抗干擾能力，由圖3可以看出在0.4mM的過氧化氫底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、醋酸和O.lmM的抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾。該電極的穩(wěn)定性保持在2個月以上。能力及穩(wěn)定性等主要性能對照見下表表l.不同材料制備的酶敏感膜所得生物傳感器的性能比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明提供的含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的酶功能敏感膜應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的優(yōu)點是(1)將電子媒介體亞甲基藍(lán)固定于二氧化錳層間，可以避免測試過程中電子媒介體的流失，減少了電子媒介體的用量并且簡化了操作步驟；(2)亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料修飾的電極對底物的檢測電位接近0Vvs.AgZAgCl,可以有效降低溶液中電化學(xué)活性物質(zhì)的干擾(一般認(rèn)為電化學(xué)生物傳感器的檢測電位在-0.10Vvs.Ag/AgCl時干擾最小)；(3)二氧化錳表面帶較多負(fù)電荷，可與較多帶正電荷的陽離子型生物相容性聚合物通過靜電作用結(jié)合，而陽離子型生物相容性聚合物中的大量氫鍵可以進(jìn)一步穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象，給酶提供生物相容性良好的微環(huán)境，從而提高酶存活的長期性及酶功能膜的穩(wěn)定性。圖1.亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)示意圖a.二氧化錳層板b.亞甲基藍(lán)圖2.辣根過氧化酶電極對過氧化氫的催化圖橫坐標(biāo)一電壓E(單位V，參比電極為Ag/AgCl)縱坐標(biāo)一響應(yīng)電流i(單位/iA)a.空白底液的循環(huán)伏安圖b.底液中加入6mM過氧化氫后的循環(huán)伏安圖圖3.辣根過氧化酶電極的干擾測定曲線橫坐標(biāo)一時間t(單位秒)縱坐標(biāo)一響應(yīng)電流i(單位M)圖4.層狀二氧化錳及亞甲基藍(lán)插層二氧化錳的XRD圖譜橫坐標(biāo)一角度20(單位度)縱坐標(biāo)一衍射強(qiáng)度I(單位a.u.(絕對單位))a.氫型二氧化錳的XRD譜圖b.剝層二氧化錳灰漿的XRD譜圖c.亞甲基藍(lán)插層二氧化錳的XRD譜圖具體實旌方式實施例lA采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.將200mL含有0.8mol/LNaOH和1.2mol/LH202的混合溶液快速加到100mL含有0.3mol/LMn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)20分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL濃度為2.5mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在15(TC水熱處理16小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8，將濾餅在70'C空氣氣氛中干燥7小時，得到層狀二氧化錳；A-2.將2.8g上述層狀二氧化猛固體粉末加入到260mL濃度為1.2mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)3天，其間每隔24小時更換一次新的1.2mol/LHN03溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6，將濾餅在70X:空氣氣氛中干燥8小時，得到氫交換的二氧化錳；A-3.量取15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25y。的四甲基氨氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.Og氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)8天，將混合液在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心8分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在1.8mg/mL;A-4.稱取0.2g亞甲基藍(lán)溶于50mL去離子水中，另取200mL上述剝層二氧化錳溶膠，將兩種溶液混和，40。C攪拌反應(yīng)24小時，過濾，依次用去離子水和丙覿洗滌沉淀至濾液無色，然后在50T空氣中干燥12小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳。B制備含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的辣根過氧化酶敏感膜B-l.稱取lmg亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超聲分散在2mL無水乙醇液中，將10/iL該溶液滴涂在潔凈的玻碳電極表面($=3mm)，在室溫下干燥15小時；B-2.稱取10mg陽離子纖維素溶于lmL二次蒸餾水中，取50/*L上述溶液與濃度為lOmg/mL活性為300U/mg的辣根過氧化酶lO^L混合，得到混合均勻的混合液。分散好的8pL混合液滴加在B-l修飾好的玻碳電極表面。在4TC冰箱中干燥15小時。干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的聚乙烯醇縮丁醛乙醇溶液中保持IO分鐘。取出用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，4X:冰箱中放置15小時使溶劑全部揮發(fā)，在玻碳電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜，其中亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的含量是0.071mg/cm2，生物活性物質(zhì)為0.19mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.94mg/cm2，其余為髙分子成膜物質(zhì)。然后將修飾好的電極干態(tài)保存在4C冰箱中備用。以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1r，測試體系為O.IM，pH=7.0的磷酸緩沖溶液,用i-t法在OV(vs.Ag/AgCl)檢測電極對底物11202的響應(yīng)，該生物傳感器的響應(yīng)時間小于30秒，線性范圍為2.0xlO、5.9xlO^M過氧化氫(線性相關(guān)系數(shù)0.99943)，靈敏度為6.05mAM"cm人根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極的最低檢測限為2.3/*14過氧化氫；在含有0.4mMH202的底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、醋酸和O.lmM的抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。實施例2A采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.將200mL含有0.6mol/LNaOH和1.5mol/LH202的混合溶液快速加到lOOmL含有0.4mol/LMn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)30分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL濃度為2mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在160X:水熱處理18小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為9，將濾餅在8(TC空氣氣氛中干燥9小時，得到層狀二氧化鍤；A-2.將2.5g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到300mL濃度為1.5mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)3天，其間每隔24小時更換一次新的1.5mol/LHN03溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為7，將濾餅在8(TC空氣氣氛中干燥9小時，得到氫交換的二氧化錳；A-3.量取16mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25c/。的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.2g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)9天，將混合液在12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心7分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在0.8mg/mL;A4.稱取0.3gMB溶于50mL去離子水中，另取200mL上述剝層二氧化鎮(zhèn)溶膠，將兩種溶液混和，50。C攪拌反應(yīng)20小時，過濾，分別用去離子水和丙翻洗滌沉淀至濾液無色，然后在70。C空氣中干燥8小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳。B制備含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的葡萄糖氧化酶敏感膜B-l.稱取lmg亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料超聲分散在4mL無水乙醇液中，將17^L該溶液滴涂在潔凈的鉑盤電極表面($=5mm),在室溫下干燥18小時；B-2.稱取15mg陽離子纖維素溶于lmL二次蒸餾水中，取50/*L上述溶液與濃度為100mg/mL活性為47.2U/mg的葡萄糖氧化酶10/*L混合，得到混合均勻的混合液。分散好的混合液滴加在B-l修飾好的鉑盤電極表面。在7TC冰箱中干燥25小時。干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%全氟磺酸聚合物無水乙醇溶液中保持2分鐘。取出用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，7'C冰箱中放置10小時使溶劑全部揮發(fā)，在鉑盤電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜，其中亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的含量是0.022mg/cm2，生物活性物質(zhì)為1.27mg/cm2,陽離子型生物相容性聚合物為0.96mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。然后將修飾好的電極干態(tài)保存在7'C冰箱中備用。以修飾鉑盤電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1X:，測試體系為0.1M，pH=7.5的磷酸緩沖溶液,用i-t法在OV(vs.Ag/AgCl)檢測電極對底物iS"D葡萄糖的響應(yīng)，該生物傳感器的響應(yīng)時間小于15秒，線性范圍為2.0xl(^1.9xl(^M葡萄糖(線性相關(guān)系數(shù)0.9993)，靈敏度為S.OmAl^cm^根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極的最低檢測限為1.0/iM葡萄糖，穩(wěn)定性保持2個月以上；在含有2mMj8-D葡萄糖的底液中加入0.4mM的蔗糖、檸檬酸、醋酸和O.lraM的抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。實施例3A采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.將200mL含有O.8mol/LNaOH和1.5mol/LH202的混合溶液快速加到lOOmL含有0.5mol/LMn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)25分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL濃度為2.3mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在16(TC水熱處理15小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8.5,將濾餅在75TC空氣氣氛中干燥9小時，得到層狀二氧化錳；A-2.將2.0g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到260mL濃度為1.0mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)5天，其間每隔24小時更換一次新的1.0mol/LHNO3溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6.5，將濾餅在75C空氣氣氛中干燥6小時，得到氫交換的二氧化錳；A-3.量取20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25n/。的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取2.0g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)10天，將混合液在11000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心7分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在1.3mg/mL;A-4.稱取0.4gMB溶于50mL去離子水中，另取200mL上述剝層二氧化錳溶膠，將兩種溶液混和，60。C攪拌反應(yīng)20小時，過濾，分別用去離子水和丙翻洗滌沉淀至濾液無色，然后在70。C空氣中干燥10小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳。B制備含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的細(xì)胞色素C敏感膜B-l.稱取lmg亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料超聲分散在5mL無水乙醇液中，將10pL該溶液滴涂在潔凈的金盤電極表面($=3mm)，在室溫下干燥20小時；B-2.稱取6mg陽離子瓜爾膠溶于ImL二次蒸餾水中，取30juL上述溶液與濃度為8mg/mL的細(xì)胞色素C20/iL混合，得到混合均勻的混合液。分散好的混合液滴加在B-l修飾好的金盤電極表面。在3'C冰箱中干燥15小時。干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的聚乙烯醇縮丁醛乙醇溶液中保持10分鐘。取出用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，3C冰箱中放置30小時使溶劑全部揮發(fā)，在金盤電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜，其中亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的含量是0.028mg/cm2，生物活性物質(zhì)為0.45mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.51mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。然后將修飾好的電極干態(tài)保存在3匸冰箱中備用。以修飾金盤電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1r，測試體系為0.1M，pH=6.5的磷酸緩沖溶液，用i-t法在OV(vs.Ag/AgCl)檢測電極對底物H2O2的響應(yīng)，該生物傳感器的響應(yīng)時間小于10秒;在含有0.4mMH202的底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、醋酸和O.lmM的抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。實施例4A采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化鎮(zhèn)超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.將200mL含有0.6mol/LNaOH和1.2mol/LH202的混合溶液快速加到lOOmL含有0.5mol/LMn(NO3)2的溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)25分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL濃度為2.5mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在1501C水熱處理16小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為8.5，將濾餅在75'C空氣氣氛中干燥8小時，得到層狀二氧化錳；A-2.將2.5g上述層狀二氧化錳固體粉末加入到300mL濃度為1.4mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)4天，其間每隔24小時更換一次新的1.4mol/LHN03溶液。將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為6.5,將濾餅在751C空氣氣氛中干燥8小時，得到氫交換的二氧化錳；A-3.量取16mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25^的四甲基氫氧化銨，溶解于200mL去離子水中，稱取1.2g氫交換二氧化錳分散在上述四甲基氫氧化銨水溶液中,室溫下攪拌反應(yīng)8天，將混合液在11000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心8分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在1.0mg/mL;A-4.稱取0.3gMB溶于50mL去離子水中，另取200mL上述剝層二氧化錳溶膠，將兩種溶液混和，60T攪拌反應(yīng)25小時，過濾，分別用去離子水和丙酮洗滌沉淀至濾液無色，然后在60T空氣中干燥10小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳。B制備含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的葡萄糖氧化酶敏感膜B-l.稱取lmg亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料超聲分散在3mL無水乙醇液中，將12pL該溶液滴涂在潔凈的玻碳電極表面($=5mm)，在室溫下千燥15小時；B-2.稱取20mg陽離子纖維素溶于lmL二次蒸餾水中，取50pL上述溶液與濃度為80mg/mL活性為4200U/mg的酪氨酸酶溶液混合，得到混合均勻的混合液。分散好的15ML混合液滴加在B-l修飾好的玻碳電極表面。在4'C冰箱中干燥25小時。干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖醋酸溶液中7分鐘。取出用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，4'C冰箱中放置10小時使溶劑全部揮發(fā)，在玻碳電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜，其中亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的含量是0.047mg/cm2，其中生物活性物質(zhì)含量是1.02mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為1.27pg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。然后將修飾好的電極干態(tài)保存在41C冰箱中備用。以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1r,測試體系為0.1M，pH=7.0的磷酸緩沖溶液，用i-t法在OV(vs.Ag/AgCl)檢測電極對底物兒茶酚的響應(yīng)，該生物傳感器的響應(yīng)時間小于10秒，根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極最低檢測限為1.5/iM兒茶酚；線性范圍為0.00151.5mM(線性相關(guān)系數(shù)為0.999)，靈敏度為3.5mAM—'cm、在含有0.4mM兒茶酚的底液中加入0.4mM的蔗糖、檸樣酸、醋酸和O.lmM的抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。權(quán)利要求1.一種生物傳感器酶功能敏感膜，是由亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料、生物活性物質(zhì)、陽離子型生物相容性聚合物和高分子成膜物質(zhì)組成的復(fù)合膜，該復(fù)合膜各成分的含量分別是亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料為0.002～0.2mg/cm2，生物活性物質(zhì)為0.1～5.0mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.05～2.0mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器酶功能敏感膜，其特征是所述的亞甲基藍(lán)插層二氧化錳具有超分子插層結(jié)構(gòu)，其層間距為1.4mn;所述的生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細(xì)胞色素C中的一種；所述陽離子型生物相容性聚合物是陽離子纖維素和陽離子瓜爾膠中的一種；所述高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、殼聚糖(Chitosan)中的一種。3.—種如權(quán)利要求1所述的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法,具體制備步驟如下:A采用剝離再組裝的方法制備亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料A-l.按OH-與Mn&摩爾比為3:l4:1,11202與Mi^+摩爾比為6:18:1，將含有0.60.8mol/LNaOH和1.01.5mol/LH202的混合溶液快速加入到0.30.4mol/L的Mn(N03)2溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)2030分鐘，過濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至聚四氣乙烯容器中；按Off與Mn02摩爾比為2:14:1且裝滿度40%，加入濃度為23mol/L的NaOH溶液，攪拌成糊狀，將聚四氟乙烯容器密封于水熱釜中，在150160'C水熱處理1520小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗濾餅至濾液pH值為89,將濾餅在70801C空氣氣氛中干燥69小時，得到層狀二氧化錳；A-2.按照IT與層狀二氧化錳摩爾比為10:115:1，將上述層狀二氧化錳固體粉末加入濃度為1.01.5mol/L的HN03溶液中，室溫攪拌反應(yīng)35天，其間每隔24小時更換一次新的1.01.5mol/LHN03溶液，之后將混合液抽濾，用去離子水洗滌至濾液pH值為67,將濾餅在708(TC空氣氣氛中干燥69小時，得到氫交換的二氧化錳；A-3.按四甲基氫氧化銨與二氧化錳摩爾比為2:14:1，將上述氫交換的二氧化錳加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%2.0%的西甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)710天，將混合液在1000012000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心510分鐘，上層溶膠為剝層二氧化錳溶膠，調(diào)整濃度范圍在0.12.0mg/mL;A-4.按亞甲基藍(lán)與剝層二氧化錳的摩爾比為1:51:15，將2.010.0mg/mL的亞甲基藍(lán)溶液與上述剝層二氧化錳溶膠混合，3070'C攪拌反應(yīng)1830小時，過濾，分別用去離子水和丙酮洗滌沉淀至濾液無色，然后在4080'C空氣氣氛中干燥915小時，得到亞甲基藍(lán)插層二氧化錳；B.含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的復(fù)合酶功能敏感膜的制備B-l.將亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料配成0.11.0mg/mL的乙醇分散液，按0.52.0^L/mm2的用量將該溶液滴涂在潔凈的固體電極表面，在室溫下干燥1020小時；B-2.將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%2.0%的陽離子型生物相容性聚合物的水溶液與濃度為1100mg/mL的生物活性物質(zhì)的二次蒸餾水溶液按體積比為1:14:1的比例混合均勻，按0.52.0ML/mn^的用量將混合液滴涂在上述亞甲基藍(lán)插層二氧化錳修飾的電極表面，在28'C冷凍干燥1030小時，干燥后將電極浸入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55.0%的高分子成膜物質(zhì)的溶液中保持120分鐘，用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，在28t:冰箱中放置1030小時使溶劑全部揮發(fā)，即在電極表面形成一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子材料的復(fù)合酶功能敏感膜。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法，其特征是步驟B所述生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細(xì)胞色素C中的一種；陽離子型生物相容性聚合物是陽離子纖維素和陽離子瓜爾膠中的一種高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、殼聚糖(Chitosan)中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法，其特征是步驟B所述的高分子成膜物質(zhì)溶液中，聚乙烯醇縮丁醛、全氟磺酸聚合物的溶劑為無水乙醇，殼聚糖的溶劑為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.52%的醋酸二次蒸餾水溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法，其特征是步驟B所述的固體電極為玻碳電極、鉑盤電極和金盤電極中的一種。全文摘要本發(fā)明涉及一種含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳超分子結(jié)構(gòu)材料的酶功能敏感膜的制備方法及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。采用剝離再組裝的方法將亞甲基藍(lán)插入到二氧化錳層間，將亞甲基藍(lán)插層二氧化錳材料的乙醇分散液滴涂于固體電極表面，待其自然干燥后再將生物相容性聚合物和生物活性物質(zhì)的均勻混合液滴涂于固體電極表面，待干燥后浸入高分子成膜物質(zhì)溶液中，取出后在冰箱中揮發(fā)掉溶劑，即可在固體電極表面得到一層含亞甲基藍(lán)插層二氧化錳的復(fù)合酶功能膜。本發(fā)明提供的酶功能敏感膜用于電化學(xué)生物傳感器，對傳感器的檢測電位、抗干擾能力、穩(wěn)定性等性能都有明顯的改善。文檔編號C12Q1/00GK101105470SQ200610089650公開日2008年1月16日申請日期2006年7月10日優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日發(fā)明者熊張,楊文勝,楊秀雙,雪段申請人:北京化工大學(xué)