專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定生物藥物中與免疫原性相關(guān)表位的方法
促成生物療法免疫毒性的一個(gè)方面是其免疫原性。具有免疫原性的生物藥物在臨床試驗(yàn)中會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致效力喪失和不利事件如過(guò)敏反應(yīng)、輸液反應(yīng)或自身免疫性的抗體。產(chǎn)生免疫原性的可能性取決于蛋白質(zhì)藥物序列中T細(xì)胞表位的存在。本發(fā)明涉及在誘導(dǎo)生物藥物(例如抗體或其它治療性蛋白質(zhì))免疫原性中起因果作用的表位的體外鑒定方法。更加具體而言，本發(fā)明的方法可用于鑒定經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞(其激發(fā)導(dǎo)致免疫原性的免疫反應(yīng))的肽受體遞呈的免疫原性肽的序列。對(duì)免疫原性表位的認(rèn)識(shí)使得可以通過(guò)定點(diǎn)誘變降低治療性多肽的風(fēng)險(xiǎn)，其目的在于產(chǎn)生無(wú)免疫原性生物藥物。
本發(fā)明涉及用于鑒定可能賦予蛋白質(zhì)免疫原性表位的方法。迄今為止，所用的方法依賴(lài)計(jì)算機(jī)(in silico)預(yù)測(cè)算法、T細(xì)胞活化分析或動(dòng)物接種模型中重疊的成肽的體外篩選。該方法基于從經(jīng)各個(gè)藥物蛋白質(zhì)負(fù)載的人樹(shù)突狀細(xì)胞中分離免疫原性肽以及對(duì)該藥物蛋白質(zhì)潛在T細(xì)胞表位序列的鑒定。本發(fā)明方法可用于鑒定工程化多肽、抗體或其它治療性蛋白質(zhì)中含有的免疫原性表位。
幾乎任何治療性蛋白質(zhì)在臨床試驗(yàn)中呈現(xiàn)一定程度的免疫原性。免疫原性的初次激發(fā)為CD4+T淋巴細(xì)胞在對(duì)各個(gè)治療性蛋白質(zhì)的肽片段識(shí)別基礎(chǔ)上的活化。這些肽稱(chēng)作“T細(xì)胞表位”，或簡(jiǎn)稱(chēng)作“表位”。
只有當(dāng)T細(xì)胞表位由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼的分子遞呈時(shí)才能實(shí)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞的活化。在人體中，MHC分子稱(chēng)為人白細(xì)胞抗原(HLA)。HLA結(jié)合肽較短，包含9-25個(gè)氨基酸(Kropshofer，H.和Vogt，A.B.，Immunol Today 18(1997)77-82)。
根據(jù)其功能，可區(qū)分兩類(lèi)MHC-肽復(fù)合物(Germain，R.，Cell 76(1994)287-299)(i)MHC I類(lèi)-肽復(fù)合物可由幾乎所有的有核細(xì)胞表達(dá)，以吸引可裂解感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，(ii)MHC II類(lèi)-肽復(fù)合物僅僅在所謂的抗原遞呈細(xì)胞(APC)上組成型表達(dá)，例如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)。具體而言，DC具有使CD4+T輔助細(xì)胞致敏的能力從而啟動(dòng)免疫原性(Banchereau，J.和Steinman，R.M.，Nature 392(1998)245-254)。
因此，用于鑒定治療性蛋白質(zhì)中免疫原性熱點(diǎn)的本創(chuàng)新方法為使用經(jīng)選擇生物藥物負(fù)載的DC并確定與DC上的MHC II類(lèi)分子結(jié)合的肽的序列。為了以適用于全部人群的方式確定生物藥物的潛在免疫原性，不得不使用來(lái)自一系列供血者的DC，其代表著各個(gè)群體MHC II類(lèi)基因型的多樣性。
本發(fā)明提供用于分離和鑒定源自藥物蛋白質(zhì)的飛摩爾量潛在免疫原性肽抗原的方法。所述方法涉及治療性蛋白質(zhì)(如多肽、單克隆抗體或其它蛋白質(zhì))的免疫原性監(jiān)測(cè)。本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)從健康供體常規(guī)量外周血獲得的少量樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)對(duì)所結(jié)合和/或遞呈肽進(jìn)行鑒定。所述方法可以確保所分離和鑒定的免疫原性肽是由DC在遇到治療性蛋白質(zhì)時(shí)體內(nèi)天然加工和遞呈的那些肽。
方法本發(fā)明提供用于分離和鑒定賦予生物藥物在施用于人之后具有免疫原性的肽的方法。本方法提供0.1至5μg量、優(yōu)選0.2至3μg量的肽受體與潛在免疫原性肽的復(fù)合物。該量與正常情況下從獲自病人或健康供體外周血的DC細(xì)胞可得到的物質(zhì)的量相當(dāng)。現(xiàn)有技術(shù)中需要的物質(zhì)最低量為約200μg的源自非限制性來(lái)源(近交系小鼠)的MHC II類(lèi)分子(Dongre A R等，EJI 2001，31，1485-94)。這比從人外周血獲得的物質(zhì)高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
具體地，本發(fā)明提供用于鑒定與免疫原性有關(guān)的肽的方法，其包括步驟a)提供以0.1-5μg、優(yōu)選0.2-3μg的量表達(dá)抗原遞呈受體(APR)的細(xì)胞，
b)將來(lái)自(a)的細(xì)胞與免疫原性肽源接觸，c)從細(xì)胞分離APR-免疫原性肽復(fù)合物，d)從APR洗脫所結(jié)合的肽，e)鑒定免疫原性肽，f)鑒定為表位的免疫原性肽。
優(yōu)選地，用于鑒定與免疫原性有關(guān)的肽的方法包括步驟a)提供以0.1-5μg、優(yōu)選0.2-3μg的量表達(dá)抗原遞呈受體(APR)的細(xì)胞，b)將來(lái)自(a)的細(xì)胞與免疫原性肽源接觸，c)通過(guò)免疫沉淀或免疫親合層析從細(xì)胞分離APR-免疫原性肽復(fù)合物，d)用水或低鹽緩沖液洗滌ARP與抗原性肽的結(jié)合復(fù)合物，e)從APR洗脫所結(jié)合的肽，f)鑒定免疫原性肽，g)驗(yàn)證被鑒定為表位的免疫原性肽。
優(yōu)選地，抗原遞呈受體是MHC II類(lèi)分子。
此外，本發(fā)明提供降低多肽免疫原性的方法，其包括a)如上所述鑒定多肽的免疫原性肽，b)修飾多肽的相應(yīng)表位，以降低或消除APR分子的結(jié)合，c)由此產(chǎn)生具有降低免疫原性潛能或無(wú)免疫原性潛能的突變多肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指相連的氨基酸鏈。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”指能激起針對(duì)物質(zhì)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)特性。對(duì)該物質(zhì)能力的測(cè)量在于激發(fā)針對(duì)其的免疫應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性潛能”指多肽引發(fā)免疫應(yīng)答的潛在能力。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指可識(shí)別入侵物質(zhì)并產(chǎn)生抗該抗原特異性抗體的機(jī)體防御反應(yīng)。
為獲得例如100ng MHC II類(lèi)分子所必需的組織或體液量依賴(lài)于表達(dá)MHC II類(lèi)分子的細(xì)胞數(shù)量和MHC II類(lèi)分子的表達(dá)速率如100ng MHCII類(lèi)分子與來(lái)自約50ml血液的約2×105個(gè)成熟DC或5至10×106個(gè)外周血單核細(xì)胞或約5×107個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞相當(dāng)。
鑒定MHC II類(lèi)分子結(jié)合肽所需的高靈敏度可以通過(guò)以下事實(shí)解釋?zhuān)催@些肽受體的每一類(lèi)型(如人MHC II類(lèi)基因產(chǎn)物HLA-DR1)可攜帶約500至1000種不同的抗原肽(Chicz R M等，J Exp.Med.1993，178，27-47；Chicz R M和Urban R G，Immunol.Today，1993，15155-160)。然而，在500至1000種不同的肽當(dāng)中，大多數(shù)僅達(dá)到很低的拷貝數(shù)，因此不太可能發(fā)揮生理作用。特別是在MHC II類(lèi)中，那些免疫相關(guān)肽(如激活輔助T細(xì)胞并因此促進(jìn)藥物蛋白質(zhì)免疫原性的那些肽)可達(dá)到中等拷貝數(shù)至高拷貝數(shù)(Latek R R和Unanue E R，Immunol.Rev.1999，172209-228)。這些肽占從MHC II類(lèi)分子洗脫肽物質(zhì)總量的約40％至50％，并等于約10至20種單個(gè)肽。
許多MHC II類(lèi)分子結(jié)合肽代表著一組2-5個(gè)C末端和N末端截短變體(Rudensky A Y等，Nature 1992，359，429-431；Chicz等，Nature 1992，358764-768)，該些變體具有被T細(xì)胞受體識(shí)別所必需的大約10-13個(gè)氨基酸的共同核心序列。這些截短或延長(zhǎng)的變體構(gòu)成同一T細(xì)胞表位。這表示重要的不同表位的數(shù)目實(shí)際上更少，約5-70個(gè)不同的表位。因此免疫原性表位的豐度范圍為0.2％-5％。
肽的來(lái)源本發(fā)明的抗原肽是與人DC表面的MHC II類(lèi)分子結(jié)合的肽?？乖目山Y(jié)合胞內(nèi)或胞外MHC II類(lèi)分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性肽”指引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原肽。免疫原性肽源自與DC共孵育后的多肽。免疫原性肽可能來(lái)源的多肽是包括治療性多肽在內(nèi)的多肽，例如細(xì)胞因子(即干擾素、白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或腫瘤壞死因子(TNF))、趨化因子、生長(zhǎng)因子、抗體(即單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體或人源化)、酶、結(jié)構(gòu)成分、激素和其片段。
由于所有這些肽受體能容納廣泛多樣的肽配體(參見(jiàn)上文)，所以必須要確定序列的每種單個(gè)肽僅有飛摩爾的量。1μg MHC II類(lèi)分子(16pmol)可攜帶各種單個(gè)肽占主要肽種類(lèi)的0.1-2％(這等于約16-320飛摩爾)。本發(fā)明方法允許從0.1-5μg荷肽抗原遞呈受體分離飛摩爾量的這些潛在免疫原性肽并且隨后對(duì)它們測(cè)序。
抗原遞呈受體的來(lái)源本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原遞呈受體”或“APR”指結(jié)合抗原肽并將它們遞呈至其它免疫細(xì)胞并由此介導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答的肽受體。優(yōu)選抗原遞呈受體是MHC II類(lèi)分子。MHC II類(lèi)分子包括但不限于HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子。備選地，起作用的APR是CD1家族的受體或其它迄今為止不明確的能向CD4+輔助T細(xì)胞遞呈潛在免疫原性肽的受體。
細(xì)胞材料的來(lái)源本發(fā)明方法包括表達(dá)抗原遞呈受體并同時(shí)使CD4+T細(xì)胞致敏或活化的所有細(xì)胞。這些細(xì)胞也稱(chēng)為抗原遞呈細(xì)胞(APC)(Unanue，E.R.Macrophages，antigen presenting cells and the phenomena of antigenhandling and presentation.在Fundamental Immunology，第2版，(編者Paul，W.E)New York，Raven Press，1989)。所用的APC包括人B細(xì)胞、人巨噬細(xì)胞、優(yōu)選人樹(shù)突狀細(xì)胞。除此之外，可使用含有APC的細(xì)胞混合物，例如外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)或外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。
優(yōu)選的APC是表達(dá)MHC II類(lèi)分子的細(xì)胞。甚至更優(yōu)選的APC是樹(shù)突狀細(xì)胞。
為了判斷多肽在特定人群中的免疫原性，使用一系列HLA型樹(shù)突狀細(xì)胞，HLA型代表了整個(gè)群體的HLA頻率。例如，為了在HLA-DR基因座的HLA多態(tài)性方面覆蓋高加索人群，必須用源自約15-20個(gè)HLA-DR基因型不同的血液供體的樹(shù)突狀細(xì)胞分析潛在免疫原性肽。
來(lái)自細(xì)胞的抗原遞呈受體的溶解作用為了純化來(lái)自細(xì)胞的抗原遞呈受體-肽復(fù)合物，必須將細(xì)胞膜溶解。用本領(lǐng)域公知方法實(shí)施細(xì)胞裂解，例如凍融和使用去污劑及其組合。優(yōu)選的裂解方法是用去污劑溶解，去污劑優(yōu)選TX-100、NP40，n-辛基葡糖苷、Zwittergent、Lubrol、CHAPS、最優(yōu)選TX-100或Zwittergent 3-12。通過(guò)離心從含有溶解的受體-肽復(fù)合物的細(xì)胞裂解液中去除細(xì)胞碎片和核。因此，在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，使用包括去污劑溶解的方法將抗原遞呈受體與免疫原性肽的復(fù)合物從細(xì)胞中分離。
MHC-肽復(fù)合物的納級(jí)(Nano-Scale)純化此外，發(fā)明提供了通過(guò)包括免疫沉淀或免疫親合層析的方法從細(xì)胞裂解液中純化MHC-肽復(fù)合物。對(duì)于免疫沉淀或免疫親合層析，使用MHC II類(lèi)分子特異的且適于這些方法的抗體。特異性抗體優(yōu)選是單克隆抗體，并且是共價(jià)或非共價(jià)地(例如經(jīng)蛋白A)與珠(如瓊脂糖凝膠珠或瓊脂糖珠)偶聯(lián)?，F(xiàn)有技術(shù)中使用的一組抗-HLA抗體包括抗HLA-DR抗體L243、TU36、DA6.147，優(yōu)選L243；抗HLA-DQ抗體SPVL3、TU22、TU169，優(yōu)選TU22和TU169；抗HLA-DP抗體B7/21。
對(duì)不同MHC II類(lèi)分子特異的單克隆抗體可商業(yè)獲得(如Pharmingen，Dianova)，或者使用蛋白A或蛋白G親合層析從各個(gè)雜交瘤上清中純化。純化的單克隆抗體可通過(guò)各種本領(lǐng)域公知方法偶聯(lián)，優(yōu)選將抗體的氨基與CNBr-活化瓊脂糖凝膠共價(jià)偶聯(lián)。
通過(guò)在旋轉(zhuǎn)情況下將抗體-珠與細(xì)胞裂解液孵育幾小時(shí)，或通過(guò)泵送細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)微型柱的層析法，進(jìn)行MHC分子的免疫分離?？贵w-珠的洗滌在Eppendorf管或微型柱中進(jìn)行。通過(guò)SDS-PAGE和使用識(shí)別變性MHC分子的抗體(抗HLA-DRα:1B5)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來(lái)分析免疫沉淀的效果。
抗原遞呈受體結(jié)合肽的洗脫和分級(jí)分離將肽從受體分子上洗脫，得到源自潛在免疫原來(lái)源的或胞內(nèi)和胞外來(lái)源多肽的天然加工肽的復(fù)雜混合物。只有在洗脫后，可能將肽分級(jí)分離并進(jìn)行序列分析。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原”指當(dāng)導(dǎo)入體內(nèi)時(shí)會(huì)激發(fā)免疫應(yīng)答的任何多肽。
本發(fā)明方法中的免疫原性肽可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法洗脫，優(yōu)選使用稀酸如稀乙腈(Jardetzky T S等，Nature 1991 353，326-329)、稀乙酸并加熱(Rudensky A Y等，Nature 1991，353，622-626；Chicz R M等，Nature 1992，358，764-768)或稀三氟乙酸并于37℃(Kropshofer H等，JExp Med 1992，175，1799-1803)洗脫。最優(yōu)選地，在37℃用稀三氟乙酸洗脫肽。
在另外的實(shí)施方案中，在洗脫之前將分離的抗原遞呈受體-肽復(fù)合物用水或低鹽緩沖液洗滌，以除去殘留的去污劑污染物。低鹽緩沖液可以是0.5-10mM濃度范圍、優(yōu)選0.5mM濃度的Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液或乙酸緩沖液。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原遞呈受體-肽復(fù)合物用常規(guī)用于HPLC分析的超純水(測(cè)序級(jí))、優(yōu)選用來(lái)自MERCK的超純水(測(cè)序級(jí))進(jìn)行洗滌。通過(guò)超濾實(shí)施洗滌步驟。在具有30kD、20kD、10kD或5kD、優(yōu)選30KD截留分子量和0.5-1.0ml管體積的超濾管(“Ultrafree”管；Millipore)中進(jìn)行超濾。在超濾管中用攜帶受體-肽復(fù)合物的珠的10-20倍體積、優(yōu)選15倍體積洗滌4-12次、優(yōu)選6-10次。使用相同超濾管從保留的抗原遞呈受體分子分離洗脫的肽。然后將洗脫的肽凍干。通過(guò)液相層析質(zhì)譜(LC-MS)分析肽序列。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，將所分離免疫原性肽分級(jí)分離、測(cè)序并鑒定。通過(guò)測(cè)序可知，在所分離的免疫原性肽混合物中各個(gè)肽的氨基酸序列可通過(guò)適于飛摩爾量肽測(cè)序的方法進(jìn)行解析。通過(guò)鑒定可知，免疫原性肽源自哪個(gè)蛋白質(zhì)或多肽以及它們構(gòu)成這些蛋白質(zhì)或多肽中的哪個(gè)序列。
在第一個(gè)步驟中，所洗脫肽的復(fù)雜混合物可通過(guò)多種可行層析法之一進(jìn)行分級(jí)分離，如通過(guò)反相層析、陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析或其組合。優(yōu)選地，如MudPit所述(Washburn M P等，Nat Biotechnol.，(2001)，19，242-247)，通過(guò)C18反相層析或通過(guò)反相/陽(yáng)離子交換二維HPLC實(shí)施分離。
可使用熔融石英微毛細(xì)管柱以HPLC方式進(jìn)行分級(jí)分離，其中該微毛細(xì)管與質(zhì)譜儀的納流電噴霧源相連，或與將級(jí)分點(diǎn)樣到用于MALDI分析的平板上的微分級(jí)分離裝置相連。
各種質(zhì)譜技術(shù)是適宜的，優(yōu)選MALDI-源后衰減(PSD)MS或電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS)，最優(yōu)選離子阱ESI-MS。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法確定各個(gè)肽的序列。優(yōu)選地，通過(guò)肽片段化以及使用例如MASCOT或SEQUEST的算法對(duì)片段譜進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助解析來(lái)實(shí)現(xiàn)序列分析。兩種計(jì)算機(jī)算法均使用蛋白質(zhì)和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)以對(duì)實(shí)驗(yàn)和理論產(chǎn)生的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行交叉相關(guān)分析。這允許進(jìn)行自動(dòng)化高通量序列分析。
通過(guò)MALDI質(zhì)譜的定性肽分析為了對(duì)洗脫獲得的整個(gè)肽庫(kù)進(jìn)行定性分析，開(kāi)展了基質(zhì)輔助激光解吸和離子化飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析。使用不對(duì)肽進(jìn)行片段化的設(shè)置，MALDI-TOF分析提供關(guān)于肽混合物的復(fù)雜度和優(yōu)勢(shì)肽存在的粗略概括。
定量肽分析為了評(píng)估從抗原遞呈受體洗脫的各個(gè)肽的數(shù)量，通過(guò)在214nm檢測(cè)波長(zhǎng)下工作的流過(guò)UV檢測(cè)儀分析微毛細(xì)管柱的流過(guò)液。為了定量，將所分析肽的峰面積與合成的標(biāo)準(zhǔn)肽的分級(jí)數(shù)量的峰面積進(jìn)行比較。
策略本發(fā)明策略預(yù)見(jiàn)，可以對(duì)已經(jīng)負(fù)載到細(xì)胞培養(yǎng)APC的抗原遞呈受體上的免疫原性肽進(jìn)行鑒定(體外方法，

圖1)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與免疫原性有關(guān)的肽的鑒定方法，其包括步驟a)提供以0.1-5μg、優(yōu)選0.2-3μg的量表達(dá)抗原遞呈受體(APR)的細(xì)胞，b)將細(xì)胞與免疫原性肽源接觸，c)從細(xì)胞分離APR-免疫原性肽復(fù)合物，d)從APR洗脫所結(jié)合的肽，e)鑒定免疫原性肽，f)驗(yàn)證被鑒定為表位的免疫原性肽。
APR表達(dá)細(xì)胞可以是MHC II類(lèi)表達(dá)細(xì)胞(APC)。優(yōu)選地，APC是樹(shù)突狀細(xì)胞，更優(yōu)選地，APC是未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，最優(yōu)選地，APC是由外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。
可從外周血單核細(xì)胞或從骨髓來(lái)源的CD34+干細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生樹(shù)突狀細(xì)胞。通過(guò)密度梯度離心從血樣分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。然后通過(guò)本領(lǐng)域已知方法，如通過(guò)磁珠分選法，從PBMC分離單核細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞源可以是哺乳動(dòng)物物種，優(yōu)選人。然后將單核細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中分化形成未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析(如細(xì)胞表面標(biāo)記物CD83、CD80、CD86、HLA-DR的上調(diào))監(jiān)測(cè)分化狀態(tài)。
為獲得如100ng MHC II類(lèi)分子所必需的細(xì)胞量依賴(lài)于表達(dá)MHC II類(lèi)分子的細(xì)胞數(shù)和MHC II類(lèi)分子的表達(dá)速率如100ng MHC II類(lèi)分子與來(lái)自約50ml血液的約2×105個(gè)未成熟DC或5-10×106個(gè)外周血單核細(xì)胞或約5×107個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞相當(dāng)。然后將APC與治療性蛋白質(zhì)源接觸。APC，優(yōu)選未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法(如與炎性細(xì)胞因子、類(lèi)TNFα或TNFα混合物、IL-6、IL-1β、PGE2共孵育)同時(shí)被激發(fā)成熟。
向APC提供的治療性蛋白質(zhì)源選自非合成或合成蛋白質(zhì)。對(duì)照APC除了不暴露于治療性蛋白質(zhì)之外，它們進(jìn)行相同處理(參照?qǐng)D1)。
APC與多肽或其片段接觸，其中多肽或其片段可通過(guò)受體介導(dǎo)攝取或通過(guò)液相攝取和內(nèi)化而被APC吸收。
通過(guò)從MHC分子洗脫肽，得到一組源自多肽或其片段的天然加工肽。該多肽可以是所選擇的治療性多肽或者是胞內(nèi)來(lái)源(在不負(fù)載治療性多肽的情況況下由APC表達(dá)的自體蛋白質(zhì))或胞外來(lái)源(在不負(fù)載治療性多肽的情況下也存在的源自細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白質(zhì))的不相關(guān)多肽。
通過(guò)將從接觸潛在免疫原來(lái)源的細(xì)胞鑒定的肽，與從未接觸該來(lái)源的細(xì)胞鑒定的那些肽(對(duì)照)進(jìn)行比較，鑒定分離的免疫原性肽。
MHC結(jié)合肽的表位驗(yàn)證通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的肽序列，可通過(guò)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之一(包括MHC結(jié)合基序、MHC結(jié)合能力和經(jīng)CD4+淋巴細(xì)胞的識(shí)別)進(jìn)行驗(yàn)證。
MHC結(jié)合基序是特定MHC分子(等位變體)結(jié)合肽的共同結(jié)構(gòu)特征，其為與MHC分子形成穩(wěn)定復(fù)合體所必需的。就MHC II類(lèi)分子而言，因?yàn)殡慕Y(jié)合槽的兩端開(kāi)放，可結(jié)合肽長(zhǎng)度為12-18個(gè)氨基酸和甚至更長(zhǎng)的肽。在九聚體核心區(qū)包含相對(duì)位置P1、P4、P6、P9，多數(shù)HLA II類(lèi)分子容納多達(dá)4個(gè)與結(jié)合有關(guān)的殘基，稱(chēng)為“錨定殘基”。然而，該核心區(qū)在肽的N末端具有可變的長(zhǎng)度。在多數(shù)情況中，2-4個(gè)N末端殘基位于核心區(qū)之前。因此，P1錨定殘基位于大多數(shù)HLA II類(lèi)分子結(jié)合肽中的位點(diǎn)3、4或5。從HLA DR II類(lèi)分子洗脫的肽共有一個(gè)大的疏水性P1錨，其為酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。
錨定殘基的位置和確切類(lèi)型構(gòu)成肽結(jié)合基序，其對(duì)于大多數(shù)常見(jiàn)HLA-DR II類(lèi)等位基因產(chǎn)物是已知的。用于肽序列中基序確認(rèn)的計(jì)算機(jī)算法是“Tepitope”，其可從www.vaccinome.com(由J.Hammer，Nutley，美國(guó)所提供)獲得。
通過(guò)本領(lǐng)域已知方法，使用例如分離MHC II類(lèi)分子和具有與本發(fā)明方法所鑒定那些肽相同氨基酸序列的合成肽測(cè)試本發(fā)明方法所鑒定肽的MHC結(jié)合能力(Kropshofer H等，J.Exp.Med.1992；175，1799-1803；Vogt A B等，J.Immunol.1994；153，1665-1673；Sloan V S等，Nature 1995；375，802-806)。備選地，可以使用MHC II類(lèi)表達(dá)細(xì)胞系和生物素化肽的細(xì)胞結(jié)合測(cè)定法證實(shí)所鑒定表位(Arndt S O等，EMBO J.，2000；19，1241-1251)。
在兩種測(cè)定法中，通過(guò)確定使標(biāo)記報(bào)告肽的結(jié)合減少50％所需的濃度(IC50)來(lái)測(cè)量肽的相對(duì)結(jié)合能力。以適當(dāng)親和力與相關(guān)HLA II類(lèi)分子結(jié)合的肽的IC50值不超過(guò)已確認(rèn)參考肽IC50值的10倍。
相同結(jié)合測(cè)定法可用于測(cè)試肽結(jié)合備選MHC II類(lèi)分子的能力，備選MHC II類(lèi)分子即使用本發(fā)明方法洗脫的那些分子以外的MHC II類(lèi)分子。
使CD4+T細(xì)胞致敏的能力代表著最重要的表位驗(yàn)證方法。該方法涉及測(cè)試本發(fā)明方法所鑒定肽激活CD4+T細(xì)胞群體的能力。合成具有與本發(fā)明方法鑒定的那些序列相同或者對(duì)應(yīng)于源自本發(fā)明方法所鑒定嵌套組肽核心序列的氨基酸序列的肽。然后在可表達(dá)目的MHC II類(lèi)分子的自體樹(shù)突狀細(xì)胞的環(huán)境中測(cè)試合成肽激活CD4+的能力。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種體外方法測(cè)定CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。例如，在有或無(wú)候選合成肽存在情況下培養(yǎng)全外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并通過(guò)例如[3H]-胸腺嘧啶向其DNA的摻入測(cè)定其增殖性反應(yīng)。增殖性T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞這一情況可通過(guò)在分析前從PBMC中除去CD4+T細(xì)胞或者通過(guò)加入結(jié)合T細(xì)胞上CD4+分子的抑制性抗體(由此抑制CD4+細(xì)胞增殖)而測(cè)試。在兩種情況中，只有當(dāng)CD4+T細(xì)胞是增殖性細(xì)胞時(shí)，增殖性反應(yīng)會(huì)被抑制?；蛘撸蓮腜BMC純化CD4+T細(xì)胞，并在表達(dá)合適MHC II類(lèi)分子的APC存在情況下測(cè)試對(duì)肽的增殖性反應(yīng)。所述的APC可以是B-淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞或所有PBMC。APC也可以是源自B-淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞的永生化細(xì)胞系。APC內(nèi)源表達(dá)目的MHC II類(lèi)分子，或者表達(dá)編碼該分子的轉(zhuǎn)染多核苷酸。在所有情況中，可通過(guò)例如電離輻射或絲裂菌霉C處理而使APC在分析前為非增殖性的。
作為測(cè)定細(xì)胞增殖的備選方法，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法測(cè)定由CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括但不限于白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)或TGF-β。測(cè)定它們的分析法包括但不限于ELISA、ELISPOT和生物測(cè)定法，其中在所述生物測(cè)定法中，在測(cè)試樣品存在下測(cè)試對(duì)相關(guān)因子作出響應(yīng)的細(xì)胞的反應(yīng)性(例如增殖)。
應(yīng)用本發(fā)明方法可用于鑒定任何生物藥物，特別是具有下列情況的藥物中與免疫原性有關(guān)的肽，所述情況即由于中和性抗藥物抗體而導(dǎo)致不可接受的效力喪失或者臨床試驗(yàn)中副作用或嚴(yán)重副作用被認(rèn)為是依賴(lài)于免疫原性的。
所鑒定的免疫原性肽還用于消除各種(治療性)多肽具有免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)與MHC II類(lèi)分子結(jié)合至關(guān)重要的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵錨定殘基的交換，從而產(chǎn)生具有降低或沒(méi)有免疫原性潛能的突變的治療性多肽而實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)消除。備選地，可以將對(duì)CD4+T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識(shí)別至關(guān)重要的殘基進(jìn)行交換。
用于對(duì)MHC II類(lèi)分子結(jié)合至關(guān)重要錨定殘基進(jìn)行交換的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，即通過(guò)丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或帶電殘基取代HLA-DR1-限制性T細(xì)胞表位的P1錨點(diǎn)(參照Kropshofer等，EMBO J.15，6144-6154；1996)。
本發(fā)明方法可用于減少通過(guò)計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)算法所鑒定的表位數(shù)量。預(yù)測(cè)規(guī)則傾向于過(guò)多預(yù)測(cè)治療性多肽中含有的表位數(shù)量。此種過(guò)多預(yù)測(cè)的結(jié)果是對(duì)所預(yù)測(cè)的大量表位進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)消除會(huì)導(dǎo)致在下列情況下生物活性的喪失，即某些序列延伸賦予了生物活性和免疫原性的那些情況。由于本發(fā)明鑒定的是天然遞呈的肽表位，其經(jīng)歷了MHC結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)并通過(guò)APC內(nèi)部的肽編選者HLA-DM的質(zhì)量控制，所以本文所用的方法將潛在表位數(shù)量減少至合理的較少數(shù)量。降低表位數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)消除更可能保留治療性多肽的生物活性。
現(xiàn)已概述了本發(fā)明，通過(guò)參考具體實(shí)施例連同下列附圖可以更好地理解本發(fā)明，除非另外指出，本文包含的實(shí)施例僅用于解釋的目的而不旨在限制本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示研究源自加至人樹(shù)突狀細(xì)胞的治療性多肽的天然加工MHCII類(lèi)結(jié)合肽表位的方法學(xué)圖解。
圖2顯示通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)算法TEPITOPE鑒定的和涉及樹(shù)突狀細(xì)胞的體外方法鑒定的OKT3來(lái)源肽表位的比較。預(yù)測(cè)了對(duì)于HLA-DRB1等位基因*0301、*0401、*0701和*1101的潛在T細(xì)胞表位，如蛋白質(zhì)序列上面小的黑色矩形所示。用于TEPITOPE分析的閾值設(shè)定為1-4％。省略了未加工的OKT3輕鏈的信號(hào)肽。通過(guò)體外細(xì)胞技術(shù)所鑒定的表位用OKT3序列中的數(shù)字和框標(biāo)記。
圖3顯示通過(guò)合成的OKT3來(lái)源肽#1-4活化CD4+T細(xì)胞的圖示。T細(xì)胞活化強(qiáng)度通過(guò)刺激指數(shù)(SI)表示。用于刺激(每種10μM)的肽序列如下#1，OKT3-lc 98-113，GSGTKLEINRADTAPT；#2，OKT-lc143-158，INVKWKIDGSERQNGV；#3，OKT3-hc 194-209，WPSQSITCNVA HPASS；#4，OKT3-lc 164-183，DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDE。用各個(gè)肽和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞重刺激T細(xì)胞一次(B)或兩次(A，C)。每張圖上方顯示所采用樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的HLA-DRB1基因型。誤差條表示從3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得的SD。將不加入肽的情況下的平均SI調(diào)整為1.0。使用了具有下列DRB1單體型的供體細(xì)胞*0401/*0701(A)、*0301/*1501(B)和*1001/*1201(C)。
實(shí)施例下列實(shí)施例與上述附圖結(jié)合，并以圖1中概括的方法學(xué)為基礎(chǔ)并在以下詳細(xì)描述。除非另外指明，實(shí)施例中所指的商業(yè)可得的試劑根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用。
本發(fā)明的方法學(xué)細(xì)胞系和培養(yǎng)如下所述，使用從單核細(xì)胞分化而來(lái)的人樹(shù)狀細(xì)胞開(kāi)展研究。從人外周血純化單核細(xì)胞。所有細(xì)胞在補(bǔ)充1mM丙酮酸、2mM谷氨酰胺和10％熱滅活胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，Md.)的RPMI 1640培養(yǎng)基(縮寫(xiě)RPMI)中培養(yǎng)。
外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離從作為來(lái)自健康供體的標(biāo)準(zhǔn)血沉棕黃層制劑的當(dāng)?shù)匮獛?kù)獲得外周血。使用肝素(200I.U./ml血，Liquemine，Roche)以防止凝固。在LSM(1.077-1.080g/ml；ICN，Aurora，Ohio)中以800g(室溫)離心30分鐘以分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。從中間相收集PBMC并在含有20mM Hepes的RPMI中洗滌兩次(500g，15分鐘；300g，5分鐘)。為了除去紅血球，用ALT緩沖液(140mM氯化銨，20mM Tris，pH 7.2)在37℃處理PBMC 3分鐘。用含有20mM Hepes的RPMI洗滌PBMC兩次(200g，5分鐘)。
外周血單核細(xì)胞的HLA分型用于分離單核細(xì)胞和分化成樹(shù)突狀細(xì)胞的PBMC的HLA-DR基因型通過(guò)Roche Molecular Systems(Alameda，CA，美國(guó))確定。
樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞的產(chǎn)生根據(jù)制造商的方法，使用抗CD14磁珠(Miltenyi Biotech，Auburn，Calif.)的陽(yáng)性分選法，從PBMC分離單核細(xì)胞。在補(bǔ)充1％非必需氨基酸(Gibco，BRL，Rockville，Md.)、50ng/ml重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF；S.A.1.1×107U/mg)(Leucomax；Novartis，Basel，瑞士)以及3ng/ml重組人IL-4(S.A.2.9×104U/mg)(R&D Systems，Minneapolis，Minn.)的RPMI中培養(yǎng)單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞以0.3×106/ml接種于6孔平板(Costar)中培養(yǎng)5天以獲得未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析常規(guī)監(jiān)測(cè)單核細(xì)胞來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的質(zhì)量，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞符合下列表型CD1a(高)、CD3(陰性)、CD14(低)、CD19(陰性)、CD56(陰性)、CD80(低)、CD83(陰性)、CD86(低)和HLA-DR(低)。與此相反，成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(參照以下)呈現(xiàn)下列表型CD1a(低)、CD80(高)、CD83(高)、CD86(高)和HLA-DR(高)?？笴D1a、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86的單克隆抗體以及各自的同種型對(duì)照可從Pharmingen(San Diego，Calif.)購(gòu)買(mǎi)。
樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于治療性多肽為促使樹(shù)突狀細(xì)胞攝取藥物蛋白質(zhì)，將6×106個(gè)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于5-50μg生物藥物中。同時(shí)，加入10ng/ml重組人腫瘤壞死因子(TNFαS.A.1.1×105U/mg)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，6×106的樹(shù)突狀細(xì)胞只和TNFα孵育(圖1)。
共培養(yǎng)24-48小時(shí)后，通過(guò)以300g離心10分鐘收集成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。細(xì)胞用含有10％FCS的RPMI洗滌，并轉(zhuǎn)移至eppendorf管中。400g離心3分鐘后，徹底除去上清液并將細(xì)胞凍存于-70℃。
抗HLA II類(lèi)分子珠的產(chǎn)生抗HLA-DR單克隆抗體(mAb)L243(ATCC，Manassas，Va.)通過(guò)培養(yǎng)各個(gè)小鼠雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。根據(jù)制造商的方法，使用蛋白A瓊脂糖凝膠(Pharmacia，Uppsala，瑞典)純化mAb L243，并以終濃度2.5mg/ml固定于CNBr活化的瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)。L243珠儲(chǔ)存于含有0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem，La Jolla，Calif.)的PBS中。
HLA-DR-肽復(fù)合物的納級(jí)純化將冷凍的樹(shù)突狀細(xì)胞沉淀重懸于10倍體積的冰冷裂解緩沖液(1％Triton-X-100，20mM Tris、pH 7.8，5mM MgCl2，含有蛋白酶抑制劑chyrnostatin、抑胃酶肽、PMSF和亮抑蛋白酶肽(Roche，Mannheim，德國(guó))，并在水平振蕩器中于4℃下以1000轉(zhuǎn)/分裂解1小時(shí)。通過(guò)于4℃下以2000g離心10分鐘，去除細(xì)胞裂解液中的細(xì)胞碎片和核。裂解液與L243珠(每100μl細(xì)胞裂解液使用5-10μl L243珠)在水平振蕩器中于4℃下以1000轉(zhuǎn)/分共孵育2小時(shí)。結(jié)合到L243珠上的免疫沉淀的HLA-DR-肽復(fù)合物通過(guò)于4℃下以2000g離心5分鐘進(jìn)行沉淀，并用300μl溶于PBS的0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem)洗滌三次。
通過(guò)在免疫沉淀之前和之后分析各個(gè)細(xì)胞裂解液監(jiān)測(cè)HLA-DR-肽復(fù)合物的損耗效率。同時(shí)，使用抗HLA-DRα特異性mAb 1B5(Adams，T.E.等，Immunology 50(1983)613-624)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析等份小珠。
HLA-DR結(jié)合肽的洗脫結(jié)合于L234珠上的HLA-DR-肽復(fù)合物重懸于400μl H2O(HPLC級(jí)；Merck，Darmstadt，德國(guó))，轉(zhuǎn)入30kD截留分子量的超濾管UltrafreeMC(Millipore，Bedford，Mass.)中，并用400μl H2O(HPLC級(jí))通過(guò)于4℃下以14000轉(zhuǎn)/分離心2-4分鐘洗滌10次。為了洗脫結(jié)合肽，加入50μl含0.1％三氟乙酸(Fluka，Buchs，瑞士)的H2O(HPLC級(jí))，并于37℃孵育30分鐘。通過(guò)將超濾管以14000轉(zhuǎn)/分室溫離心3分鐘將洗脫的肽收集到一新eppendorf管中，并立即在Speed-Vac真空離心機(jī)中凍干。
肽通過(guò)納-HPLC的分級(jí)分離從HLA-DR分子洗脫的凍干肽溶于含0.05％三氟乙酸、5％乙腈(Merck，Darmstadt，德國(guó))的H2O(HPLC級(jí))中，并在連接于FAMOS自動(dòng)取樣器和ULTIMATE納流HPLC(Dionex，Olten，瑞士)的75μm×15cmC18 PepMap毛細(xì)管(C18；3μm；100)(LC-Packings，Amsterdam，荷蘭)上分離。使用200nl/分鐘的恒定流速的下列非線性梯度在0-40分鐘運(yùn)行5-50％的系統(tǒng)B；在40-50分鐘運(yùn)行50-90％的系統(tǒng)B。系統(tǒng)A為0.05％三氟乙酸、5％乙腈/H2O，系統(tǒng)B為0.04％三氟乙酸、80％乙腈/H2O。通過(guò)在214nm和280nm的雙重UV吸收，監(jiān)測(cè)分離情況。使用級(jí)分收集器PROBOTT(BAI，Weiterstadt，德國(guó))收集級(jí)分(400nl)，并點(diǎn)樣在AnchorChip 600/384 MALDI-MS靶(Bruker，Bremen，德國(guó))上。肽通過(guò)離子阱MS/MS質(zhì)譜的序列分析為對(duì)復(fù)雜的肽混合物進(jìn)行高通量測(cè)序，使用了MudPIT(多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù))(Washburn M P等，Nat Biotechnol 19(2001)，242-247)，MudPIT基于液相層析分級(jí)分離及隨后的質(zhì)譜測(cè)序。
為此，從HLA分子洗脫的凍干肽重懸浮于含有5％(v/v)乙腈、0.5％(v/v)乙酸、0.012％(v/v)七氟丁酸(HFBA)和5％(v/v)甲酸的緩沖液中。樣品在由Model P-2000激光拉出器(Sutter Instrument Co.，Novato，Calif.)產(chǎn)生的熔融石英微毛細(xì)管柱(100μm內(nèi)徑×365μm)上分離。微柱用3μm/C18反相材料(C18-ACE 3μm[ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS，Leonberg，德國(guó)])繼之以3cm的5μm陽(yáng)離子交換材料(PartisphereSCX；Whatman，Clifton，N.J.)填充。
使用下列緩沖液，在Agilent 1100系列HPLC(Agilent Technologies，Waldbronn，德國(guó))上實(shí)施完全自動(dòng)化的8步驟梯度分離5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩沖液A)、80％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩沖液B)、250mM醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩沖液C)以及1.5M醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩沖液D)。第一步驟(106分鐘)為100分鐘的0至80％緩沖液B梯度和保持6分鐘的80％緩沖液B。接著的6個(gè)步驟(每個(gè)步驟106分鐘)為5分鐘的100％緩沖液A、2分鐘的x％緩沖液C、5分鐘的100％緩沖液A、3分鐘的0至10％緩沖液B梯度、55分鐘的10至35％緩沖液B梯度、20分鐘的35至50％緩沖液B梯度、16分鐘的50至80％緩沖液B梯度。下列是步驟2-7中2分鐘緩沖液C百分?jǐn)?shù)(x)10、20、30、40、70、90和100％。步驟8為5分鐘的100％緩沖液A洗滌、用100％緩沖液D進(jìn)行20分鐘的鹽水洗滌以及100分鐘的0-80％緩沖液B梯度。
HPLC柱與裝備有納-LC電噴霧電離源的Finnigan LCQ離子阱質(zhì)譜儀(Finnigan，Bremen，德國(guó))直接連接。根據(jù)制造商的方法，以MS-MS模式實(shí)施質(zhì)譜分析。通過(guò)對(duì)swiss fasta數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SEQUEST算法來(lái)鑒定肽。通過(guò)TEPITOPE進(jìn)行潛在表位的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)通過(guò)使用TEPITOPE算法實(shí)現(xiàn)潛在T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。應(yīng)用下列檢索標(biāo)準(zhǔn)閾值(對(duì)于最佳分值為1-3％，對(duì)于中等分值天然配體為4-6％)、肽長(zhǎng)度(15個(gè)氨基酸殘基)和混雜性(預(yù)測(cè)結(jié)合9個(gè)等位基因中的至少6個(gè))。為了確定混雜性程度，選擇下列9個(gè)在高加索人群中頻繁出現(xiàn)的等位基因HLA-DRB1*0101、*0301、*0401、*0701、*0801、*1101、*1305、*1501和DRB5*0101。在表位檢索中不包括跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。
T細(xì)胞活化分析使用來(lái)自Miltenyi Biotech(Auburn，CA，美國(guó))的CD4+T細(xì)胞分離試劑盒通過(guò)陰性選擇從新鮮PBMC制備CD4+T細(xì)胞。T細(xì)胞群體純度＞75％并且通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色(Sigma-Aldrich)判斷存活率＞95％。T細(xì)胞以2×106細(xì)胞/ml重懸浮于AIM V培養(yǎng)基(Gibco BRL，Rockville，MD)。如所述從PBMC中分化出樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，并在完全的Macrophage-SFM培養(yǎng)基(Gibco BRL，Rockville，MD)中培養(yǎng)。在第4天，用10μg/ml的LPS(Sigma-Aldrich)刺激未成熟的DC。在第6天，將成熟DC洗滌，并以2×105細(xì)胞/ml重懸于AIMV培養(yǎng)基。對(duì)于共培養(yǎng)，將AIMV培養(yǎng)基中0.1ml的CD4+T細(xì)胞(2×105)和0.1ml的自體DC(2×104)在圓底96孔板中混合。分別以20μg/ml和1μg/ml的終濃度加入OKT3mAb和Inflexal V。加入合成肽至20μM終濃度。每一抗原以一式三份進(jìn)行測(cè)定。在共培養(yǎng)的第5天，每孔加入10μM的5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)(Roche，Basel，瑞士)。孵育24小時(shí)后，收集培養(yǎng)物并根據(jù)制造商的方法進(jìn)行處理。未添加抗原的培養(yǎng)物中T細(xì)胞增殖作為參照，將其平均刺激指數(shù)(SI)設(shè)為1。
為了重刺激T細(xì)胞，將未成熟的DC(2-3×106/ml)于50％AB血清(Sigma-Aldrich)、40％RPMI和10％DMSO(Sigma-Aldrich)中在-70℃下冷凍。在重刺激的時(shí)間點(diǎn)，將DC解凍、洗滌并在10μg/ml LPS存在下培養(yǎng)兩天。在DC/T細(xì)胞共培養(yǎng)的第5天(第1次重刺激)或第10天(第2次重刺激)，在將0.1ml ATM V中的解凍成熟DC(2×104)與新鮮蛋白質(zhì)或肽抗原共培養(yǎng)之前，從每個(gè)樣品孔取出0.1ml AIM V培養(yǎng)基。以終濃度100U/ml加入IL-2(Pharmingen，San Diego，CA)。
實(shí)施例1OKT3是第一個(gè)治療性抗體。它在1986年得到FDA批準(zhǔn)。它是CD3特異的小鼠IgG2a抗體，并作為移植(L.Chatenaud，2003)、I型糖尿病(E.Masteller和J.Bluestone，2002)和銀屑病(T.Udset等，2002)中的免疫抑制藥物廣泛用于臨床。盡管OKT-3誘導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)是深遠(yuǎn)的，但出現(xiàn)對(duì)異種蛋白質(zhì)的抗OKT3反應(yīng)是早期臨床試驗(yàn)中主要缺陷之一，其促進(jìn)OKT-3的快速清除和中和(G.Goldstein，1987)。據(jù)報(bào)道在涉及OKT3治療個(gè)體研究中，免疫原性的發(fā)生頻率粗略計(jì)算為85％(C.Pendley等，2003)。
圖1中描述的策略用于鑒定由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0401/1302的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的OKT3的肽表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0401/1302限制性O(shè)KT3表位，將表達(dá)HLA-DRB1*0401/1302基因型的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時(shí)，通過(guò)加入TNFα(10ng/ml)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0401/1302結(jié)合配體的序列分析揭示了OKT3來(lái)源表位，其表現(xiàn)為來(lái)自O(shè)KT3的7個(gè)肽序列(表1)。兩個(gè)表位源自κ輕鏈，一個(gè)表位位于重鏈。在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了與單體型DRB1*0401/1302相關(guān)的三個(gè)表位。
表位#1呈現(xiàn)為15-mer和16-mer的肽，其中15-mer肽是源自輕鏈恒定區(qū)99-113(表1)。表位#1包含DRB1*1302相關(guān)共顯性DRB3等位基因DRB3*0301的錨定基序(F.Verreck等，1996)作為P1錨的L-103，作為P4錨的N-106，作為P6錨的A-108和作為P9錨的A-111。如TEPITOPE算法所示，相同的錨定殘基具有結(jié)合DRB1*0401的性能(圖2)。通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的潛能證實(shí)表位#1是T細(xì)胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹(shù)突狀細(xì)胞環(huán)境中表位#1是刺激性的。
表位#2呈現(xiàn)為4種長(zhǎng)度變體13-mer、14-mer、15-mer和16-mer的肽。該表位也源自輕鏈亞基的恒定區(qū)(表1)。通過(guò)TEPITOPE算法預(yù)測(cè)出在DRB1*0401情況下的表位#2(圖2)，表位#2含有下列錨定基序作為P1錨的W-147、作為P4錨的D-150、作為P6錨的S-152。在T細(xì)胞活化分析中，表位#2在基因型DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的情況下刺激T細(xì)胞的增殖。然而，它在基因型DRB1*1001/*1201的情況下不刺激T細(xì)胞增殖。在從EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(Friede等，1996)中得到的DRB1*0401等位基因的情況下描述表位#2的同源的人序列。
表位#3僅呈現(xiàn)為一種長(zhǎng)度變體源自O(shè)KT3重鏈恒定區(qū)194-210的17-mer(表1)。與表位#1類(lèi)似，表位#3含有DRB3等位基因DRB3*0301的錨定基序作為P1錨的I-199、作為P4錨的N-202、作為P6錨的A-204和作為P9錨的A-207。盡管TEPITOPE算法沒(méi)有預(yù)測(cè)出對(duì)于DRB1*0301、*0401、*0701或*1101的表位#3(圖2)，但表位#3在所測(cè)試的全部3種DRB1基因型的情況下能活化T細(xì)胞(圖3)。已有描述，相同表位與鼠MHC II類(lèi)分子H2-A(s)結(jié)合(Rudensky等，1992)。
當(dāng)應(yīng)用TEPITOPE算法預(yù)測(cè)基因型為DRB1*0401/1302情況下OKT3κ輕鏈的表位時(shí)，僅能對(duì)DRB1*0401進(jìn)行一種預(yù)測(cè)，因?yàn)樵撍惴](méi)有包括其它等位基因(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預(yù)測(cè)出11個(gè)表位，然而它們當(dāng)中僅有兩個(gè)是天然加工的肽表位，表現(xiàn)為表位#1和#2(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預(yù)測(cè)出13個(gè)表位，然而它們當(dāng)中沒(méi)有一個(gè)包含表位#3(圖2)。
實(shí)施例2圖1中略述的策略也用于鑒定由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0701/1601的樹(shù)突狀細(xì)胞所遞呈的OKT3肽表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0701/1601限制性O(shè)KT3表位，將表達(dá)HLA-DRB1*0701/1601基因型的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時(shí)，通過(guò)加入TNFα(10ng/ml)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0701/1601結(jié)合配體的序列分析揭示一個(gè)OKT3來(lái)源的表位，其表現(xiàn)為源自O(shè)KT3的10個(gè)肽序列(表2)。表位#4源自κ輕鏈，并在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。
表位#4呈現(xiàn)為10種長(zhǎng)度變體(15-22-mer)肽，其中15-mer源自輕鏈恒定區(qū)168-182(表2)。表位#4包含DRB1*0701等位基因的錨定基序作為P1錨的Y-172、作為P4錨的S-175、作為P6錨的T-177和作為P9錨的L-180。如TEPITOPE算法所示，相同的錨定殘基具有結(jié)合DRB1*0401和DRB1*1101的性能(表2)。通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的潛能證實(shí)表位#1是T細(xì)胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹(shù)突狀細(xì)胞情況下表位#4是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下它不能活化T細(xì)胞。
最近在牛系統(tǒng)中報(bào)道了表位#4，所述牛系統(tǒng)為從血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞得到的且表現(xiàn)為牛等位基因DRB3*2703(Sharif等，2002)。
當(dāng)應(yīng)用TEPITOPE算法預(yù)測(cè)基因型DRB1*0701/*1601情況下OKT3κ輕鏈的表位時(shí)，僅針對(duì)DRB1*0701進(jìn)行預(yù)測(cè)，因?yàn)樵撍惴ú话―RB1*1601等位基因(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預(yù)測(cè)出5個(gè)表位，然而僅僅一個(gè)是天然加工肽表位，表現(xiàn)為表位#4(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預(yù)測(cè)出8個(gè)表位，然而經(jīng)過(guò)對(duì)天然存在肽進(jìn)行分析，它們當(dāng)中沒(méi)有一個(gè)得到支持(圖2)。
實(shí)施例3圖1中略述的策略用于鑒定OKT3中被HLA-DR基因型HLA-DRB1*1101/1202限制性T細(xì)胞所識(shí)別的肽表位。
為了鑒定HLA-DRB1*1101/1202限制性O(shè)KT3表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*1101/1202的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時(shí)，通過(guò)加入TNFα(10ng/ml)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*1101/1202結(jié)合配體的序列分析揭示了2個(gè)OKT3來(lái)源的表位，#1和#3，表現(xiàn)為來(lái)自O(shè)KT3的6個(gè)肽序列(表3)。一個(gè)表位源自κ輕鏈，另一個(gè)表位位于重鏈。在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了與單體型DRB1*1101/1202相關(guān)的兩個(gè)表位。
表位#1呈現(xiàn)為與上述基因型DRB1*0401/*1302情況下相同的15-mer和16-mer肽(參照表1和3)。表位#1包含DRB1*1101等位基因的錨定基序作為P1錨的L-103、作為P6錨的A-108和作為P9錨的A-111。通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的潛能證實(shí)表位#1是T細(xì)胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹(shù)突狀細(xì)胞情況下表位#1是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下它不能活化T細(xì)胞。
來(lái)自O(shè)KT3重鏈恒定區(qū)的表位#3(表1、3)呈現(xiàn)為4種長(zhǎng)度變體194-207的14-mer、194-208的15-mer、194-210的17-mer和194-211的18-mer (表3)。盡管TEPITOPE算法針對(duì)DRB1*1101或1202沒(méi)有預(yù)測(cè)出表位#3(圖2)，但表位#3在測(cè)試的全部3種DRB1基因型情況下可活化T細(xì)胞(圖3)。
當(dāng)應(yīng)用TEPITOPE算法預(yù)測(cè)基因型為DRB1*1101/1202情況下OKT3κ輕鏈的表位時(shí)，僅針對(duì)DRB1*1101進(jìn)行預(yù)測(cè)，因?yàn)樵撍惴ú话ㄆ渌任换?圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預(yù)測(cè)出6個(gè)表位，然而僅僅一個(gè)表位是天然加工肽表位，表現(xiàn)為表位#1(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預(yù)測(cè)出9個(gè)表位，然而它們當(dāng)中沒(méi)有一個(gè)包括表位#3(圖2)。
實(shí)施例4圖1中略述的策略也用于鑒定OKT3中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0301/0401的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的肽表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0301/0401限制性O(shè)KT3表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*0301/0401的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時(shí)，通過(guò)加入TNFα(10ng/ml)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0301/0401結(jié)合配體的序列分析揭示了一個(gè)OKT3源的表位，呈現(xiàn)為源自O(shè)KT3的1個(gè)肽序列(表4)。表位#2來(lái)自κ輕鏈并在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。
表位#2呈現(xiàn)為源自輕鏈恒定區(qū)143-159的17-mer肽(表4)。如上所述(實(shí)施例1)，表位#2包含DRB1*0401等位基因的錨定基序作為P1錨的W-147、作為P4錨的D-150、作為P6錨的S-152。如TEPITOPE算法所示，相同錨定殘基具有結(jié)合DRB1*0301的性能(圖2)。通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的潛能證實(shí)表位#2是T細(xì)胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹(shù)突狀細(xì)胞情況下表位#2是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下表位#2不能活化T細(xì)胞。
應(yīng)用TEPITOPE算法在基因型為DRB1*0301/*0401的情況下預(yù)測(cè)OKT3κ輕鏈的表位(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預(yù)測(cè)出12個(gè)表位，然而它們當(dāng)中僅僅一個(gè)是在天然加工肽表位，表現(xiàn)為表位#2(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預(yù)測(cè)出18個(gè)表位，然而經(jīng)過(guò)對(duì)天然存在肽進(jìn)行分析，它們當(dāng)中沒(méi)有一個(gè)得到支持(圖2)。
實(shí)施例5目前干擾素-β(IFN-β)是治療多發(fā)性硬化的首要療法(Deisenhammer等2000)。目前有三種不同的IFN-β制劑投放市場(chǎng)Avonex、Rebif(二種均為IFN-β-1a)和Betaseron(IFN-β-1b)。其中Betaseron是第一個(gè)投放市場(chǎng)的，由FDA根據(jù)加速批準(zhǔn)程序于1993年批準(zhǔn)。與Avonex和Rebif相比，Betaseron具有異常免疫原性。用Betaseron治療后，多達(dá)28-47％的病人產(chǎn)生抗IFN-β的中和抗體，然而在Avonex治療的病人中僅2-6％產(chǎn)生中和性抗藥物抗體(Deisenhammer等，2000；Bertolotto等，2004)。在該情況中，應(yīng)當(dāng)指出Avonex和Rebif是在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的，其為具有天然氨基酸序列的糖基化蛋白質(zhì)，然而B(niǎo)etaseron是在大腸桿菌(E.Coli)中表達(dá)的，其為具有Met-1缺失和第17位由Cys變成Ser的點(diǎn)突變的非糖基化形式(Mark等，1984；Holliday和Benfield，1997)。迄今為止不清楚這些差異是否是造成免疫原性不同的原因。
圖1中略述的策略用于鑒定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/0701的樹(shù)突狀細(xì)胞所遞呈的表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0101/0701限制性IFN-β-1b表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*0101/0701的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時(shí)，通過(guò)加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0101/0701結(jié)合配體的序列分析揭示了一個(gè)IFN-β-1b來(lái)源的表位，表位#5，其表現(xiàn)為源自IFN-β-1b的3個(gè)肽序列(表5)。在基因型DRB1*0101/1401的環(huán)境下也發(fā)現(xiàn)與基因型DRB1*0101/0701相關(guān)的表位#5(參照表8)。
表位#5呈現(xiàn)為13-mer、16-mer和17-mer的肽，其中13-mer源自蛋白質(zhì)區(qū)44-60(表5)。表位#5包含下列錨定基序作為P1錨的F-49、作為P4錨的E-52、作為P6錨的A-54和作為P9錨的T-57。與此相一致，在體外結(jié)合分析中證明包含表位#5的15-mer的肽對(duì)HLA等位基因DRB1*0101具有強(qiáng)結(jié)合能力(Tangri等，2005)。
實(shí)施例6圖1中略述的策略用于鑒定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/1404的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0101/1404限制性IFN-β-1b表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*0101/1404的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時(shí)，通過(guò)加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0101/1404結(jié)合配體的序列分析揭示了2個(gè)IFN-β-1b來(lái)源的表位，#6和#7，其表現(xiàn)為源自IFN-β-1b的24個(gè)肽序列(表6)。在基因型DRB1*0801的情況下也發(fā)現(xiàn)了表位#6(表7)。在基因型DRB1*0801(表7)、DRB1*0101/1401(表8)和DRB1*1303/1501(表9)的情況下也發(fā)現(xiàn)了表位#7。
表位#6呈現(xiàn)為22種長(zhǎng)度變體(11-19-mer)，其中11-mer源自蛋白質(zhì)區(qū)89-99(表6)。表位#6包含下列錨定基序作為P1錨的Y-91、作為P4錨的I-94、作為P6錨的H-96和作為P9錨的T-99。如TEPITOPE算法預(yù)測(cè)，這些錨定殘基具有結(jié)合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。盡管已經(jīng)顯示包含表位#6的15-mer肽能夠結(jié)合DRB1*0701，但沒(méi)有證據(jù)證明在該HLA情況下能夠使T細(xì)胞活化(Barbosa等，2005)。
表位#7呈現(xiàn)為13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白質(zhì)區(qū)149-161(表6)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。也已經(jīng)顯示包含表位#7的15-mer肽是對(duì)HLA等位基因DRB1*0101、DRB1*1101和DRB1*1501具有強(qiáng)結(jié)合能力的不加選擇的結(jié)合物(Tangri等，2005)。此外，已經(jīng)描述包含表位#7的肽庫(kù)在DRB1*0701背景下誘導(dǎo)T細(xì)胞活化(Barbosa等，2005)。
實(shí)施例7圖1中略述的策略用于鑒定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型HLA-DRB1*0801/0801的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0801/0801限制性IFN-β-1b表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*0801/0801的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時(shí)，通過(guò)加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0801/0801結(jié)合配體的序列分析揭示了2個(gè)IFN-β-1b來(lái)源的表位，其表現(xiàn)為源自IFN-β-1b的22個(gè)肽序列(表7)。在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與基因型DRB1*0801/0801相關(guān)的兩個(gè)表位。
表位#6呈現(xiàn)為17種長(zhǎng)度變體(11-18-mer)，其中11-mer源自蛋白質(zhì)區(qū)89-99(表7)。如上所述，對(duì)于DRB1*1101/1404表位#6包含下列錨定基序作為P1錨的Y-91、作為P4錨的I-94、作為P6錨的H-96和作為P9錨的T-99。如TEPITOPE算法所預(yù)測(cè)，這些錨定殘基具有結(jié)合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。
表位#7呈現(xiàn)為下列5種長(zhǎng)度變體151-161的11-mer、149-161的13-mer、149-162的14-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表7)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
實(shí)施例8圖1中略述的策略用于鑒定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/1401的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的表位。
為了鑒定HLA-DRB1*0101/1401限制性IFN-β-1b表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*0101/1401的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時(shí)，通過(guò)加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*0101/1401結(jié)合配體的序列分析揭示了2個(gè)IFN-β-1b來(lái)源的表位，其表現(xiàn)為源自IFN-β-1b的9個(gè)肽序列(表8)。在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了與基因型DRB1*0101/1401結(jié)合的兩個(gè)表位。
表位#5呈現(xiàn)為7種長(zhǎng)度變體46-60的15-mer、45-60的16-mer、44-60的17-mer、43-60的18-mer、43-61的19-mer、42-60的19-mer和39-60的22-mer(表8)。表位#5包含下列錨定基序作為P1錨的F-49、作為P4錨的E-52、作為P6錨的A-54和作為P9錨的T-57。
表位#7呈現(xiàn)為13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白質(zhì)區(qū)149-161(表8)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
實(shí)施例9圖1中略述的策略用于鑒定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*1303/1501的樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈的表位。
為了鑒定HLA-DRB1*1303/1501限制性IFN-β-1b表位，將表達(dá)基因型HLA-DRB1*1303/1501的樹(shù)突狀細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分化，并以0.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。將5×106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時(shí)，通過(guò)加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。作為對(duì)照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養(yǎng)相同量的樹(shù)突狀細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，兩組樹(shù)突狀細(xì)胞在去污劑TX-100中裂解，并用固定于瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR結(jié)合肽用0.1％TFA洗脫，并通過(guò)2D-LS/MS-MS分析。
對(duì)HLA-DRB1*1303/1501結(jié)合配體的序列分析揭示了1個(gè)IFN-β-1b來(lái)源的表位，其表現(xiàn)為源自IFN-β-1b的3個(gè)肽序列(表9)。在至少2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了與基因型DRB1*1303/1501相關(guān)的兩個(gè)表位。
表位#7呈現(xiàn)為149-161的13-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表9)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
表1.與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3(Orthoclone)表位
表2.與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3(Orthoclone)表位
表3.與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3(Orthoclone)表位
表4.與基因型HLA-DRB1*0301/*0401相關(guān)的OKT-3(Orthoclone)表位
表5.與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關(guān)的干擾素-β-1b表位
表6.與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-β-1b表位
表7.與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-β-1b表位
表8.與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-β-1b表位
表9.與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關(guān)的干擾素-β-1b表位
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>鑒定生物藥物中與免疫原性相關(guān)表位的方法<130>23097<160>87<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>213<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>OKT3輕鏈(κ)<222>(1)..(213)<400>1Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro100 105 110Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly115 120 125Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn145 150 155 160Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr180 185 190Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Asn Glu Cys210<210>2<211>449<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>OKT3重鏈(IgG2a)<222>(1)..(449)<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr115 120 125Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser180 185 190Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser195 200 205Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys210 215 220Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser245 250 255Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp260 265 270Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr275 280 285Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val290 295 300Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu305 310 315 320Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val340 345 350Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr355 360 365Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr370 375 380Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu385 390 395 400Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys405 410 415Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu420 425 430Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly435 440 445Lys<210>3<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>3Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>小家鼠
<220>
<221>表位#1<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>4Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>5<211>13<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>5Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10<210>6<211>14<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>6Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10<210>7<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>7
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10 15<210>8<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>8Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15<210>9<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關(guān)的OKT-3表位<400>9Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr<210>10<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT3表位<400>10Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15
<210>11<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT3表位<400>11Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 15<210>12<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT3表位<400>12Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 15Glu<210>13<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT3表位<400>13Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp
<210>14<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>14Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp Glu<210>15<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>15Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr1 5 10 15Lys Asp<210>16<211>19<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(19)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>16Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
1 5 10 15Lys Asp Glu<210>17<211>20<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(20)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>17Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp20<210>18<211>21<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(21)<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>18Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp Glu20<210>19<211>22<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(22)
<223>與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關(guān)的OKT-3表位<400>19Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu1 5 10 15Thr Leu Thr Lys Asp Glu20<210>20<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>20Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>21<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>21Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>22<211>14<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>22
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala1 5 10<210>23<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>23Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser1 5 10 15<210>24<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>24Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr<210>25<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關(guān)的OKT-3表位<400>25Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15
Thr Lys<210>26<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0301/*0401相關(guān)的OKT-3表位<400>26Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15Leu<210>27<211>13<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<221>表位#5<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>27Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10<210>28<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>28Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu
1 5 10 15<210>29<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>29Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu<210>30<211>11<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(11)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>30Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>31<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>31Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
<210>32<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>32Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>33<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>33Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10<210>34<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>34Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>35<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>35Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys1 5 10 15<210>36<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>36Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>37<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>37Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>38<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>38Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu
1 5 10<210>39<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>39Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>40<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>40Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>41<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>41Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15Lys
<210>42<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>42Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>43<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>43Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>44<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>44Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>45<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>45Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15Glu<210>46<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>46Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>47<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>47Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu<210>48<211>18<212>PRT<213>智人
<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>48Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu<210>49<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(19)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>49Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu Lys<210>50<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>50Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu
<210>51<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(19)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>51Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu Glu<210>52<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>52Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>53<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>53Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>54<211>11<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(11)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>54Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>55<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>55Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>56<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>56Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>57<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位
<400>57Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10<210>58<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>58Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>59<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>59Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>60<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>60Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
<210>61<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>61Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>62<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>62Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>63<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>63Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>64<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>64Leu Ala Asn Val Tyr His G1n Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>65<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>65Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>66<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>66Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>67<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>67Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
1 5 10<210>68<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>68Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu<210>69<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>69Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10 15<210>70<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>70Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15
Leu Glu<210>71<211>11<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(11)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>71Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>72<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>72Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>73<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>73Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr1 5 10<210>74<211>14<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>74Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>75<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>75Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>76<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>76Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 15<210>77<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(16)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位
<400>77Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 15<210>78<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(17)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>78Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu<210>79<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(18)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>79Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu<210>80<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(19)
<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>80Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu Met<210>81<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(19)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>81Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr1 5 10 15Ile Tyr Glu<210>82<211>22<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(22)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>82Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala1 5 10 15Ala Leu Thr Ile Tyr Glu20<210>83<211>13<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>83Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>84<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>84Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>85<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>85Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>86<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關(guān)的干擾素-γ-1b表位
<400>86Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>87<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關(guān)的干擾素-γ-1b表位<400>87Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種鑒定與免疫原性有關(guān)的肽的方法，其包括步驟a)提供以0.1至5μg分子的量表達(dá)抗原遞呈受體(APR)的細(xì)胞，b)將來(lái)自(a)的細(xì)胞與免疫原性肽源接觸，c)從細(xì)胞分離APR分子-免疫原性肽復(fù)合物，d)從APR分子洗脫所結(jié)合的肽，e)鑒定免疫原性肽，f)驗(yàn)證被鑒定為表位的免疫原性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中APR表達(dá)細(xì)胞是MHC II表達(dá)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中MHC II表達(dá)細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中樹(shù)突狀細(xì)胞在其被誘導(dǎo)成熟為樹(shù)突狀細(xì)胞的同時(shí)作為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞暴露于免疫原的潛在源。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中潛在的免疫原來(lái)源屬于包括治療性多肽在內(nèi)的肽，例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、抗體、酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、激素或其片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使用包括用去污劑溶解細(xì)胞和經(jīng)免疫沉淀或免疫親合層析分離抗原遞呈受體與免疫原性肽復(fù)合物的方法，從細(xì)胞分離MHC分子與免疫原性肽的復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在洗脫肽之前，將分離的MHC分子與免疫原性肽的復(fù)合物在超濾管中用水洗滌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中用稀酸將免疫原性肽從MHC分子上洗脫。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中將(d)的所分離免疫原性肽進(jìn)行分級(jí)分離和測(cè)序。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中通過(guò)包括液相層析和質(zhì)譜的方法將所分離免疫原性肽進(jìn)行分級(jí)分離和測(cè)序。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)將從與潛在免疫原來(lái)源接觸的細(xì)胞中鑒定的肽與從未接觸所述來(lái)源的細(xì)胞中分離的那些肽進(jìn)行比較，來(lái)鑒定所分離的免疫原性肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中免疫原性肽是天然加工的免疫原性肽。
13.一種降低多肽免疫原性的方法，包括a)根據(jù)權(quán)利要求1-12所述的方法鑒定多肽的免疫原性肽，b)修飾多肽的相應(yīng)表位，以降低或消除抗原遞呈受體的結(jié)合，c)由此產(chǎn)生具有降低免疫原性潛能或無(wú)免疫原性潛能的經(jīng)修飾的多肽。
14.基本上如前所述、尤其是參照前述實(shí)施例所述的方法和用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定與免疫原性有關(guān)的肽的方法，其包括步驟a)提供能以0.1至5μg分子的量表達(dá)抗原遞呈受體(APR)的細(xì)胞，b)將來(lái)自(a)的細(xì)胞與免疫原性肽源接觸，c)從細(xì)胞分離APR分子－免疫原性肽復(fù)合物，d)從APR分子洗脫所結(jié)合的肽，e)鑒定免疫原性肽，f)驗(yàn)證被鑒定為表位的免疫原性肽。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1877336SQ20061008988
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
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