專利名稱：在分裂停止后的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在分裂停止后的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元中表達(dá)的新65B13基因。在帕金森氏病等神經(jīng)變性疾病(PD)的移植療法中使用的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞可通過(guò)檢測(cè)該基因有效分離。
背景技術(shù)：
多巴胺系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物腦中必需的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、激素分泌調(diào)節(jié)、情感調(diào)節(jié)以及諸如此類的活動(dòng)而言是極為重要的系統(tǒng)。因此，產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)傳遞的異常引起各種神經(jīng)疾病。例如，帕金森氏病(Parkinson’s diseases，PD)是錐體外系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病，它因中腦黑質(zhì)中產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的專一性退化而發(fā)生(Harrison’s Principles of Internal Medicine，第2卷，23版，Isselbacher等編，McGraw-Hill Inc.，NY(1994)，2275-7)?？诜o予L-DOPA(3，4-二羥苯丙氨酸)被作為基本治療方法來(lái)補(bǔ)償該疾病中多巴胺產(chǎn)量的減少；但已知該效果持續(xù)的時(shí)間不能令人滿意。
最近嘗試了一種治療方法，其中含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元始祖細(xì)胞的6-9周齡流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)域被移植，以補(bǔ)償產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的損失(US5690927，Spencer等，(1992)，N.Engl.J.Med.3271541-8；Feed等(1992)N.Engl.J.Med.3271549-55；Widner等(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63；Kordower等(1995)N.Engl.J.Med.3321118-24；Defer等(1996)Brain 11941-50；Lopez-Lozano等(1997)Transp.Proc.29977-80)。然而，除細(xì)胞供給和倫理問(wèn)題之外(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106；Turner等(1993)Neurosurg.331031-7)，這種方法最近因各種其它問(wèn)題受到批評(píng)，這些問(wèn)題包括感染和污染的風(fēng)險(xiǎn)，移植的免疫排斥(Lopez-Lozano等1997)Transp.Proc.29977-980；Widner和Brudin(1988)Brain Res.Rev.13287-324)，以及由于胎兒組織主要依賴于脂類代謝而不是糖酵解造成的低成活率(Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33106)。
為了解決倫理問(wèn)題和供給的短缺，已提出使用例如豬腦皮質(zhì)、層紋(stria)或中腦細(xì)胞的方法(例如，特表平10-508487號(hào)公報(bào)，特表平10-508488號(hào)公報(bào)或特表平10-509034號(hào)公報(bào))。在這些方法中，需要涉及改變細(xì)胞表面抗原(MHCI類抗原)的復(fù)雜操作。因此，使用體外分化系統(tǒng)從非神經(jīng)細(xì)胞例如胚胎干(ES)細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞而不是衍生自流產(chǎn)胎兒的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元被認(rèn)為是具有前景的。將來(lái)使用ES細(xì)胞或患者自身神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行的再生療法的重要性似乎不斷增加。有人提出，通過(guò)同時(shí)移植支持細(xì)胞(Sertoli’s cell)來(lái)進(jìn)行局部免疫抑制的方法，作為消除移植排斥的方法(特表平11-509170號(hào)公報(bào)，特表平11-501818號(hào)公報(bào)，Selaxry和Cameron(1993)Cell Transplant 2123-9)。可以從具有匹配的MHC的親屬獲得移植細(xì)胞，從其它個(gè)體、骨髓銀行或臍帶血銀行獲得骨髓。然而，如果有可能使用患者自己的細(xì)胞，那么排斥反應(yīng)問(wèn)題無(wú)需費(fèi)力便可得以解決。
另一個(gè)問(wèn)題是神經(jīng)元始祖細(xì)胞可能分化成為不均一的細(xì)胞群。在治療帕金森氏病時(shí)，需要選擇性地移植產(chǎn)多巴胺的含有兒茶酚胺的神經(jīng)元。過(guò)去提出的用于治療帕金森氏病的移植細(xì)胞的例子包括紋狀體(Lindvall等(1989)Arch.Neurol.46615-31；Widner等(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63)，衍生自人胎兒神經(jīng)元的無(wú)限增殖化細(xì)胞系(特表平8-509215號(hào)公報(bào)；特表平11-506930號(hào)公報(bào)；特表2002-522070號(hào)公報(bào))，衍生自NT2Z細(xì)胞的人的分裂后神經(jīng)元(特表平9-5050554號(hào)公報(bào))，原始神經(jīng)元(特表平11-509729號(hào)公報(bào))，以及為了產(chǎn)生多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)而用外源基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(特表平2002-504503號(hào)公報(bào)；特表2002-513545號(hào)公報(bào))。然而，其中沒(méi)有一種僅含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元或分化為產(chǎn)多巴胺型細(xì)胞的細(xì)胞。
有人提出，從未分化的細(xì)胞群中選擇性地集中和分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的方法。在該方法中，將表達(dá)熒光蛋白的報(bào)道基因引入細(xì)胞群的各個(gè)細(xì)胞，使之受表達(dá)在產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元中的酪氨酸羥化酶等基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制，然后分離那些發(fā)出熒光的細(xì)胞。觀察到活力狀態(tài)的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元，然后將其集中、分離并鑒定(特表2002-51775號(hào)公報(bào))。該方法需要導(dǎo)入外源基因的步驟，并且，在用于基因療法時(shí)報(bào)道基因的存在引起毒性和免疫原性問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
目前，帕金森氏病(PD)移植療法的主要問(wèn)題之一是，流產(chǎn)胎兒中腦腹側(cè)區(qū)或體外分化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合物?？紤]到神經(jīng)回路形成中的安全性，優(yōu)選使用僅含有目的細(xì)胞類型的分離的細(xì)胞。此外，考慮到腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，一般認(rèn)為使用分離的分裂停止后的神經(jīng)元更好。而且，考慮到細(xì)胞在腦中移植部位的存活，以及它們適當(dāng)形成網(wǎng)絡(luò)的能力，預(yù)期通過(guò)在盡可能早的階段分離前體細(xì)胞可進(jìn)一步改善治療效果。因此，本發(fā)明人旨在分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因。
為了分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因，使用E12.5小鼠中腦腹側(cè)和背側(cè)RNA，通過(guò)改進(jìn)扣除方法(subtraction method)(N-RDA；表現(xiàn)度示差分析法；RDA法(Listsyn NA(1995)Trends Genet.11303-7)，(“Methodfor Homogenizing the Amount of DNA Fragments and Subtraction Method”，日本專利申請(qǐng)2001-184757號(hào)(申請(qǐng)日2001年6月19日))擴(kuò)增具有差異表達(dá)的基因，并分析所擴(kuò)增的基因的序列。結(jié)果得到新基因65B13。使用RACE法確定基因的全長(zhǎng)序列，獲得了兩種同工型，65B13-a和65B13-b。所述同工型的核苷酸序列表示為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4(圖1-4)。
根據(jù)這些基因通過(guò)原位雜交分析表達(dá)的結(jié)果，和通過(guò)比較脊髓生長(zhǎng)標(biāo)記Ki67和成熟標(biāo)記NCAM獲得的表達(dá)模式，認(rèn)為65B13在剛剛停止分裂的神經(jīng)前體細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。此外，中腦中65B13與酪氨酸羥化酶(TH)沿背-腹軸方向的表達(dá)區(qū)域完全一致，后者是產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的標(biāo)記基因。因此認(rèn)為，63B13在剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異地瞬時(shí)表達(dá)(圖10和11)。
使用抗-65B13抗體通過(guò)免疫染色進(jìn)一步證明原位雜交的結(jié)果(圖13)。此外，表達(dá)65B13的細(xì)胞群可使用抗-65B13抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀有效分離(圖14)。
依據(jù)上述結(jié)果，通過(guò)從中腦腹側(cè)區(qū)或含有體外分化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離65B13表達(dá)細(xì)胞，可以將抗-65B13抗體用于獲得純的早期產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞。以這種方式獲得的細(xì)胞僅含有分裂停止后的前體細(xì)胞，并且由于只有目的細(xì)胞類型被分離，這些細(xì)胞即使用于移植療法時(shí)也非常安全。由于使用了最早期的可能的前體細(xì)胞，在其存活率、網(wǎng)絡(luò)形成能力等方面可預(yù)期高的治療效能。此外，在不能用這些分裂結(jié)束后馬上獲得的早期前體細(xì)胞獲得最好的治療效果的情況、以及在需要使用成熟細(xì)胞的情況中，通過(guò)該方法得到的早期前體細(xì)胞可進(jìn)行簡(jiǎn)單地體外培養(yǎng)成熟直至適當(dāng)?shù)姆只A段。因此，可容易地制備適合于靶移植療法的分化階段的材料(圖12)。
此外，純化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞還具有尋找帕金森氏病治療標(biāo)靶、分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因或產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞成熟過(guò)程中階段特異性基因等用途。另外，使用本發(fā)明方法獲得的最早的可能的前體細(xì)胞還可用于闡明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的成熟過(guò)程，以便用成熟作為指標(biāo)來(lái)篩選系統(tǒng)等。
更具體地，本發(fā)明涉及[1]含有選自核苷酸序列(1)到(5)的序列的多核苷酸，其中核苷酸序列編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B13多肽，或其抗原片段(1)含有SEQ ID NO1的第177-第2280個(gè)核苷酸或SEQ ID NO2的第127-第2079個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；(2)編碼氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；(3)編碼缺失信號(hào)序列部分的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；(4)編碼其中缺失、插入、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；和，(5)在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列(1)雜交的核苷酸序列；[2]含有如[1]所述的多核苷酸的載體；[3]含有如[1]所述的多核苷酸或如[2]所述的載體的宿主細(xì)胞；[4]由如[1]所述的多核苷酸編碼的多肽； 如[4]所述多肽的片段，其中所述多肽片段含有至少8個(gè)氨基酸殘基；[6]如[4]所述的多肽或如[5]所述的多肽片段的抗體；[7]編碼如[5]所述的多肽片段的核苷酸鏈；[8]選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的方法，所述方法包括將如[6]所述的抗體與認(rèn)為含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸的步驟；[9]選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的方法，所述方法包括將含有如[4]所述多肽的至少胞外部分的肽與認(rèn)為含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸的步驟；[10]剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞，所述細(xì)胞通過(guò)[8]或[9]所述的方法選擇；[11]分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因以及產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元成熟過(guò)程的各個(gè)階段的特異性基因的方法，其中所述方法包括以下步驟檢測(cè)和分離在如[10]所述的前體細(xì)胞或從所述前體細(xì)胞分化、誘導(dǎo)或增殖得到的細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因；和[12]用成熟作為指標(biāo)進(jìn)行篩選的方法，所述方法包括以下步驟將試驗(yàn)物質(zhì)與如[10]所述的前體細(xì)胞接觸；檢測(cè)由接觸步驟引起的前體細(xì)胞的分化和增殖。
<多核苷酸>
本發(fā)明的多核苷酸可用于通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備抗原，以制備可用于選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的抗體。本發(fā)明的多核苷酸編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B13多肽，并包含SEQID NO1的核苷酸177-2280(圖1和2)，SEQ ID NO2的核苷酸127-2079(圖3和4)，或與這些序列中任何一個(gè)互補(bǔ)的序列。
本文中，“多核苷酸”指含有多個(gè)脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的核苷酸或核苷酸對(duì)的聚合體，并包括DNA、cDNA、基因組DNA、化學(xué)合成DNA和RNA。如果需要，多核苷酸還可包括非天然發(fā)生的核苷酸，例如4-乙酰胞苷、5-(羧基羥基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基辮苷、2’-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、β-D-甘露糖基辮苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫-N6-異戊烯腺苷、N-((9-β-D-核糖呋喃基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)蘇氨酸、N-((9-β-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)蘇氨酸、尿苷-5-羥基乙酸-甲酯、尿苷-5-羥基乙酸、wybutoxosine、假尿苷、辮苷、2-硫基胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)氨基甲?；?蘇氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。
此外，本發(fā)明的多核苷酸編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B13多肽，并包含SEQ ID NO3(圖1、3和5)或SEQ ID NO4(圖2、4和5)描述的氨基酸序列，或它們的互補(bǔ)序列。除核苷酸序列SEQ ID NO1和2外，編碼這種氨基酸序列的核苷酸序列包括那些由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與序列SEQ ID NO1和2有差別的序列?？梢愿鶕?jù)宿主密碼子使用頻率，通過(guò)選擇具有高表達(dá)效率的核苷酸序列，而用遺傳工程技術(shù)設(shè)計(jì)本發(fā)明的多核苷酸來(lái)表達(dá)多肽(Grantham等，(1981)NucleicAcids Res.943-47)。本發(fā)明的多核苷酸還包含編碼缺乏信號(hào)序列部分的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的核苷酸序列。氨基酸序列SEQID NO3或4的最初17個(gè)氨基酸殘基相當(dāng)于信號(hào)序列。
本發(fā)明的多核苷酸還包含一種核苷酸序列，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的序列，其編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B13多肽或其抗原片段，其中在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。眾所周知，含有通過(guò)缺失、插入、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸所得到的氨基酸序列的突變多肽可以保持與原始多肽相同的生物活性(Mark等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-6；Zoller和Smith(1982)Nucleic Acids Res.106487-500；Wang等.(1984)Science 2241431-3；Dalbadie-McFarland等.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA796409-13)本文中，氨基酸取代指將序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基改變?yōu)椴煌愋偷陌被釟埢耐蛔?。?dāng)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列通過(guò)取代而改變時(shí)，如果要保持蛋白質(zhì)的功能，優(yōu)選進(jìn)行保守取代。保守取代是指改變序列，以使它編碼與取代前的氨基酸具有相似特性的氨基酸。氨基酸基于它們的特性可分為非極性氨基酸(Ala，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Val)，不帶電氨基酸(Asn，Cys，Gln，Gly，Ser，Thr，Tyr)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，堿性氨基酸(Arg，His，Lys)，中性氨基酸(Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val)，脂肪族氨基酸(Ala，Gly)，支鏈氨基酸(Ile，Leu，Val)，羥基氨基酸(Ser，Thr)，酰胺類氨基酸(Gln，Asn)，含硫氨基酸(Cys，Met)，芳族氨基酸(His，Phe，Trp，Tyr)，雜環(huán)氨基酸(His，Trp)，亞氨基酸(Pro，4Hyp)等。具體地，為了保持蛋白質(zhì)特性，在Ala，Val，Leu，和Ile；Ser和Thr；Asp和Glu；Asn和Gln；Lys和Arg；以及Phe和Tyr之間取代是優(yōu)選的。突變氨基酸的數(shù)量和位點(diǎn)沒(méi)有具體限制，只要多核苷酸編碼的氨基酸具有65B13抗原性。
編碼在序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的氨基酸序列的多核苷酸，可根據(jù)例如定點(diǎn)誘變的方法制備，這些方法描述于(Molecular Coning，A Laboratory Manual第二版.(ColdSpring Harbor Press(1989))，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley和Sons(1987-1997)；具體是第8節(jié)，1-8.5)，Hashimoto-Goto等(1995)Gene 152271-5，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92，Kramer和Fritz(1987)Method.Enzymol.154350-67，Kunkel(1988)Method.Enzymol.852763-6)等。
本發(fā)明的多核苷酸還可以是含有在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或與這些序列中的任何一個(gè)互補(bǔ)的序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B 13多肽，或其抗原片段。除兩種具有本發(fā)明實(shí)施例中獲得的序列SEQID NO1和2的65B13同工型外，還可能存在其它同工型和等位突變。因此，所述其它同工型和等位突變也包括在本發(fā)明的多肽中。通過(guò)使用由含有SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列組成的多核苷酸探針，以集落雜交、蝕斑雜交或DNA印跡等已知雜交方法，可從衍生自人、小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠、雞、豬、母牛、山羊和綿羊等動(dòng)物的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)獲得這種多肽。參見(jiàn)“Molecular Coning，A Laboratory Manual第二版.”(Cold Spring Harbor Press(1989))的cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法。另外，還可使用商業(yè)購(gòu)得的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。
更具體地，在cDNA文庫(kù)構(gòu)建中，首先通過(guò)胍超速離心(Chirwin等(1979)Biochemistry 185294-5299)或AGPC(Chomczynski和Sacchi(1987)Anal.Biochem.162156-159)等已知技術(shù)，從表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞、器官、組織等中制備總RNA，隨后使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等純化mRNA。還可使用直接制備mRNA的試劑盒，例如QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)。然后，使用反轉(zhuǎn)錄酶從獲得的mRNA合成cDNA。cDNA合成試劑盒例如AMV反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Corporation)也經(jīng)商業(yè)購(gòu)得。還可使用用5’-RACE方法通過(guò)PCR合成和擴(kuò)增cDNA的其它方法(Frohman等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-9002；Belyavsky等(1989)Nucleic Acid Res.172919-32)。此外，為了構(gòu)建含有高百分比全長(zhǎng)克隆的cDNA文庫(kù)，還可使用例如寡-加帽方法等已知技術(shù)(Maruyama和Sugano(1994)Gene 138171-4；Suzuki(1997)Gene 200149-56)。以這種方法獲得的cDNA然后摻入適當(dāng)?shù)妮d體。
本發(fā)明雜交條件的例子包括“2×SSC，0.1％SDS，50℃”，“2×SSC，0.1％SDS，42℃”和“1×SSC，0.1％SDS，37℃”。更嚴(yán)格條件的例子包括“2×SSC，0.1％SDS，65℃”，“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”和“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”。更具體地，使用快速雜交緩沖液的方法(Amersham LifeScience)可以如下完成在68℃預(yù)雜交30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，加入探針使之在68℃1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間形成雜交體，在2×SSC/0.1％SDS中室溫洗滌3次，每次20分鐘，在1×SSC/0.1％SDS中37℃洗滌3次，每次20分鐘，最后在1×SSC/0.1％SDS中50℃洗滌2次，每次20分鐘。這還可使用例如Expresshyb Hybridization Solution(CLONTECH)，通過(guò)在55℃預(yù)雜交30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，加入標(biāo)記探針并在37℃-55℃保溫1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，在2×SSC/0.1％SDS中室溫洗滌3次，每次20分鐘，并用1×SSC/0.1％SDS在37℃洗滌20分鐘1次來(lái)完成。本文中，可通過(guò)提高預(yù)雜交、雜交或第二次洗滌的溫度來(lái)獲得更嚴(yán)格的條件。例如，60℃的預(yù)雜交和雜交溫度可提高到更嚴(yán)格的68℃。除例如緩沖液鹽濃度和溫度等因素外，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員還可整合探針濃度、探針長(zhǎng)度和反應(yīng)時(shí)間等其它因素，以得到本發(fā)明實(shí)施例中獲得的小鼠65B13同工型和等位突變，以及來(lái)自其它生物的對(duì)應(yīng)基因。
關(guān)于雜交步驟的詳細(xì)資料，可查閱參考文獻(xiàn)例如Molecular Cloning，ALaboratory Manual第二版(Cold Spring Harbor Press(1989)；9.47-9.58節(jié))，Current Protocol in Molecular Biology(John Wiley和Sons(1987-1997)；6.3-6.4節(jié))，DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach第二版(Oxford University(1995)；特別是2.10節(jié)的條件)。雜交多核苷酸的例子包括含有與包含SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列具有至少50％或更多，優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％和甚至更優(yōu)選90％(例如95％或更多，或99％)的同一性的核苷酸序列的多核苷酸。這種同一性可通過(guò)BLAST算法確定(Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)?；谶@一算法開發(fā)的程序的例子包括測(cè)定氨基酸序列同一性的BLASTX程序，和測(cè)定核苷酸序列同一性的BLASTN程序(Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)。這些程序可用于本發(fā)明的序列(分析方法的具體例子見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
65B13同工型或等位突變體，以及具有65B13樣結(jié)構(gòu)或功能的其它基因可通過(guò)基于SEQ ID NO1和2的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，使用基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)，從例如人、小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠、雞、豬、母牛、山羊和綿羊等動(dòng)物的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sohs(1987)6.1-6.4節(jié))。
例如，BLAST搜索結(jié)果揭示了功能未知的3種人序列與本發(fā)明小鼠65B13的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)XM_048304，AL136654，BC007312)具有84％的同一性。它們各自的核苷酸序列為SEQ ID NO5、7和9，預(yù)測(cè)的氨基酸序列為SEQ ID NO6、8和10，并被認(rèn)為是小鼠65B13的人同源物。根據(jù)本發(fā)明方法，這種人同源物可用于選擇人產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞。根據(jù)報(bào)道信息，認(rèn)為這三個(gè)序列都是衍生自染色體19上相同基因的序列。這些序列中，兩個(gè)序列AL136654(SEQ ID NO7)和BC007312(SEQID NO9)是cDNA片段，而認(rèn)為第三個(gè)序列XM_048304(SEQ ID NO5)是從基因組預(yù)測(cè)的mRNA序列。這些預(yù)測(cè)的序列具有與本發(fā)明65B13大小相似的ORF，并且預(yù)測(cè)的氨基酸序列與65B13共享84％的同一性。
本發(fā)明的多核苷酸序列可使用常規(guī)序列測(cè)定方法確定。例如，可使用二脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)。此外，還可使用適當(dāng)?shù)腄NA測(cè)序儀分析序列。
<核苷酸鏈>
此外，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多核苷酸互補(bǔ)的包含至少15個(gè)核苷酸的核苷酸鏈。本文中，“互補(bǔ)序列”不僅是指有至少15個(gè)連續(xù)核苷酸完全與模板配對(duì)的那些核苷酸序列，還包括有至少70％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，甚至更優(yōu)選95％或更多(例如97％或99％)的連續(xù)核苷酸與模板配對(duì)的那些核苷酸序列。配對(duì)形成是指鏈形成，其中在模板多核苷酸的核苷酸序列中T(RNA時(shí)為U)對(duì)應(yīng)A，A對(duì)應(yīng)T或U，G對(duì)應(yīng)C，C對(duì)應(yīng)G。可通過(guò)與上述多核苷酸雜交中使用的方法相似的方法測(cè)定同一性。
本發(fā)明這種核苷酸鏈可用做檢測(cè)或分離用探針，或作為擴(kuò)增本發(fā)明多核苷酸的引物。當(dāng)用做探針時(shí)所述核苷酸鏈通常由15-100個(gè)核苷酸組成，優(yōu)選15-35個(gè)，當(dāng)用做引物時(shí)，至少由15個(gè)核苷酸組成，優(yōu)選30個(gè)?？稍O(shè)計(jì)引物，以便在其5’-端加入限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，標(biāo)記等，并且在3’-端加入與靶序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的核苷酸鏈可與本發(fā)明的多核苷酸雜交。而且，細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明多核苷酸的突變可使用這些探針或引物檢測(cè)。某些情況下，這些突變可引起本發(fā)明多肽活性或表達(dá)的異常，因此，認(rèn)為本發(fā)明核苷酸鏈具有疾病診斷等用途。
另外，本發(fā)明核苷酸鏈包括反義核酸和核酶，反義核酸通過(guò)與mRNA或DNA結(jié)合抑制本發(fā)明多核苷酸細(xì)胞表達(dá)，核酶通過(guò)特異性裂解mRNA來(lái)進(jìn)行抑制。
抑制靶基因表達(dá)的反義機(jī)制的例子包括(1)通過(guò)形成三聯(lián)體抑制轉(zhuǎn)錄起始，(2)通過(guò)在由RNA聚合酶形成的局部開環(huán)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)形成雜交抑制轉(zhuǎn)錄，(3)合成過(guò)程中通過(guò)與RNA形成雜交抑制轉(zhuǎn)錄，(4)通過(guò)在內(nèi)含子-外顯子連接區(qū)形成雜交抑制剪接，(5)通過(guò)在剪接體形成位點(diǎn)形成雜交抑制剪接，(6)通過(guò)與mRNA形成雜交抑制mRNA遷移到細(xì)胞質(zhì)，(7)通過(guò)在加帽部位或poly A添加部位形成雜交抑制剪接，(8)通過(guò)在起始因子結(jié)合部位形成雜交抑制翻譯起始，(9)通過(guò)在核糖體結(jié)合部位形成雜交抑制翻譯，(10)通過(guò)在mRNA編碼區(qū)或多核糖體結(jié)合部位形成雜交抑制肽鏈延長(zhǎng)，和(11)通過(guò)在核酸/蛋白質(zhì)作用位點(diǎn)形成雜交抑制基因表達(dá)(Hirashima和Inoue，“New Biochemistry Experiment Course 2，Nucleic Acids IV，Gene Replicationand Expression”，Japanese Biochemical Society編，Tokyo Kagaku Dozin出版，319-347(1993))。
包含于本發(fā)明核苷酸鏈的反義核酸可以是通過(guò)上述(1)-(11)中描述的任何一個(gè)機(jī)制抑制基因表達(dá)的核酸。也就是，它可包含表達(dá)被抑制的靶基因的不但編碼區(qū)而且非編碼區(qū)序列的反義序列?？赏ㄟ^(guò)與允許其表達(dá)的適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列連接使用編碼反義核酸的DNA。反義核酸不需要與靶基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)完全互補(bǔ)，只要它能有效抑制基因表達(dá)。這種反義核酸具有至少15bp或更長(zhǎng)的鏈長(zhǎng)，優(yōu)選100bp或更長(zhǎng)，更優(yōu)選500bp或更長(zhǎng)，一般在3000bp以內(nèi)，優(yōu)選在2000bp以內(nèi)，更優(yōu)選在1000bp以內(nèi)。這種反義核酸與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈優(yōu)選具有90％或更多的同一性，更優(yōu)選95％或更多。這些反義核酸可根據(jù)硫代磷酸鹽(phosphorthionate)方法(Stein(1988)Nucleic Acid Res.163209-3221)使用本發(fā)明的多核苷酸制備。
“核酶”是指具有RNA成分的催化劑的總稱，并且核酶被大致分為大核酶和小核酶。大核酶是酶切核酸磷酸酯鍵的酶，并在反應(yīng)結(jié)束時(shí)帶著5’-磷酸和3’-羥基離開反應(yīng)位點(diǎn)。大核酶進(jìn)一步分成(1)I組內(nèi)含子RNA，它在5’-剪接位點(diǎn)進(jìn)行尿苷起始的反式酯化反應(yīng)，(2)II組內(nèi)含子RNA，它用合成的套索結(jié)構(gòu)進(jìn)行兩步自我剪接反應(yīng)，和(3)RNA酶P的RNA成分，它通過(guò)水解反應(yīng)在其5’端酶切前體tRNA。相反，小核酶是酶切RNA的相對(duì)比較小的結(jié)構(gòu)單元(約40bp)，形成5’-羥基和2’-3’環(huán)狀磷酸。小核酶包括，例如，錘頭型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)和發(fā)卡型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349；Kikuchi和Sassaki(1992)Nucleic Acids Res.196571；H.Kikuchi(1992)Chemistry and Biology 30112)。由于核酶容易改變和合成，所以已知各種修飾方法。例如，通過(guò)設(shè)計(jì)核酶底物結(jié)合部分與近靶位點(diǎn)的RNA序列互補(bǔ)，可制備識(shí)別和酶切靶RNA中的核苷酸序列UC、UU或UA的錘頭型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225；M.Koizumi和E.Ohtsuka(1990)Protein，Nucleic Acid，和Enzyme 352191；Koizumi等(1989)Nucleic Acid Res.177059)。發(fā)卡型核酶也可使用已知的方法設(shè)計(jì)和制備(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acid Res.196571；H.Kikuchi(1992)Chemistry and Biology 30112)。
包含于本發(fā)明核苷酸鏈中的反義核酸和核酶也可用做衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等的病毒載體，使用脂質(zhì)體的非病毒載體，或裸DNA，以使用基因療法的回體或體內(nèi)方法控制細(xì)胞中基因表達(dá)。
本發(fā)明核苷酸鏈的核苷酸序列可通過(guò)相同于上述多核苷酸使用方法證實(shí)。
<載體>
本發(fā)明提供含有本發(fā)明多核苷酸的載體。本發(fā)明載體用于在宿主細(xì)胞中攜帶本發(fā)明的多核苷酸，或者用于表達(dá)由所述多核苷酸編碼的多肽。所述載體包括各種載體，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體、克隆載體和表達(dá)載體(Molecular Cloning，A Laboratory Manual第二版，Cold Spring HarborPress(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987))。在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸通過(guò)與調(diào)節(jié)序列下游連接在宿主細(xì)胞中表達(dá)，該細(xì)胞中導(dǎo)入了本發(fā)明的載體。本文中，“調(diào)節(jié)序列”包括原核宿主細(xì)胞情況下的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子，以及真核宿主細(xì)胞情況下的啟動(dòng)子和終止子，在某些情況下，還可包括反式激活蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的poly A信號(hào)、剪接和多腺苷酸化信號(hào)及其它。這種調(diào)節(jié)序列包含與之連接的多核苷酸表達(dá)所需的所有成分。另外，本發(fā)明的載體優(yōu)選包含選擇標(biāo)記。此外，將細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔或當(dāng)宿主是革蘭氏陰性微生物時(shí)的胞外周質(zhì)或胞外區(qū)所需的信號(hào)肽，也可通過(guò)與目的多肽連接摻入表達(dá)載體。這種信號(hào)肽可包括在天然發(fā)生的65B13中可見(jiàn)的17個(gè)氨基酸殘基。換句話說(shuō)，它可以是衍生自不均一蛋白的信號(hào)肽。此外，可加入接頭，且需要時(shí)可插入起始(ATG)或終止密碼子(TAA、標(biāo)記或TGA)。
本發(fā)明載體優(yōu)選表達(dá)載體?！氨磉_(dá)載體”是指能體外表達(dá)在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體中編碼的多肽的構(gòu)建物。本發(fā)明的表達(dá)載體包括克隆載體、雙運(yùn)載體、整合載體等。表達(dá)過(guò)程包括將包含于表達(dá)載體上的編碼序列轉(zhuǎn)錄為可翻譯的mRNA，翻譯mRNA為本發(fā)明的多肽，在某些情況下，表達(dá)的多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外周胞質(zhì)或胞外區(qū)。
pBEST(Promega)是能體外表達(dá)多核苷酸的載體的例子。另外，能在例如E.coli等的原核細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的啟動(dòng)子的例子包括PL、araB(Better等.(1988)Science 2401041-3)、LacZ(Ward等.(1989)Nature 341544-6；Ward等.(1992)FASEB J.62422-7)、trp、tac和trc(lac和trp的融合)。此外，也可使用衍生自trpA、噬菌體和rmB核糖體RNA的終止子。并且，在E.coli中使用的載體優(yōu)選具有在宿主內(nèi)擴(kuò)增載體的“ori”，以及用于選擇轉(zhuǎn)化宿主的標(biāo)記基因。優(yōu)選使用抗藥基因，這使得宿主通過(guò)例如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素和氯霉素等藥物而被識(shí)別。可使用pelB信號(hào)序列，特別是如果多肽將分泌到外周胞質(zhì)時(shí)(Lei等.(1987)J.Bacteriol.1694379)。例子包括M13載體、pUC載體、pBR322、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、pEGFP、pBluescript(Stra標(biāo)記ene)和pET(Invitrogen；該載體的優(yōu)選宿主是表達(dá)T7聚合酶的BL21)。另外，亞克隆或切除載體可具體通過(guò)pGEM-T、pDIRECT和pT7說(shuō)明。
除E.coli外細(xì)菌宿主的例子是桿菌，載體例子包括pUB110和pc 194載體。具體例子包括衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的pPL608和pKTH50。還開發(fā)了載體用于宿主細(xì)菌，例如，假單胞菌屬的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)，短桿菌屬(Brevibacterium)例如乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(pAJ43(Gene 39281(1985)等))，棒桿菌屬(Corynebacterium)例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)(pCS 11(未經(jīng)審查而出版的日本專利申請(qǐng)Sho57-183799)；pCB101(Mol.Gen.Genet.196175(1984)，等))，鏈球菌屬(Streptococcus)(pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26239(1985))；pGK1(Appl.Environ.Microbiol.5094(1985))等)，乳桿菌屬(Lactobacillus)(pAMβ1(J.Bacteriol.137614(979)，等))，紅球菌屬(Rhodococcus)例如紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)(J.Gen.Microbiol.1381003(1992))，和鏈霉菌屬(Streptomyces)例如變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)和弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)(參見(jiàn)Genetic Manipulation of StreptomycesALaboratory Manual，Hopwood等，Cold Spring Harbor Laboratories(1985；pIJ486(Mol.Gen.Genet.203468-478(1986))，pKC 1064(Gene 10397-9(1991))，pUWL-KS(Gene 165149-50(1995)))。微生物宿主中有用的載體見(jiàn)文獻(xiàn)例如“Basic Microbiology Course 8-Genetic Engineering”(Kyoritsu Publishing)。可利用例如氯化鈣方法(Mandel and Higa(1970)J.Mol.Biol.53158-162；Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166557-580)和電穿孔等技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主。
此外，真核細(xì)胞宿主中的表達(dá)調(diào)控元件通過(guò)酵母宿主的AOX1和GAL1啟動(dòng)子舉例說(shuō)明。衍生自酵母的表達(dá)載體的例子包括Pichia Expression Kit(Invitrogen)、pNV11和SP-Q01?？捎糜诮湍傅妮d體詳細(xì)描述于例如Adv.Biochem.Eng.4375-102(1990)和Yeasr 8423-88(1992)中。更具體地，載體例如YRp、Yep、Ycp和Yip可用于酵母菌屬(Saccharomyces)，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。允許插入大量基因拷貝并可穩(wěn)定保持插入基因的整合載體(例如EP537456)特別有用。其它載體的例子包括衍生自釀酒酵母的2μm載體、pKD 1載體(J.Bacteriol.145382-90(1981)，pGK11-衍生載體、和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)例如乳克魯維酵母(kluyveromyces lactis)等克魯維酵母菌自主復(fù)制基因KARS載體；Mol.Cell.Biol.680(1986)中描述的載體和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的pAUR224(Takara Shuzo)；Zygosaccharomyces屬的pSB3-衍生載體(NucleicAcids Res.134267(1985))；描述于文獻(xiàn)，例如Yeast 7431-43(1991)，Mol.Cell.Biol.53376(1985)和Nucleic Acids Res.153859(1987)中的Pichia例如Pichia angusta和Pichia pastoris的載體；描述于特開平8-173170中的載體，或使用衍生自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的ARS(Agri.Biol.Chem.5115871987))的麥芽糖假絲酵母、白色念珠菌(C.albicans)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)的載體；描述于Biotechnology 7283-7(1989)中Trend中的曲霉屬(Aspergillus)例如黑曲霉(Aspergillus niger)、和米曲霉(A.oryzae)的載體；和木霉菌屬(Trichoderma)中使用衍生自胞外纖維素酶基因的啟動(dòng)子的載體(Bio/technology 7596-603(1989))。
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它動(dòng)物細(xì)胞宿主，可使用腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufman等(1989)Mol.Cell.Biol.9946)、CAG啟動(dòng)子(Niwa等(1991)Gene108193-200)、CMV立即早期啟動(dòng)子(Seed and Aruffo(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843365-9)、EF1α啟動(dòng)子(Mizushima等(1990)Nucleic Acids Res.185322；Kim等(1990)Gene 91217-23)、HSV TK啟動(dòng)子、SRα啟動(dòng)子(Takebe等(1988)Mol.Cell.Biol.8466)、SV40啟動(dòng)子(Mulligan等(1979)Nature 277108)、SV40早期啟動(dòng)子(Genetic Engineering Vol.3，Williamson編，Academic Press(1982)83-141)、SV40晚期啟動(dòng)子(Gheysen and Fiers(1982)J.Mol.Appl.Genet.1385-94)、RSV(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus))-LTR啟動(dòng)子(Cullen(1987)Methods Enzymol.152684-704)、MMLV-LTR啟動(dòng)子、CMV增強(qiáng)子、SV40增強(qiáng)子和珠蛋白內(nèi)含子等。
此外，載體優(yōu)選包含抗藥基因以允許細(xì)胞通過(guò)藥物例如新霉素或G418識(shí)別。為了提高細(xì)胞內(nèi)基因拷貝的數(shù)量，拷貝數(shù)可通過(guò)使用氨甲喋呤(MTX)在例如核酸合成途徑中缺損的CHO宿主中，使用具有DHFR基因以補(bǔ)償所述缺損的載體例如pCHOI擴(kuò)增。另一方面，為了瞬時(shí)表達(dá)基因，在其染色體上具有SV40T抗原基因的COS細(xì)胞可用做宿主，可使用具有SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體，例如pcD、或具有腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)、多形瘤病毒等的復(fù)制起點(diǎn)的載體。此外，編碼氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)、胸苷激酶(TK)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)等的基因可用做增加基因拷貝數(shù)量的選擇性標(biāo)記。已知適當(dāng)?shù)妮d體例子是Okayama-Berg表達(dá)載體pcDV1(Pharmacia)、pCDM8(Nature 329840-2(1987))、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCOBRL)、pSV2dhfr(Mol.Cell.Biol.1854-64(1981))、pEF-BOS(Nucleic AcidsRes.185322(1990))、pCEP4(Invitrogen)、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13、和pME18S(Mol.Cell.Biol.8466-72(1988))。
具體地，在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明多核苷酸使用的載體的例子包括腺病毒載體例如pAdexlcw和反轉(zhuǎn)錄病毒載體例如pZIPneo。載體可使用如下方法導(dǎo)入宿主，例如腺病毒法、電穿孔法(Cytotechnology 3133(1990))，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法(Cationic Liposome DOTAP(Boehringer Mannheim)等)，導(dǎo)入使用帶正電的聚合體、靜電型脂質(zhì)體法、內(nèi)型脂質(zhì)體法、基因槍法、脂質(zhì)體法、脂轉(zhuǎn)染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413(1987))、磷酸鈣法(未經(jīng)審查的而出版的日本專利申請(qǐng).Hei 2-227075號(hào))、受體-介導(dǎo)的基因?qū)敕?、反轉(zhuǎn)錄病毒法、DEAE葡聚糖法、病毒-脂質(zhì)體法(Experimental MedicineSupplement，″Basic Technology of Gene Therapy″，Yodosha(1997)；Experimental Medicine Supplement，″Experimental Method of GeneIntroduction and Expression Analysis″，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.931458-64(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-20(1996)；Molecular Medicine 301440-8(1993)；Experimemal Medicine 121822-6(1994)；Protein，Nucleic acid，和Enzyme 421806-13(1997)；Circulation 92(增刊II)479-82(1995))，和DNA直接轉(zhuǎn)化法。還可使用用衍生自除腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒外的其它病毒的病毒載體制備的載體，這樣的病毒例如腺伴隨病毒、新培斯病毒(Sindbisvirus)、仙臺(tái)病毒(Sendai vims)、披膜病毒(Togavirus)、副粘病毒(Paramyxovirus)、痘病毒(poxvirus)、、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovims)、皰疹病毒(herpes virus)、慢病毒(lentivirus)和痘苗病毒(vaccinia virus)?；铙w給藥可使用回體或體內(nèi)方法進(jìn)行。
另外，昆蟲表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)不均一多肽的系統(tǒng)也是已知的。例如，外源基因可使用苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(Autographa californianucleopolyhedrosis virus)(AcNPV)作為載體，在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞或粉蚊夜蛾(Trichoplusia)幼蟲細(xì)胞中表達(dá)。本文中，將目的外源基因克隆到病毒的非必需區(qū)。例如，它可在多角體蛋白啟動(dòng)子控制下與區(qū)域連接。在這種情況下，多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒，目的多肽在已用病毒感染的草地夜蛾、粉蚊夜蛾幼蟲等細(xì)胞中表達(dá)(Smith(1983)J.Virol.46584；Engelhard(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-7)。其它已知的昆蟲細(xì)胞-衍生的表達(dá)載體的例子包括Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bigco BRL)和pBacPAK8。
當(dāng)植物細(xì)胞用做宿主時(shí)，例如，可使用利用花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子的載體。將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的已知方法包括PEG、電穿孔、土壤桿菌方法和基因槍方法。
DNA插入載體可使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在連接酶反應(yīng)中進(jìn)行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987)11.4-11.11節(jié)；Molecular Cloning，A Laboratory Manual第二版，Cold Spring HarborPress(1989)5.61-5.63節(jié))。
<宿主>
本發(fā)明提供包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主。可使用體外或體內(nèi)制備系統(tǒng)制備本發(fā)明的多肽。本發(fā)明宿主包括古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳動(dòng)物原核和真核細(xì)胞。本發(fā)明宿主在其細(xì)胞中包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。只要多核苷酸不在宿主細(xì)胞基因組天然發(fā)生的位置上，所述多核苷酸可由其自身的啟動(dòng)子調(diào)控，摻入宿主基因組，或維持染色體外結(jié)構(gòu)。
細(xì)菌宿主的例子包括屬于大腸桿菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)或芽胞桿菌(Bacillus)的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌，例如E.coli(JM109，DH5α，HB101和XL1Blue)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
真核生物宿主的例子包括真菌細(xì)胞例如酵母、高等植物(煙草)(Nicotiana tabacum)衍生細(xì)胞、昆蟲(果蠅(Drosophila)S2、草地夜蛾(Spodoptera)Sf9、Sf21、Tn5)、魚類、兩棲類(非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocytes)(Valle等(1981)Nature 291358-40)、爬行類、鳥類和哺乳類(CHO(J.Exp.Med.108945(1995)。其中，包括基因缺陷型dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-20(1980))和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 601275(1968))、COS、Hela、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤細(xì)胞)、骨髓瘤、非洲綠猴腎細(xì)胞株系(Vero)、Namalwa、Namalwa KJM-1和HBT5637(未經(jīng)審查而出版的日本專利申請(qǐng)Sho 63-299號(hào))，和植物(馬鈴薯、煙草、玉米、稻、油菜、大豆、番茄、小麥、大麥、黑麥、苜蓿和大麻)。除屬于糖酵母菌屬(Saccharomyces)的釀酒酵母，和屬于畢赤酵母屬(Pichia)的酵母外，使用真菌作為宿主的表達(dá)系統(tǒng)，例如屬于曲霉屬的黑曲霉細(xì)胞也是已知的。
將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可使用如下方法進(jìn)行，例如電穿孔(Chu et al.(1987)Nucleic Acids Res.151311-26)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體方法、電脈沖穿孔(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987)9.1-9.9節(jié))、使用顯微玻管直接注射、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染法(Derijard(1994)Cell 71025-37；Lamb(1993)Nature Genetics 522-30；Rabindran等.(1993)Science 259230-4)，脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)方法(GIBCO-BRL)，磷酸鈣方法(Chen和Okayama(1987)Mol.Cell.Biol.72745-52)，DEAE葡聚糖方法(Lopata等.(1984)Nucleic Acids Res.125707-17；Sussman和Milman(1985)Mol.Cell.Biol.41642-3))和FuGene6試劑(Boehringer-Mannheim)。
<多肽和多肽片段>
本發(fā)明的“多肽”是指由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肽多聚體。優(yōu)選的例子包括具有氨基酸序列SEQ ID NO3或4的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可包含天然產(chǎn)生或修飾的氨基酸殘基。氨基酸殘基修飾的例子包括?；饔?、乙酰化作用、酰胺化作用、精氨?；饔谩PI錨形成、交聯(lián)、γ-羧基化作用、環(huán)化作用、共價(jià)交聯(lián)形成、糖基化作用、氧化作用、脂類或脂肪衍生物的共價(jià)聯(lián)結(jié)、胱氨酸形成、二硫鍵形成、硒?；?selenoylation)、脫甲基作用、蛋白質(zhì)片段化處理、核苷酸或核苷酸衍生物共價(jià)聯(lián)結(jié)、羥基化作用、焦谷氨酸形成、黃素共價(jià)聯(lián)結(jié)、異戊二烯化、與血紅素部分共價(jià)聯(lián)結(jié)、磷脂酰肌醇的共價(jià)聯(lián)結(jié)、甲?；饔?、豆蔻酰化、甲基化作用、遍在蛋白化、碘化作用、消旋作用、ADP-核糖基化、硫酸鹽化和磷酸化。此外，本發(fā)明多肽包括含有信號(hào)肽部分的前體，缺少信號(hào)肽部分的成熟蛋白，和用其它肽序列修飾的融合蛋白。添加至本發(fā)明多肽的肽序列可以選自，有利于用諸如pcDNA3.1/Myc-His載體(Invitrogen)純化蛋白質(zhì)的序列，或在重組蛋白制備中賦予穩(wěn)定性的序列。這種序列的例子是流感病毒血凝素(HA)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、物質(zhì)P、多組氨酸標(biāo)記(例如6×His和10×His)、蛋白質(zhì)C片段、麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP)、免疫球蛋白恒定區(qū)、α-微管蛋白片段、β-半乳糖苷酶、B-標(biāo)記、c-myc片段、E-標(biāo)記(單克隆噬菌體上的表位)、FLAG(Hopp等.(1988)Bio/Technol.61204-10)、lck標(biāo)記、p18HIV片段、HSV-標(biāo)記(人單純皰疹病毒糖蛋白)、SV40T抗原片段、T7-標(biāo)記(T7基因10蛋白)、和VSV-GP片段(水泡性口炎病毒糖蛋白)。
此外，本發(fā)明還提供本發(fā)明多肽的片段。本發(fā)明多肽片段與本發(fā)明多肽的部分相同，含有至少8個(gè)氨基酸殘基或更多(例如8、10、12或15個(gè)氨基酸殘基或更多)。特別優(yōu)選的片段可以是缺少氨基端、羧基端和跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽片段。本發(fā)明多肽片段包括含有α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、α-兩親性區(qū)、β-折疊和β-折疊形成區(qū)、β-兩親性區(qū)、底物結(jié)合區(qū)、高抗原指數(shù)區(qū)、螺旋(coil)和螺旋形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)和表面形成區(qū)。本發(fā)明多肽片段可以是任何片段，只要它具有本發(fā)明多肽的抗原性。多肽的抗原決定位點(diǎn)可使用分析氨基酸序列的蛋白疏水性和親水性的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157105-22)，或二級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47251-76)預(yù)測(cè)，并可使用計(jì)算機(jī)程序證實(shí)(Anal.Biochem.151540-6(1985)，或PEPSCAN方法，其中短肽合成后證實(shí)其抗原性(特表Sho 60-500684)。
本發(fā)明多肽或多肽片段可使用已知的遺傳重組技術(shù)或化學(xué)合成制備。當(dāng)使用遺傳重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽或多肽片段時(shí)，根據(jù)選擇的宿主類型，產(chǎn)生的多肽可能經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)糖基化作用，并可能分子重量、等電點(diǎn)等不同。通常，當(dāng)多肽使用原核生物細(xì)胞例如E.coli作為宿主表達(dá)時(shí)，得到的多肽以具有與原始多肽的N端附著的蛋氨酸殘基的形式制備。由于宿主細(xì)胞的這種差別形成的具有不同結(jié)構(gòu)的多肽也包含于本發(fā)明的多肽中。
<多肽制備>
體外制備多肽時(shí)，可在體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中用例如體外翻譯方法制備多肽(Dasso and Jackson(1989)Nucleic Acids Res.173129-44)。相反，當(dāng)使用細(xì)胞制備多肽時(shí)，首先從上述宿主中選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞宿主，然后用目的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨后，可培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以獲得目的多肽。使用已知適于所選細(xì)胞宿主的方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，當(dāng)選擇動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，使用例如DMEM(Virology 8396(1959))、MEM(Science 122501(1952))、RPMI1640(J.Am.Med.Assoc.199519(1967))、199(Proc.Soc.Biol.Med.731(1950))或IMDM培養(yǎng)基，在pH約6-8和溫度為30℃-40℃培養(yǎng)約15-200小時(shí)，并在需要時(shí)加入血清，例如胎牛血清(FCS)。另外，若需要，在培養(yǎng)過(guò)程中更換、充氣或攪拌培養(yǎng)基。
另一方面，為了建立體內(nèi)多肽制備系統(tǒng)，將目的DNA導(dǎo)入動(dòng)物或植物，使多肽在體內(nèi)制備。已知?jiǎng)游锵到y(tǒng)的例子(Lubon(1998)Biotechnol.Annu.Rev.41-54)包括哺乳動(dòng)物例如山羊、豬、綿羊、小鼠和母牛，昆蟲例如蠶(Susumu(1985)Nature 315592-4)。此外，在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中也可使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
例如，當(dāng)在山羊奶中分泌目的多肽時(shí)，可以將編碼多肽的DNA與編碼蛋白(例如β-酪蛋白)的DNA連接，使目的多肽的融合蛋白在羊奶中特異性表達(dá)。接著，將編碼融合蛋白的DNA導(dǎo)入山羊胚胎。然后將攜帶所述DNA的胚胎送回雌山羊的子宮。由該雌山羊產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因山羊或它們的子代在其羊奶中分泌目的多肽。需要時(shí)也可給予激素以提高羊奶的產(chǎn)量(Ebert et al.(1994)Bio/Technology 12699-702)。
使用例如煙草等植物的轉(zhuǎn)基因植物多肽制備系統(tǒng)是已知的。首先，將編碼目標(biāo)多肽的DNA摻入植物表達(dá)載體例如pMON530，然后將所述載體導(dǎo)入細(xì)菌中，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后用攜帶所述DNA的細(xì)菌感染植物，例如煙草(Nicotina tabacum)，使植物體再生，目的多肽可從獲得的轉(zhuǎn)基因植物的葉中分離(Julian等(1994)Eur.J.Immunol.24131-8)。其它成熟方法的例子包括，使用PEG將DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，隨后使植物體再生的方法(Gene Transfer to Plants，Potrykus和Spangenberg編(1995)66-74適合于印度水稻(Indian rice)變種)，使用電脈沖將DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，隨后使植物體再生的方法(Toki等.(1992)Plant Physiol.1001503-7；適合于日本水稻(Japanese rice)變種)，用基因槍法將DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，隨后使植物體再生的方法(Christou等.(1991)Bio/Technology 9957-62)，和通過(guò)土壤桿菌將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，隨后使植物體再生的方法(Hiei等(1994)Plant J.6271-82)。植物再生方法參見(jiàn)Toki等(1995)Plant Physiol.1001503-7。
一旦獲得轉(zhuǎn)基因植物，產(chǎn)生本發(fā)明多肽的植物宿主可使用植物的種子、果實(shí)、塊莖、根、根莖、插條、愈傷組織或原生質(zhì)體以相同的方式繁殖。
通常，如果多肽在細(xì)胞外分泌，通過(guò)基因重組技術(shù)制備的本發(fā)明多肽可從培養(yǎng)基中回收，或從轉(zhuǎn)基因生物的體液中回收。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)制備時(shí)，將細(xì)胞溶解并從溶解產(chǎn)物中回收多肽。然后通過(guò)適當(dāng)結(jié)合已知的蛋白質(zhì)純化方法來(lái)純化目的多肽，所述方法例如鹽析、蒸餾、層析、凝膠電泳、凝膠過(guò)濾、超濾、重結(jié)晶、酸提取、滲析、免疫沉淀、溶劑沉淀、溶劑提取和硫酸銨或乙醇沉淀。層析的例子包括離子交換層析，例如陰離子或陽(yáng)離子交換層析、親和層析、反相層析、吸收層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析、羥基磷灰石層析、磷酸纖維素層析、和凝集素層析(Strategies for ProteinPurification and CharacterizationA Laboratory Course Manual，Marshak等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。層析可使用液相層析例如HPLC或FPLC進(jìn)行。
另外，還可純化和獲得天然產(chǎn)生的多肽。例如，使用下文中描述的本發(fā)明多肽的抗體通過(guò)親和層析純化多肽(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons(1987)16.1-16.19節(jié))。另外，GST-融合蛋白可使用谷胱甘肽柱進(jìn)行純化，或組氨酸融合蛋白可使用鎳柱純化。當(dāng)以融合蛋白的形式產(chǎn)生本發(fā)明多肽時(shí)，可以在純化后根據(jù)需要，用凝血酶或因子X(jué)a切掉不需要的部分。此外，需要時(shí)，還可使用例如胰凝乳蛋白酶、葡糖苷酶、胰蛋白酶、蛋白激酶、和賴氨酰內(nèi)肽酶。
除上述合成和基因工程技術(shù)外，本發(fā)明多肽片段還可使用適當(dāng)?shù)拿咐珉拿竿ㄟ^(guò)酶切本發(fā)明多肽來(lái)制備。
<抗體>
本發(fā)明還提供本發(fā)明多肽或多肽片段的抗體。本發(fā)明抗體也包含多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFV)(Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83；The Pharmacology of Monoclonal Antibody，113卷，Rosenburg和Moore編，Springer Verlag(1994)269-315)，人源化抗體、多特異性抗體(LeDoussal等(1992)Int.J.Cancer Suppl.758-62；Paulus(1985)Behring Inst.Mitt.78118-32；Millstein和Cuello(1983)Nature 305537-9；Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)，和抗體片段例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc、和Fv。此外，需要時(shí)，本發(fā)明抗體還可被PEG等修飾。本發(fā)明抗體還可以是與β-半乳糖苷酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、GST、綠色熒光蛋白(GFP)等融合的蛋白，從而能在不使用第二抗體的情況下進(jìn)行檢測(cè)。此外，抗體可以用生物素等標(biāo)記，以便能使用抗生物素蛋白、鏈抗生物素蛋白進(jìn)行回收。
本發(fā)明抗體可使用本發(fā)明多肽，其片段，或細(xì)胞制備，作為致敏抗原，所述細(xì)胞是表達(dá)本發(fā)明多肽或多肽片段的細(xì)胞。另外，本發(fā)明短肽或其片段也可通過(guò)與例如牛血清清蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole-limpet hemocyanin)和卵清蛋白等載體偶聯(lián)用做免疫原。此外，本發(fā)明多肽或其片段可與已知佐劑例如鋁佐劑、弗氏完全(或不完全)佐劑或百日咳桿菌佐劑等組合使用，以增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。
將本發(fā)明多肽或其片段與所需佐劑偶聯(lián)，用其免疫哺乳動(dòng)物，可以從該免疫動(dòng)物的血清中獲得多克隆抗體。對(duì)所用的哺乳動(dòng)物沒(méi)有具體限制，典型的例子包括嚙齒動(dòng)物、兔類動(dòng)物(lagomorph)和靈長(zhǎng)類動(dòng)物。具體的例子包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠，兔類動(dòng)物例如兔，以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物例如猴，包括食蟹猴、獼猴、狒狒和黑猩猩。動(dòng)物免疫如下進(jìn)行將致敏抗原在磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水中適當(dāng)稀釋并懸浮，根據(jù)需要與佐劑混合直至乳化，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射或皮下注射。與弗氏不完全佐劑混合的致敏抗原優(yōu)選每4-21天給予幾次。可用常規(guī)方法測(cè)定血清中目標(biāo)抗體的水平來(lái)證實(shí)抗體的生成。最后，血清本身可用做多克隆抗體，或它可進(jìn)一步純化。具體方法參見(jiàn)，例如“現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”(Current Protocols inMolecular Biology)(John Wiley和Sons(1987)11.12-11.13節(jié))。
可以從按照上述方式免疫的動(dòng)物體內(nèi)取脾，從脾中分離免疫細(xì)胞，用聚乙二醇等使這些免疫細(xì)胞與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合，建立雜交瘤，從而產(chǎn)生單克隆抗體。細(xì)胞融合可依據(jù)Milstein方法進(jìn)行(Galfre and Milstein(1981)Methods Enzymol.733-46)。本文中，適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞可以是允許對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)選擇的細(xì)胞。當(dāng)使用這種骨髓瘤細(xì)胞時(shí)，融合的雜交瘤可以通過(guò)在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)來(lái)選擇，這種培養(yǎng)基可以破壞除融合細(xì)胞以外的其它細(xì)胞。接著，從已建立的雜交瘤中選出產(chǎn)生抗本發(fā)明多肽或其片段的抗體的克隆。隨后，將選出的克隆導(dǎo)入小鼠等的腹腔，收集腹水以獲得單克隆抗體。具體方法還可參見(jiàn)“現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”(John Wiley和Sons(1987)11.4-11.11節(jié))。
雜交瘤也可以如下獲得將已被EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞在體外用免疫原致敏，使致敏的淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞(例如U266)融合，獲得產(chǎn)生人抗體的雜交瘤(特開昭63-17688號(hào)公報(bào))。還可以用人抗體基因所有組成部分免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，產(chǎn)生抗體生成細(xì)胞，來(lái)獲得人抗體(WO92/03918；WO93-02227；WO94/02602；WO94/25585；WO96/33735；WO96/34096；Mendez等(1997)Nat.Genet.15146-156，等)。不使用雜交瘤的方法例如是，將癌基因?qū)氘a(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞等無(wú)限增殖化免疫細(xì)胞中。
還可通過(guò)基因重組技術(shù)制備抗體(參見(jiàn)Borrebaeck和Larrick(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers Ltd.，UK)。從雜交瘤或抗體生成細(xì)胞(例如致敏淋巴細(xì)胞)克隆出編碼抗體的基因。將獲得的基因插入適當(dāng)載體，將載體導(dǎo)入宿主，然后培養(yǎng)宿主以產(chǎn)生抗體。這種重組載體也包括在本發(fā)明的抗體中。重組抗體的典型例子包括，含有非人抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)的嵌合抗體，以及含有非人抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、人抗體構(gòu)架區(qū)(FR)和人抗體恒定區(qū)的人源化抗體(Jones等(1986)Nature 321522-5；Reichmann等(1988)Nature 332323-9；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-6；；Methods Enzymol.20399-121(1991))。
本發(fā)明抗體片段可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶處理前述的多克隆或單克隆抗體來(lái)制備?；蛘?，抗體片段可用編碼抗體片段的基因通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備(參見(jiàn)Co等，(199)J.Immunol.1522968-76；Better和Horwitz(1989)Methods Enzymol.178476-96；Pluckthun and Skerra(1989)Methods Enzymol.178497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol.121652-63；Rousseaux等(1986)121663-9；Bird and Walker(1991)TrendsBiotechnol.9132-7)。
本發(fā)明的多特異性抗體包括雙特異性抗體(BsAb)、二體抗體(diabodies，Db)等。多特異性抗體k可以如下制備，例如(1)將具有不同特異性的抗體用不同類型的雙功能接頭化學(xué)偶聯(lián)(Paulus1985))Behring Inst.Mill.78118-32)，(2)使分泌不同單克隆抗體的雜交瘤融合(Millstein和Cuello(1983)Nature 305537-9)，或(3)用不同多克隆抗體的輕鏈基因和重鏈基因(4種類型的DNA)轉(zhuǎn)染真核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞，隨后分離雙特異性單價(jià)部分(Zimmermann(1986)Rev.Physio.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Diik等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)。另一方面，二體抗體是含有可通過(guò)基因融合構(gòu)建的兩個(gè)二價(jià)多肽鏈的二聚體抗體片段。這些可使用已知的方法制備。(參見(jiàn)Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-8；EP404097；WO93/11161)。
回收和純化抗體和抗體片段可以使用A蛋白和G蛋白進(jìn)行，或根據(jù)“Production of Polypeptide”(AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))中詳細(xì)描述的蛋白純化技術(shù)進(jìn)行。例如，當(dāng)使用A蛋白純化本發(fā)明抗體時(shí)，可使用已知的A蛋白柱例如Hyper D、POROS或Sepharose F.F.(Pharmacia)。所得抗體的濃度可通過(guò)測(cè)定吸光度或通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)確定。
抗體的抗原結(jié)合活性可通過(guò)吸光度測(cè)定、或使用熒光抗體法、酶免疫分析(EIA)法、放射免疫分析(RIA)法或ELISA確定。當(dāng)使用ELISA時(shí)，先將本發(fā)明抗體固定在支持物例如平板上。加入本發(fā)明多肽，然后加入含有目標(biāo)抗體的樣品。本文中，含有目標(biāo)抗體的樣品包括，例如抗體-生成細(xì)胞的培養(yǎng)上清、純化的抗體等。其次，加入識(shí)別本發(fā)明抗體的第二抗體，然后保溫平板。隨后，洗滌平板并檢測(cè)結(jié)合在第二抗體上的標(biāo)記。即，如果第二抗體用堿性磷酸酶標(biāo)記，抗原結(jié)合活性可通過(guò)加入酶底物例如對(duì)硝基苯磷酸并測(cè)定吸光度來(lái)確定。另外，也可使用商業(yè)購(gòu)得的系統(tǒng)例如BIAcore(Pharmacia)評(píng)估抗體活性。
本發(fā)明抗體可用于純化本發(fā)明的多肽或其片段。另外，也可用本發(fā)明抗體獲得適用于帕金森氏病等疾病的細(xì)胞移植治療的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞。
<選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元>
本發(fā)明提供選擇性獲得剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞均一群體的方法。更具體地，表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞，也就是說(shuō)，剛剛停止分裂后的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞，可通過(guò)將本發(fā)明65B13多肽的抗體與含有潛在的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸，然后選擇與所述抗體結(jié)合的細(xì)胞而獲得(見(jiàn)圖12-14)?？贵w在與細(xì)胞接觸前也可固定在適當(dāng)?shù)闹С治锷?。換句話說(shuō)，通過(guò)細(xì)胞與抗體接觸并使之結(jié)合，并通過(guò)親和層析純化所述抗體，可選擇性地回收與所述抗體結(jié)合的細(xì)胞。例如，如果本發(fā)明抗體與生物素偶聯(lián)，它可在結(jié)合有抗生物素蛋白或鏈抗生物素蛋白的平板或柱上純化。
另外，65B13含有具Ig結(jié)構(gòu)域的粘附分子樣結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖6)，當(dāng)其在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表達(dá)65B13的細(xì)胞互相粘附，但不與不表達(dá)65B13的細(xì)胞粘附。因此，認(rèn)為65B13介導(dǎo)的粘附涉及同嗜性粘附?；?5B13多肽的這種特性，也可通過(guò)利用65B13多肽，特別是其胞外部分選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞。例如，可通過(guò)在適當(dāng)?shù)闹С治锷瞎潭?5B13多肽的胞外部分，然后將支持物與細(xì)胞接觸，獲得產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法，所述方法包括將含有本發(fā)明多肽的至少胞外部分的肽與含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸的步驟。
本發(fā)明中，剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞可使用抗-65B13抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀有效分離(實(shí)施例4，圖14)。
另外，產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞也可使用65B13的啟動(dòng)子來(lái)選擇(見(jiàn)，例如，特開2002-51775號(hào)公報(bào))。例如，可以將含有編碼檢測(cè)標(biāo)記物的基因(例如GFP)與通過(guò)后文所述的分析65B13表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)而獲得的啟動(dòng)子區(qū)連接成構(gòu)建體，將含有該構(gòu)建體的載體導(dǎo)入細(xì)胞。還可以將編碼標(biāo)記物的基因敲入65B13基因座。兩種情況下，都可以通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)選擇特異性細(xì)胞。
本發(fā)明使用的細(xì)胞樣品優(yōu)選包括中腦腹側(cè)區(qū)細(xì)胞或含體外分化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元體外分化可通過(guò)已知方法使用例如已知的ES細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、無(wú)限增殖化神經(jīng)元衍生細(xì)胞系(特表平8-509215號(hào)公報(bào)，特表平11-506930號(hào)公報(bào)；特表2002-522070號(hào)公報(bào))或原始神經(jīng)元細(xì)胞(特表平11-509729號(hào)公報(bào))等細(xì)胞作為起始物質(zhì)進(jìn)行。通常，可通過(guò)將從腦的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元區(qū)獲得的組織與衍生自神經(jīng)組織的支持細(xì)胞層共培養(yǎng)，來(lái)分化產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元。此外，從通常不產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)組織例如紋狀體和腦皮質(zhì)衍生的產(chǎn)多巴胺型細(xì)胞的方法也是已知的(特表平10-509319號(hào)公報(bào))。另外，已報(bào)道在含氧量低的條件下培養(yǎng)，以制備含有更多產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的細(xì)胞(特表2002-530068號(hào)公報(bào))。用于選擇本發(fā)明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品可以是通過(guò)任何方法分離或培養(yǎng)的細(xì)胞群。
另外，用于固定本發(fā)明抗體或多肽的支持物對(duì)細(xì)胞必需是安全的。這種載體的例子包括合成的或天然產(chǎn)生的有機(jī)高分子化合物，玻璃珠、硅膠、礬土(alumina)和活性炭等無(wú)機(jī)材料，以及表面由多糖或合成高分子包被的那些材料。對(duì)載體的形式?jīng)]有特別限制，其例子包括薄膜、纖維、顆粒、中空纖維、非編織織物、多孔支持物、或蜂窩狀支持物，并且可通過(guò)以各種方式改變接觸表面的厚度、表面積、寬度、長(zhǎng)度、形狀和大小，來(lái)控制接觸表面的面積。
<產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞>
由于以這種方式獲得的細(xì)胞是剛停止分裂的神經(jīng)元前體細(xì)胞，它們?cè)谄浒踩?、存活率和網(wǎng)絡(luò)形成能力方面與常規(guī)的混合細(xì)胞群或攜帶外源基因的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元相比，在神經(jīng)退化疾病例如帕金森氏病的移植療法中是優(yōu)選的。此外，由于根據(jù)本發(fā)明方法獲得的本發(fā)明細(xì)胞(或細(xì)胞群)是剛停止分裂的前體細(xì)胞，它們也可通過(guò)選擇體外條件(例如培養(yǎng)基)而分化至適當(dāng)?shù)碾A段，并且是各種神經(jīng)移植療法的優(yōu)選材料。當(dāng)使用本發(fā)明方法獲得的神經(jīng)元前體細(xì)胞用于移植時(shí)，優(yōu)選移植1×103-1×106個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選5×104-6×104個(gè)細(xì)胞?；痉椒ㄊ嵌ㄎ荒X固定術(shù)(stereotaxic surgery)，其中將細(xì)胞懸液移植到腦中。另外，細(xì)胞也可通過(guò)顯微外科手術(shù)移植。有關(guān)移植神經(jīng)元組織的方法參見(jiàn)Backlund等(Backlund等(1985)J.Neurosurg.62169-73)，Lindvall等(Lindvall等(1987)Ann.Neurol.22457-68)或Madrazo等(Madrazo等(1987)New Engl.J.Med.316831-4)。
此外，本發(fā)明細(xì)胞還可用于分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因，以及從前體細(xì)胞成熟為產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元期間各個(gè)階段的特異性基因。它們還可用于尋找帕金森氏病的治療目標(biāo)，闡明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的成熟過(guò)程，以及用成熟作為指標(biāo)進(jìn)行篩選。
<比較基因表達(dá)水平>
使用本發(fā)明抗體獲得的剛分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞可用做分離在這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因的材料。它們也可用于研究和分離在已從本發(fā)明的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞分化、誘導(dǎo)、或增殖的細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。另外，也可將它們用于研究產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元體內(nèi)分化所需的基因，方法是研究在從原始前體細(xì)胞分化、誘導(dǎo)或增殖的細(xì)胞中具有不同表達(dá)水平的基因。由于這種基因是治療由產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元缺陷引起的疾病的潛在候選者，它們的測(cè)定和分離極為有用。
將本發(fā)明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中基因表達(dá)水平與已從其分化、誘導(dǎo)或增殖的細(xì)胞或其他細(xì)胞的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較；或?qū)⒎只⒄T導(dǎo)或增殖的細(xì)胞的基因表達(dá)水平與其他細(xì)胞的進(jìn)行比較，可通過(guò)通常使用的方法進(jìn)行，例如細(xì)胞原位雜交、Northern印跡雜交、RNA斑點(diǎn)雜交、反轉(zhuǎn)錄PCR、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、DNA微陣列雜交、基因表達(dá)系列分析(SAGE)(Velculescu等(1995)Science 270484-487)，扣除雜交和表現(xiàn)度示差分析(RDA)(Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-307)。
在細(xì)胞原位雜交時(shí)，從細(xì)胞制備總RNA或polyA+RNA，使之與指定RNA序列的特異性標(biāo)記探針雜交，可研究個(gè)體細(xì)胞中發(fā)生RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞質(zhì)定位的位置。另外，RNA大小可使用凝膠電泳通過(guò)大小分級(jí)分離進(jìn)行測(cè)定。此外，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可使用適用于本發(fā)明的定量熒光原位雜交(FISH)和數(shù)字成象顯微鏡進(jìn)行原位觀察(Femino等(1998)Science 280585-90)。
當(dāng)用反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因表達(dá)時(shí)，可粗略定量特異性基因的表達(dá)。單鏈RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的各種同工型也可使用本發(fā)明方法檢測(cè)和分析。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄PCR，當(dāng)使用外顯子特異性引物進(jìn)行反應(yīng)，并檢測(cè)除預(yù)測(cè)產(chǎn)物外的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，通過(guò)備選剪接制備的mRNA同工型可通過(guò)分析這些產(chǎn)物予以鑒定。詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)，例如，Pykett等(1994)Hum.Mol.Genet.3559-64中描述的方法。當(dāng)需要快速、粗略地分析表達(dá)方式時(shí)，使用本發(fā)明PCR進(jìn)行的本發(fā)明方法就其高速、高敏感性和簡(jiǎn)易性來(lái)說(shuō)，特別優(yōu)選。
基因表達(dá)篩選的效率可通過(guò)使用DNA芯片來(lái)改善。本文中，DNA芯片是指微陣列，其中寡核苷酸、DNA克隆等以高密度固定在支持物表面例如玻璃上。例如，為了進(jìn)行多重表達(dá)篩選，可以將每種目標(biāo)基因的cDNA克隆或特異于每一基因的寡核苷酸固定在芯片上以制備微陣列。接著，從本發(fā)明多巴胺-特異性神經(jīng)元前體細(xì)胞，或從其分化、誘導(dǎo)或增殖得到的細(xì)胞來(lái)制備RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶處理產(chǎn)生cDNA。然后，將所得cDNA樣品用熒光標(biāo)記物或其它標(biāo)記物標(biāo)記，隨后與微陣列雜交。結(jié)果，在細(xì)胞中活躍表達(dá)的基因具有較高的總標(biāo)記cDNA百分率，而未被顯著表達(dá)的基因具有較低的百分率。也就是說(shuō)，代表標(biāo)記cDNA與芯片上cDNA克隆或寡核苷酸之間雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度，反映了標(biāo)記cDNA中每一序列的表達(dá)水平，并因此使基因表達(dá)能夠量化。
另外，本發(fā)明的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞或從其分化、誘導(dǎo)或增殖而得到的細(xì)胞中的多個(gè)基因可通過(guò)mRNA差別展示同時(shí)進(jìn)行分析，這包括使用簡(jiǎn)并PCR引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。
首先，制備修飾的oligo dT引物，其改變了指定mRNA的poly A尾3’端的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸。然后，從本發(fā)明前體細(xì)胞、從其分化或增殖的細(xì)胞、或用于比較表達(dá)的對(duì)照細(xì)胞分離總RNA，用其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Liang等(1993)Nucleic Acids Res.213269-3275)。如果改變的核苷酸是“G”，那么可選擇性擴(kuò)增在其polyA尾之前緊接“C”的那些mRNA。如果改變的核苷酸是“CA”，那么可選擇性擴(kuò)增在其poly A尾之前緊接“TG”的那些mRNA。接著，制備長(zhǎng)約10個(gè)核苷酸的任意核苷酸序列作為二次引物，使用上述修飾的oligo dT引物和該二次引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用泳動(dòng)距離長(zhǎng)的聚丙烯酰胺凝膠通過(guò)電泳進(jìn)行大小分級(jí)分離。由在本發(fā)明細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞中特異性表達(dá)的mRNA所衍生的cDNA，可以用這種方法測(cè)出，表現(xiàn)為僅出現(xiàn)在電泳后的該樣品中的帶。該方法還可用于分析未知基因的表達(dá)。
SAGE分析不需要特殊檢測(cè)裝置，是可以同時(shí)檢測(cè)大量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)的優(yōu)選分析方法之一。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)方法從本發(fā)明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞或從其分化、誘導(dǎo)或增殖而得到的細(xì)胞中提取poly A+RNA。接著，使用生物素化oligo(dT)引物將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，然后用識(shí)別4-堿基的限制性內(nèi)切酶(錨著酶(Anchoring Enzyme)AE)處理。本文中，經(jīng)AE-處理的片段在其3’端包含生物素基團(tuán)。隨后，將經(jīng)AE-處理的片段與鏈抗生物素蛋白保溫以便發(fā)生結(jié)合。將結(jié)合的cDNA分成兩部分，使各部分與不同的雙鏈寡核苷酸銜接子(接頭)A或B連接。這些接頭組成如下(1)突出的單鏈部分，它具有與經(jīng)錨著酶作用形成的突出部分序列互補(bǔ)的序列，(2)IIS-型限制性內(nèi)切酶(作為標(biāo)記酶(TE)，在距離識(shí)別位點(diǎn)不超過(guò)20bp的預(yù)定位置酶切)的5’核苷酸識(shí)別序列，和(3)用于構(gòu)建PCR-特異性引物的足夠長(zhǎng)的附加序列。本文中，與接頭連接的cDNA用標(biāo)記酶酶切，僅保留與接頭連接的cNDA序列部分，為短鏈序列標(biāo)記形式。接著，使來(lái)自兩種不同接頭的短鏈序列標(biāo)記混合物彼此連接，隨后用特異于接頭A和B的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物是含有與接頭A和B連接的兩種毗鄰序列標(biāo)記(雙標(biāo)記(di標(biāo)記s))的多樣化(myriad)序列的混合物。擴(kuò)增產(chǎn)物用錨著酶處理，游離雙標(biāo)記部分在標(biāo)準(zhǔn)連鎖反應(yīng)中與鏈連接。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆。測(cè)定克隆的核苷酸序列，以此獲得恒定長(zhǎng)度的連續(xù)雙標(biāo)記的讀數(shù)。一旦測(cè)定克隆的核苷酸序列，結(jié)合如此獲得的序列標(biāo)記的信息，就可鑒別對(duì)應(yīng)于每一標(biāo)記的mRNA的存在。
扣除雜交常常用于克隆那些在多種組織或細(xì)胞中具有不同表達(dá)水平的基因，還可用于克隆在本發(fā)明產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞或從其分化、誘導(dǎo)或增殖而得到的細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。首先，從上述本發(fā)明細(xì)胞制備試驗(yàn)用細(xì)胞DNA樣品(下文中稱試驗(yàn)DNA)。其次，制備比較用細(xì)胞DNA(下文中稱做供試探針DNA)。試驗(yàn)DNA和供試探針DNA還可交換使用。在任一種情況中，檢測(cè)存在于試驗(yàn)DNA但不存在于供試探針DNA中的基因。然后，將制備的試驗(yàn)DNA與過(guò)量的供試探針DNA混合，變性，形成單鏈DNA，隨后退火。通過(guò)調(diào)節(jié)退火條件，可將不存在于供試探針DNA中的特異性序列作為僅含有試驗(yàn)DNA序列的雙鏈DNA形式而分離。關(guān)于本方法進(jìn)一步詳細(xì)的資料參見(jiàn)Swaroop等(1991)Nucleic Acids Res.191954和Yasunaga等(1999)Nature Genet.21363-9。
RDA方法是使用PCR選擇性擴(kuò)增不存在于供試探針DNA中的試驗(yàn)DNA序列的方法，像其他上述方法一樣，該方法可用于本發(fā)明。詳見(jiàn)Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-7和Schutte等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA925950-4。
特異于產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞或從其分化、誘導(dǎo)或增殖而得到的細(xì)胞的基因如上所述進(jìn)行檢測(cè)和分離，并可插入載體等，以便使用上述各種已知方法進(jìn)行序列測(cè)定和表達(dá)分析。
<用前體細(xì)胞成熟作為指標(biāo)進(jìn)行篩選>
本發(fā)明提供篩選方法，該方法包括將試驗(yàn)物質(zhì)與本發(fā)明的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞接觸，并檢測(cè)由所述接觸引起的前體細(xì)胞的分化和增殖。由于通過(guò)這種篩選方法獲得的化合物顯示了在產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的分化、增殖等方面的調(diào)節(jié)功能，它們被認(rèn)為可以作為由產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元缺陷引起的疾病的潛在治療候選者。
本文中，“試驗(yàn)物質(zhì)”可以是任何類型的化合物，其例子包括基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物、合成低分子化合物文庫(kù)、合成肽文庫(kù)、抗體、由細(xì)菌釋放的物質(zhì)、細(xì)胞(微生物、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)提取物、細(xì)胞(微生物、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)培養(yǎng)上清、純化或部分純化的多肽、海洋生物、植物或動(dòng)物提取物、土壤、隨機(jī)噬菌體肽顯示文庫(kù)等。
細(xì)胞分化和增殖可通過(guò)與不存在試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)對(duì)比來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞分化和增殖可通過(guò)在顯微鏡下觀察形態(tài)或通過(guò)檢測(cè)和定量細(xì)胞中產(chǎn)生的物質(zhì)例如多巴胺來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
<分析65B13表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)>
本發(fā)明提供65B13表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)可使用本發(fā)明多核苷酸通過(guò)已知方法從基因組DNA克隆。例如，確立轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的方法(如SI作圖法)是已知的并可用于本發(fā)明(細(xì)胞工學(xué)，增刊8，新細(xì)胞工學(xué)實(shí)驗(yàn)方案，東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所制癌研究部編，秀潤(rùn)社(1993)362-374)。通常，基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)可以用探針DNA篩選基因組DNA文庫(kù)來(lái)克隆，所述探針DNA含有基因5’端的15-100bp片段，優(yōu)選30-50bp片段(本發(fā)明中，SEQ ID NO1之1-176核苷酸或SEQ ID NO2之1-126核苷酸的全部或部分)。以這種方式獲得的克隆包含5’非編碼區(qū)的10kbp或更多，可以經(jīng)核酸外切酶處理而截短或切斷。最后，含有潛在的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)的截短型序列部分可以用報(bào)道基因評(píng)估其表達(dá)、長(zhǎng)度、調(diào)節(jié)等，從而使得可以測(cè)定保持本發(fā)明65B13表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)活性所需的最小單元。
可以用Neural Network(http//www.fruitfly.org./seq tools/promoter.html；Reese et al.，BiocomputingProceedings of the 1996 Pacific Symposium，Hunterand Klein ed.，World Scientific Publishing Co.，Singapore，(1996))等程序預(yù)測(cè)基因表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)。此外，預(yù)測(cè)表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)活性所需的最小單元的程序也是已知的，(http//biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan.htm；Prestridge(1995)J.Mol.Biol.249923-932)，并可用于本發(fā)明。
以這種方式分離的65B13基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)，可用于體內(nèi)產(chǎn)生特異于分裂停止后的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的目的蛋白。
<配體鑒別>
本發(fā)明提供本發(fā)明多肽的配體。本發(fā)明多肽具有跨膜結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為在天然狀態(tài)中它們包埋在細(xì)胞膜內(nèi)。據(jù)信這些多肽參與神經(jīng)元成熟，因?yàn)樗鼈冊(cè)趧偼Ｖ狗至训漠a(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。因此，那些對(duì)本發(fā)明多肽顯示激動(dòng)功能或拮抗功能的潛在配體，可用于體內(nèi)、回體和體外調(diào)節(jié)產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的分化。在鑒別本發(fā)明多肽的配體時(shí)，可以先使本發(fā)明多肽與候選化合物接觸，檢測(cè)結(jié)合的存在。在這種情況下，可使用固定在支持物上或包埋于細(xì)胞膜中的本發(fā)明多肽。對(duì)于候選化合物沒(méi)有具體限制，其例子包括基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物、衍生自海洋生物的天然物質(zhì)、各種細(xì)胞的提取物、已知化合物和肽、衍生自植物的天然物質(zhì)、機(jī)體組織提取物、微生物培養(yǎng)上清和通過(guò)噬菌體展示方法隨機(jī)制備的肽群(J.Mol.Biol.222301-10(1991))。此外，可使候選化合物帶上標(biāo)記，以便檢測(cè)結(jié)合。


圖1顯示65B13-a的cDNA序列和氨基酸序列。在信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域下劃線。
圖2顯示65B13-a的cDNA序列和氨基酸序列。在信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域下劃線。該圖是圖1的連續(xù)。
圖3顯示65B13-b的cDNA序列和氨基酸序列。在信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域下劃線。
圖4顯示65B13-b的cDNA序列和氨基酸序列。在信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域下劃線。該圖是圖3的連續(xù)。
圖5是65B13-a和65B13-b的氨基酸序列的對(duì)比。
圖6是65B13結(jié)構(gòu)的示意圖。陰影部分表示跨膜結(jié)構(gòu)域，而Ig代表Ig結(jié)構(gòu)域。
圖7是顯示在E12.5小鼠腦中通過(guò)原位雜交分析65B13mRNA表達(dá)結(jié)果的一組照片。A矢狀截面，B旁矢狀截面，HB后腦，MB中腦，SC脊髓，CB小腦原基。
圖8是顯示在E12.5小鼠脊髓中通過(guò)原位雜交分析65B13mRNA表達(dá)結(jié)果的一組照片。A65B13，BNCAM，C65B13、Ki67和NCAM表達(dá)區(qū)的對(duì)比(顯示為A和B中框架區(qū)的放大照片)。
圖9是顯示在E12.5小鼠的中腦腹側(cè)區(qū)中通過(guò)原位雜交分析65B13mRNA表達(dá)和分析酪氨酸羥化酶(TH)mRNA表達(dá)結(jié)果的一組照片。A65B13，BTH。
圖10是顯示中腦中65B13表達(dá)模式的示意圖。
圖11是顯示整個(gè)時(shí)間內(nèi)65B13表達(dá)模式的示意圖。
圖12是說(shuō)明使用抗-65B13抗體分離和利用產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法的示意圖。
圖13是顯示使用抗每種蛋白的抗體通過(guò)免疫熒光染色方法分析65B13(Cy3)、Nurr1(FITC)和TH(Cy5)蛋白表達(dá)結(jié)果的照片。
圖14是一組照片，顯示在(A)E 12.5小鼠胚胎的中腦腹側(cè)區(qū)和(B)包含從ES細(xì)胞體外分化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞群中，用65B13單克隆抗體檢測(cè)65B13-表達(dá)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。
進(jìn)行本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將參考實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性基因的分離和序列分析為了分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性基因，使用來(lái)自E12.5小鼠中腦腹側(cè)和背側(cè)的RNA通過(guò)扣除法(N-RDA)擴(kuò)增在其表達(dá)中有差別的基因，并分析得到的基因序列。
1.N-RDA方法1-1接頭制備下列寡核苷酸彼此退火，并制備100μM。
(ad2ad2S+ad2A，ad3ad3S+ad3A，ad4ad4S+ad4A，ad5ad5S+ad5A，ad13ad13S+ad13A)ad2Scagctccacaacctacatcattccgt(SEQ ID NO11)ad2Aacggaatgatgt(SEQ ID NO12)ad3Sgtccatcttctctctgagactctggt(SEQ ID NO13)ad3Aaccagagtctca(SEQ ID NO14)ad4Sctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(SEQ ID NO15)ad4Aacacactcacag(SEQ ID NO16)ad5Sccagcatcgagaatcagtgtgacagt(SEQ ID NO17)ad5Aactgtcacactg(SEQ ID NO18)ad13Sgtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(SEQ ID NO19)ad13Aacgatcgacagt(SEQ ID NO20)。
1-2.cDNA合成使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從E 12.5小鼠胚胎(Japan SLC)的腹側(cè)和背側(cè)中腦區(qū)制備總RNA，并用cDNA合成試劑盒(Takara)合成雙鏈cDNA。用限制性內(nèi)切酶RsaI消化后加入ad2。用ad2S作為引物，通過(guò)在72℃保溫5分鐘，然后在94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分鐘進(jìn)行15輪PCR，最后在72℃保溫2分鐘擴(kuò)增cDNA。在所有情況下，N-RDA PCR使用含有如下成分的反應(yīng)溶液進(jìn)行。
10×ExTaq 5μl2.5mM dNTP 4μlExTaq 0.25μl100μM引物0.5μlcDNA 2μl蒸餾水38.25μl
1-3供試探針(driver)制備經(jīng)ad2S擴(kuò)增的cDNA通過(guò)在94℃保溫2分鐘，然后進(jìn)行5個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分鐘，最后在72℃保溫2分鐘來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA，并用RsaI消化。3μg用于各次扣除循環(huán)。
1-4試驗(yàn)對(duì)象(tester)制備經(jīng)ad2S擴(kuò)增的cDNA通過(guò)在94℃保溫2分鐘，然后進(jìn)行5個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分鐘，最后在72℃保溫2分鐘來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA，并用RsaI消化。將ad3加入60ng的經(jīng)RsaI-消化的cDNA中。
1-5第一輪扣除雜交混合上述1-3和1-4節(jié)中制備的試驗(yàn)對(duì)象和供試探針，乙醇沉淀，然后溶解于1μl的1×PCR緩沖液中。98℃5分鐘后，加入1μl 1×PCR緩沖液+1MNaCl。再經(jīng)98℃5分鐘后，試驗(yàn)對(duì)象和供試探針在68℃雜交16小時(shí)。
用ad3S作為引物，通過(guò)在72℃保溫5分鐘，并進(jìn)行10個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒、65℃30秒和72℃2分鐘來(lái)使雜交的cDNA擴(kuò)增。接著，擴(kuò)增的cDNA用綠豆核酸酶(Takara)消化并使用Qiaquick PCR純化試劑盒純化。然后，通過(guò)在94℃保溫2分鐘，并進(jìn)行13個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘，最后在72℃保溫2分鐘，來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。
1-6.均一化將1μl 2×PCR緩沖液加入8ng第一輪扣除雜交中擴(kuò)增的cDNA。98℃保溫5分鐘后，加入2μl 1×PCR緩沖液+1M NaCl。98℃再保溫5分鐘后，所述cDNA在68℃雜交16小時(shí)。
雜交的cDNA用RsaI消化，并使用Qiaquick PCR純化試劑盒純化。然后，用ad3S作引物，通過(guò)在94℃保溫2分鐘，并進(jìn)行11個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒、65℃30秒和72℃2分鐘，最后在72℃保溫2分鐘來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。然后，PCR產(chǎn)物用RsaI消化，隨后加入ad4。
1-7.第二輪扣除雜交將已在上述1-6節(jié)中加入了ad4的cDNA取20ng用做試驗(yàn)對(duì)象，與上述1-3節(jié)的供試探針混合，進(jìn)行上述1-5節(jié)中使用的同樣的減法步驟。最后，該cDNA經(jīng)RsaI消化后加入ad5。
1-8.第三輪扣除雜交將已在上述1-7節(jié)中加入了ad5的cDNA取2ng用做試驗(yàn)對(duì)象，與上述1-3節(jié)的供試探針混合，進(jìn)行上述1-5節(jié)中使用的同樣的減法步驟。最后，cDNA經(jīng)RsaI消化后加入ad13。
1-9.第四輪扣除雜交將已在上述1-8節(jié)中加入了ad13的cDNA取2ng用做試驗(yàn)對(duì)象，與上述1-3節(jié)的供試探針混合，進(jìn)行上述1-5節(jié)中使用的同樣的減法步驟。將擴(kuò)增的cDNA克隆進(jìn)入pCRII載體(Invitrogen)，并使用ABI3100序列分析儀分析其核苷酸序列。
接著，使用通過(guò)N-RDA法獲得的65B13片段序列，根據(jù)下文描述的方法進(jìn)行RACE。
2.RACE方法使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從E12.5小鼠胚腦制備總RNA，以便使用μM ACS mRNA分離試劑盒(Miltenyi Biotec)制備mRNA。然后使用Superscript Choice System(Invitrogen)和pCRII載體(Invitrogen)從上述制備的mRNA再制備cDNA文庫(kù)。然后從所述cDNA文庫(kù)制備質(zhì)粒DNA。使用下列引物進(jìn)行PCRTAU2GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTC(SEQ ID NO21)TAU4CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC(SEQ ID NO22)TAD3AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG(SEQ ID NO23)TAD4CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG(SEQ ID NO24)65B 13F1CTTCCCGTATGCTACCTTGTCTCCAC(SEQ ID NO25)65B 13F2TCCATCTCTCCAAGTGAAGGGTCTTG(SEQ ID NO26)65B 13R1CCAACAGTCCTGCATGCTTGTAATGA(SEQ ID NO27)
65B 13R2TCCTTCAATGTTCAGTTTTGGAGGGG(SEQ ID NO28)PCR條件描述如下第一輪PCR10×ExTaq 2μl2.5mM dNTP 1.6μlExTaq 0.1μl100μM TAU2或TAD30.04μl100μM65B 13F1或R10.2μlcDNA(10ng/μl)1μl蒸餾水15.06μl94℃保溫5分鐘后，進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒，65℃30秒和72℃5分鐘，最后在72℃保溫2分鐘。接著將第一輪PCR獲得的產(chǎn)物100倍稀釋后，進(jìn)行第二輪PCR。第二輪PCR的條件顯示如下。
第二輪PCR10×ExTaq 5μl2.5mM dNTP 4μlExTaq 0.25μl100μM TAU4或TAD40.1μl100μM 65B13F2或R20.5μl1/100第一輪PCR產(chǎn)物1μl蒸餾水15.06μl94℃保溫5分鐘后，進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)94℃30秒，65℃30秒和72℃5分鐘，最后在72℃保溫2分鐘。將擴(kuò)增的cDNA片段克隆進(jìn)入pCRII載體，使用ABI3100序列分析儀分析其序列。
得到的65B13-a和65B13-b兩個(gè)基因的核苷酸序列顯示為SEQ ID NO1(圖1和2)和SEQ ID NO2(圖3和4)。65B13-a的編碼區(qū)起始于SEQ IDNO1第177位的″A″，終止于核苷酸2278-2280的終止密碼子，產(chǎn)生包含700個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。由核苷酸177-228的序列編碼的17個(gè)氨基酸殘基是信號(hào)序列。由核苷酸1717-1767的序列編碼的17個(gè)氨基酸殘基是跨膜結(jié)構(gòu)域。相比之下，65B13-b的編碼區(qū)起始于SEQ ID NO2第127位的″A″，終止于核苷酸2077-2079的終止密碼子，產(chǎn)生包含650個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。由核苷酸127-177的序列編碼的17個(gè)氨基酸殘基是信號(hào)序列，由核苷酸1516-1566的序列編碼的17個(gè)氨基酸殘基是跨膜結(jié)構(gòu)域。由65B13-a和65B 13-b基因編碼的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO3和4。如圖5所示，由這兩個(gè)基因編碼的氨基酸序列的對(duì)比表明，65B13-a和65B13-b是備選剪接導(dǎo)致的同工型，并且651B3-b的N端比65B13-a缺少50個(gè)氨基酸?；谕葱詸z索結(jié)果，認(rèn)為由65B13基因編碼的蛋白是具有如圖6所示的5個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的單鏈跨膜蛋白。
65B13基因的表達(dá)分析然后，根據(jù)如下方法通過(guò)原位雜交進(jìn)行這些基因的表達(dá)分析。
首先，將E12.5小鼠胚胎包埋于O.C.T中，制備16μm厚的冷凍切片。在載玻片上干燥后，室溫將切片于4％PFA中固定30分鐘。用PBS洗滌后，65℃雜交40小時(shí)(1μg/ml DIG-1標(biāo)記的RNA探針，50％甲酰胺，5×SSC，1％SDS，50μg/ml酵母RNA，50μg/ml肝素)。隨后，切片在65℃洗滌(50％甲酰胺，5×SSC，1％SDS)。然后在室溫用RNA酶(5μg/ml RNA酶)處理5分鐘。65℃用0.2×SSC洗滌和室溫用1×TBST洗滌后，進(jìn)行封閉(封閉劑Roche)。然后切片與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-DIG抗體(DAKO)反應(yīng)，洗滌(1×TBST，2mM左旋咪唑(Levamisole))，并用NBT/BCIP(DAKO)作為底物進(jìn)行顯色。
通過(guò)原位雜交分析這些基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，在與產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元發(fā)育對(duì)應(yīng)的階段，65B13在E12.5的中腦腹側(cè)、小腦原基、后腦和脊髓中表達(dá)(圖7)。65B13在脊髓中的表達(dá)進(jìn)一步與生長(zhǎng)標(biāo)記Ki67和成熟標(biāo)記NCAM的表達(dá)比較。在發(fā)生Ki67-陽(yáng)性神經(jīng)始祖細(xì)胞增殖的腦室區(qū)(VZ)，65B13在一些細(xì)胞中表達(dá)。相反，在存在分裂停止后成熟的NCAM-陽(yáng)性前體細(xì)胞的外套層(ML)中沒(méi)有觀察到65B13的表達(dá)(圖8)。相似地，在脊髓以外區(qū)域，可以在VZ內(nèi)的一些細(xì)胞中觀察到表達(dá)。依據(jù)這些表達(dá)方式，認(rèn)為65B13在剛停止分裂的神經(jīng)前體細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。
中腦中，僅在腦室區(qū)的大部分腹側(cè)區(qū)觀察到表達(dá)。由于作為產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元標(biāo)記基因的酪氨酸羥化酶(TH)僅在ML中表達(dá)，因此對(duì)TH表達(dá)和65B13表達(dá)的比較顯示，二者不在相同細(xì)胞中表達(dá)，但是，它們沿背-腹軸方向的表達(dá)區(qū)完全一致(圖9)。通常，已知神經(jīng)管中的神經(jīng)細(xì)胞在VZ中增殖，隨著分化的開始停止細(xì)胞分裂，然后遷移到位于VZ外側(cè)的ML中成熟。因此，認(rèn)為產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元始祖細(xì)胞在與TH表達(dá)區(qū)鄰近的VZ中增殖，并在細(xì)胞分裂結(jié)束后轉(zhuǎn)移到外側(cè)表達(dá)TH。由于這些發(fā)生始祖細(xì)胞增殖的VZ區(qū)與65B13表達(dá)區(qū)一致，即認(rèn)為細(xì)胞周期結(jié)束后65B13立即在中腦的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異地瞬時(shí)表達(dá)(圖10和11)。
65B13蛋白的表達(dá)分析接著，用編碼胞外區(qū)的部分65B13基因序列制備抗-65B13抗體，以便通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析表達(dá)。
首先，將編碼胞外區(qū)的部分65B13基因序列導(dǎo)入293E細(xì)胞，表達(dá)并回收65B13蛋白的胞外區(qū)。用回收的蛋白免疫倉(cāng)鼠后，提取淋巴細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合。然后將融合細(xì)胞移植到小鼠的腹腔，收集腹水，并純化抗-65B13單克隆抗體。接著，E12.5小鼠胚胎4℃于4％PFA/PBS(-)中固定2小時(shí)，然后在20％蔗糖/PBS(-)中4℃靜置過(guò)夜，隨后用O.C.T包埋。制備12um厚的切片。將切片固定在載玻片上后，室溫干燥30分鐘，然后用PBS(-)重新潤(rùn)濕。隨后，室溫封閉(Block Ace)20分鐘。具有組織切片的玻片用所得抗-65B13單克隆抗體(10ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)、抗-TH抗體(Chemicon，0.7ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)和抗-Nurr1抗體(Santa Cruz，4ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)室溫保溫1小時(shí)，并4℃過(guò)夜。然后，具有組織切片的玻片用0.1％Triton X-100/PBS(-)室溫洗滌4次，每次10分鐘，并用Cy3-標(biāo)記的抗-倉(cāng)鼠IgG抗體、FITC-標(biāo)記的抗-兔IgG抗體和Cy5-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體(Jackson，10ug/ml，2.5％BlockAce)室溫保溫1小時(shí)。玻片以相同方式洗滌，隨后用PBS(-)室溫再洗滌10分鐘，然后包埋。
與通過(guò)原位雜交進(jìn)行的表達(dá)分析相似，使用制備的抗-65B13單克隆抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行的表達(dá)分析顯示，65B13在與產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元發(fā)育對(duì)應(yīng)的E12.5中腦腹側(cè)區(qū)表達(dá)(圖13)。比較65B13蛋白的表達(dá)與產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元標(biāo)記TH和Nurr1蛋白的表達(dá)，表明65B13蛋白在發(fā)生TH和Nurr1蛋白表達(dá)的中腦最腹側(cè)的VZ側(cè)表達(dá)。因此，認(rèn)為65B13蛋白在產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中表達(dá)。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)65B13-表達(dá)細(xì)胞下面，使用抗-65B13單克隆抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)65B13的細(xì)胞。
首先，將從12.5日齡小鼠胚胎切除的中腦腹側(cè)區(qū)，或含有從ES細(xì)胞體外分化的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞群分散于細(xì)胞分散緩沖液(Invitrogen)中。然后，樣品未經(jīng)預(yù)先的固定或滲透就用抗-65B13單克隆抗體(10ug/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)4℃染色20分鐘。隨后，樣品用1％胎牛血清和1mM EDTA/PBS(-)4℃洗滌3分鐘3次，用PE-標(biāo)記的抗-倉(cāng)鼠IgG抗體(Pharmingen，4ug/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)4℃染色20分鐘，然后以相同方式洗滌。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)65B13-表達(dá)細(xì)胞。
使用產(chǎn)生的抗-65B13單克隆抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)65B13蛋白的細(xì)胞群(圖14)。由于不經(jīng)固定或滲透即可檢測(cè)65B13-表達(dá)細(xì)胞，因此認(rèn)為可將65B 13-表達(dá)細(xì)胞通過(guò)使用配備了細(xì)胞分選儀的流式細(xì)胞儀以活細(xì)胞的形式分離。由于認(rèn)為65B13蛋白在產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中表達(dá)，有人相信65B13具有分離產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的用途。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以獲得細(xì)胞分裂結(jié)束后在產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中立即特異且瞬時(shí)表達(dá)的新65B13基因。就其安全性、存活率和網(wǎng)絡(luò)形成能力來(lái)說(shuō)，65B13的細(xì)胞表達(dá)可用做指示物，來(lái)選擇用于帕金森氏病等神經(jīng)變性疾病的移植療法的適當(dāng)細(xì)胞。另外，由于剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞是選擇地獲得的，當(dāng)用于需要成熟細(xì)胞的療法時(shí)，它們可容易地體外分化為適當(dāng)?shù)臓顟B(tài)。此外，使用本發(fā)明基因獲得的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞也可用于分離在這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。有人還認(rèn)為所述細(xì)胞在開發(fā)帕金森氏病等神經(jīng)變性疾病的藥物中有用。剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞是涉及早期神經(jīng)元形成的前體細(xì)胞，它們?cè)陉U明神經(jīng)元成熟過(guò)程，也就是說(shuō)，鑒別涉及成熟過(guò)程的各種因子中有用。預(yù)期闡明這些因子對(duì)治療神經(jīng)變性疾病具有很大作用。此外，這些細(xì)胞的成熟可用做篩選可調(diào)控(抑制或促進(jìn))成熟過(guò)程的物質(zhì)的指標(biāo)。
序列表<110>衛(wèi)材株式會(huì)社(Eisai Co.，Ltd.)<120>在分裂停止后的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因<130>E1-A0203P<150>JP 2002-307573<151>2002-10-22<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2876<212>DNA<213>小鼠<400>1gatgagccag atttcgggga ctctgggcca gacataaaat cttccagccc ggagagaatt 60gtgtgcagag aggggctcca gtccagcgtg gtgtgagagg cgtgctatca agaaagaagt 120tggaggggaa ccagtgcaac cctaactcta cgagatcttg gggtacacac actcgggatg 180ctggcctccg ccctcctcgt tttcctttgc tgtttcaaag gacatgcagg ctcatcgccc 240catttcctac aacagccaga ggacatggtg gtgctgttgg gggaggaagc ccggctgccc 300tgcgctctgg gcgcgtacag ggggctcgtg cagtggacta aggatgggct ggctctaggg 360ggcgaaagag accttccagg gtggtcccgg tactggatat cggggaattc agccagtggc 420cagcatgacc tccacattaa gcctgtggaa ttggaagatg aggcatcgta tgagtgccag 480gcttcgcaag caggtctccg atcacgacca gcccaactgc acgtgatggt ccccccagaa 540gctccccagg tactaggcgg cccctctgtg tctctggttg ctggagttcc tggaaatctg 600acctgtcgga gtcgtgggga ttcccgacct gcccctgaac tactgtggtt ccgagatggg 660atccggctgg atgcgagcag cttccaccag accacgctga aggacaaggc cactggaaca 720gtggaaaaca ccttattcct gaccccttcc agtcatgatg atggcgccac cttgatctgc 780agagcgcgaa gccaggccct gcccacaggg agggacacag ctgttacact gagccttcag 840tatcccccaa tggtgactct gtctgctgag ccccagactg tgcaggaggg agagaaggtg 900actttcctgt gtcaagccac tgcccagcct cctgtcactg gctacaggtg ggcgaagggg 960ggatccccgg tgctcggggc acgtgggcca aggttggagg tcgttgcaga tgccactttc 1020ctgactgagc cggtgtcctg cgaggtcagc aacgcggtcg gaagcgccaa ccgcagcacg 1080gcgctggaag tgttgtatgg acccattctg caggcaaaac ctaagtccgt gtccgtggac 1140gtggggaaag atgcctcctt cagctgtgtc tggcgcggga acccacttcc acggataacc 1200tggacccgca tgggtggctc tcaggtgctg agctccgggc ccacgctgcg gcttccgtcc 1260gtggcactgg aggatgcggg cgactatgta tgcagggctg agccgaggag aacgggtctg 1320ggaggcggca aagcgcaggc gaggctgact gtgaacgcac cccctgtagt gacagccctg 1380
caacctgcac cagcctttct gaggggtcct gctcgcctcc agtgtgtggt gtttgcctcc 1440cctgccccag actcggtggt ttggtcttgg gacgagggct tcttggaggc aggctcactg 1500ggcaggttcc tagtggaagc cttcccagcc ccggaagtgg aggggggaca gggccctggc 1560cttatttctg tgctacacat ttccggaacc caggagtccg actttaccac cggcttcaac 1620tgcagtgccc gcaaccggct aggagaggga cgagtccaga tccacttggg ccgtagagat 1680ttgctgccta ctgtccggat tgtggctggt gcagcatctg cagccacctc tctccttatg 1740gtcatcactg gagtggtcct ctgctgctgg cgccatggct ctctctctaa gcaaaagaac 1800ttggtccgga tcccaggaag cagcgagggt tccagttcac gtggccctga ggaggagaca 1860ggcagcagtg aggaccgggg tcccattgtg cacaccgacc acagtgattt ggttcttgag 1920gaaaaagagg ctctggagac aaaggatcca accaacggtt actacaaggt tcgaggggtc 1980agtgtgagcc ttagccttgg ggaagctcct ggaggaggcc tcttcttgcc accgccctct 2040ccgatcggtc tcccagggac tcctacttac tatgacttca agccacatct ggacttagtc 2100cctccctgca gactgtacag agcgagggca ggttatctta ccacccccca tccccgtgcc 2160ttcaccagct acatgaaacc cacatccttt ggacccccag atttgagctc tggaactccc 2220cccttcccgt atgctacctt gtctccaccc agccaccagc gtctccagac tcatgtgtga 2280atccatctct ccaagtgaag ggtcttggaa tcttctgttt gccatatagt gtgttgtcca 2340gatttctggg gagtcagaac aagttgatga ccaacccctc caaaactgaa cattgaagga 2400gggaaagatc attacaagca tcaggactgt tggtgtacac tcagttcagc caaagtggat 2460tctccaagtg ggagcaatat ggccgctttc ccatgagaaa gacattcaag atggtgacta 2520aatgactaaa tactttgcag agggacaaag atgggaacta gggatacgga tggaagtagt 2580agagaagata tatgaccatc tgcatcaaga ggaaggataa catatgacaa atcaagatga 2640aagaaataat ccaccccacc cccaccgcgt cctggccaat aagtatagcc tacatggctg 2700ttcattatct gggaaccaaa atggccacta tcttgactcc ttccttaaag atacagaaag 2760aattgaatcc aaggaatggg gtagggtgga aatagaagaa atgaagggga ctcttgggct 2820aagaatactt atgtttaata ataaaagggg gaggcaaaga tgcaaaaaaa aaaaaa 2876<210>2<211>2243<212>DNA<213>小鼠<400>2gagagaattg tgtgcagaga gaggctccag tccagcgtgg tgtgagaggc gtgctatcaa 60gaaagaagtt ggaggggaac cagtgcaacc ctaactctac gagatcttgg ggtacacaca 120ctcgggatgc tggcctccgc cctcctcgtt ttcctttgct gtttcaaagg acatgcaggg 180tggtcccggt actggatatc ggggaattca gccagtggcc agcatgacct ccacattaag 240cctgtggaat tggaagatga ggcatcgtat gagtgccagg cttcgcaagc aggtctccga 300tcacgaccag cccaactgca cgtgatggtc cccccagaag ctccccaggt actaggcggc 360ccctctgtgt ctctggttgc tggagttcct ggaaatctga cctgtcggag tcgtggggat 420tcccgacctg cccctgaact actgtggttc cgagatggga tccggctgga tgcgagcagc 480ttccaccaga ccacgctgaa ggacaaggcc actggaacag tggaaaacac cttattcctg 540accccttcca gtcatgatga tggcgccacc ttgatctgca gagcgcgaag ccaggccctg 600cccacaggga gggacacagc tgttacactg agccttcagt atcccccaat ggtgactctg 660
tctgctgagc cccagactgt gcaggaggga gagaaggtga ctttcctgtg tcaagccact720gcccagcctc ctgtcactgg ctacaggtgg gcgaaggggg gatccccggt gctcggggca780cgtgggccaa ggttggaggt cgttgcagat gccactttcc tgactgagcc ggtgtcctgc840gaggtcagca acgcggtcgg aagcgccaac cgcagcacgg cgctggaagt gttgtatgga900cccattctgc aggcaaaacc taagtccgtg tccgtggacg tggggaaaga tgcctccttc960agctgtgtct ggcgcgggaa cccacttcca cggataacct ggacccgcat gggtggctct1020caggtgctga gctccgggcc cacgctgcgg cttccgtccg tggcactgga ggatgcgggc1080gactatgtat gcagggctga gccgaggaga acgggtctgg gaggcggcaa agcgcaggcg1140aggctgactg tgaacgcacc ccctgtagtg acagccctgc aacctgcacc agcctttctg1200aggggtcctg ctcgcctcca gtgtgtggtg tttgcctccc ctgccccaga ctcggtggtt1260tggtcttggg acgagggctt cttggaggca ggctcactgg gcaggttcct agtggaagcc1320ttcccagccc cggaagtgga ggggggacag ggccctggcc ttatttctgt gctacacatt1380tccggaaccc aggagtccga ctttaccacc ggcttcaact gcagtgcccg caaccggcta1440ggagagggac gagtccagat ccacttgggc cgtagagatt tgctgcctac tgtccggatt1500gtggctggtg cagcatctgc agccacctct ctccttatgg tcatcactgg gtggtcctc 1560tgctgctggc gccatggctc tctctctaag caaaagaact tggtccggat cccaggaagc1620agcgagggtt ccagttcacg tggccctgag gaggagacag gcagcagtga ggaccggggt1680cccattgtgc acaccgacca cagtgatttg gttcttgagg aaaaagaggc tctggagaca1740aaggatccaa ccaacggtta ctacaaggtt cgaggggtca gtgtgagcct tagccttggg1800gaagctcctg gaggaggcct cttcttgcca ccgccctctc cgatcggtct cccagggact1860cctacttact atgacttcaa gccacatcag gacttagtcc ctccctgcag actgtacaga1920gcgagggcag gttatcttac caccccccat ccccgtgcct tcaccagcta catgaaaccc1980acatcctttg gacccccaga tttgagctct ggaactcccc ccttcccgta tgctaccttg2040tctccaccca gccaccagcg tctccagact catgtgtgaa tccatctctc caagtgaagg2100gtcttggaat cttctgtttg ccatatagtg tgttgtccag atttctgggg agtcagaaca2160agttgatgac caacccctcc aaaactgaac attgaaggag ggaaagatca ttacaagcat2220caggactgtt ggtgtacact cag2243<210>3<211>700<212>PRT<213>小鼠<400>3Met Leu Ala Ser Ala Leu Leu Val Phe Leu Cys Cys Phe Lys Gly His1 5 10 15Ala Gly Ser Ser Pro Hi s Phe Leu Gln Gln Pro Glu Asp Met Val Val20 25 30Leu Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu Pro Cys Ala Leu Gly Ala Tyr Arg35 40 45
Gly Leu Val Gln Trp Thr Lys Asp Gly Leu Ala Leu Gly Gly Glu Arg50 55 60Asp Leu Pro Gly Trp Ser Arg Tyr Trp Ile Ser Gly Asn Ser Ala Ser65 70 75 80Gly Gln His Asp Leu His Ile Lys Pro Val Glu Leu Glu Asp Glu Ala85 90 95Ser Tyr Glu Cys Gln Ala Ser Gln Ala Gly Leu Arg Ser Arg Pro Ala100105 110Gln Leu His Val Met Val Pro Pro Glu Ala Pro Gln Val Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Val Ser Leu Val Ala Gly Val Pro Gly Asn Leu Thr Cys Arg130 135 140Ser Arg Gly Asp Ser Arg Pro Ala Pro Glu Leu Leu Trp Phe Arg Asp145 150 155 160Gly Ile Arg Leu Asp Ala Ser Ser Phe His Gln Thr Thr Leu Lys Asp165 170 175Lys Ala Thr Gly Thr Val Glu Asn Thr Leu Phe Leu Thr Pro Ser Ser180 185 190His Asp Asp Gly Ala Thr Leu Ile Cys Arg Ala Arg Ser Gln Ala Leu195 200 205Pro Thr Gly Arg Asp Thr Ala Val Thr Leu Ser Leu Gln Tyr Pro Pro210 215 220Met Val Thr Leu Ser Ala Glu Pro Gln Thr Val Gln Glu Gly Glu Lys225 230 235 240Val Thr Phe Leu Cys Gln Ala Thr Ala Gln Pro Pro Val Thr Gly Tyr245 250 255Arg Trp Ala Lys Gly Gly Ser Pro Val Leu Gly Ala Arg Gly Pro Arg260 265 270Leu Glu Val Val Ala Asp Ala Thr Phe Leu Thr Glu Pro Val Ser Cys275 280 285
Glu Val Ser Asn Ala Val Gly Ser Ala Asn Arg Ser Thr Ala Leu Glu290 295 300Val Leu Tyr Gly Pro Ile Leu Gln Ala Lys Pro Lys Ser Val Ser Val305 310 315 320Asp Val Gly Lys Asp Ala Ser Phe Ser Cys Val Trp Arg Gly Asn Pro325 330 335Leu Pro Arg Ile Thr Trp Thr Arg Met Gly Gly Ser Gln Val Leu Ser340 345 350Ser Gly Pro Thr Leu Arg Leu Pro Ser Val Ala Leu Glu Asp Ala Gly355 360 365Asp Tyr Val Cys Arg Ala Glu Pro Arg Arg Thr Gly Leu Gly Gly Gly370 375 380Lys Ala Gln Ala Arg Leu Thr Val Asn Ala Pro Pro Val Val Thr Ala385 390 395 400Leu Gln Pro Ala Pro Ala Phe Leu Arg Gly Pro Ala Arg Leu Gln Cys405 410 415Val Val Phe Ala Ser Pro Ala Pro Asp Ser Val Val Trp Ser Trp Asp420 425 430Glu Gly Phe Leu Glu Ala Gly Ser Leu Gly Arg Phe Leu Val Glu Ala435 440 445Phe Pro Ala Pro Glu Val Glu Gly Gly Gln Gly Pro Gly Leu Ile Ser450 455 460Val Leu His Ile Ser Gly Thr Gln Glu Ser Asp Phe Thr Thr Gly Phe465 470 475 480Asn Cys Ser Ala Arg Asn Arg Leu Gly Glu Gly Arg Val Gln Ile His485 490 495Leu Gly Arg Arg Asp Leu Leu Pro Thr Val Arg Ile Val Ala Gly Ala500 505 510Ala Ser Ala Ala Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Thr Gly Val Val Leu
515 520 525Cys Cys Trp Arg His Gly Ser Leu Ser Lys Gln Lys Asn Leu Val Arg530 535 540Ile Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Ser Ser Arg Gly Pro Glu Glu Glu545 550 555 560Thr Gly Ser Ser Glu Asp Arg Gly Pro Ile Val His Thr Asp His Ser565 570 575Asp Leu Val Leu Glu Glu Lys Glu Ala Leu Glu Thr Lys Asp Pro Thr580 585 590Asn Gly Tyr Tyr Lys Val Arg Gly Val Ser Val Ser Leu Ser Leu Gly595 600 605Glu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Phe Leu Pro Pro Pro Ser Pro Ile Gly610 615 620Leu Pro Gly Thr Pro Thr Tyr Tyr Asp Phe Lys Pro His Leu Asp Leu625 630 635 640Val Pro Pro Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Tyr Leu Thr Thr645 650 655Pro His Pro Arg Ala Phe Thr Ser Tyr Met Lys Pro Thr Ser Phe Gly660 665 670Pro Pro Asp Leu Ser Ser Gly Thr Pro Pro Phe Pro Tyr Ala Thr Leu675 680 685Ser Pro Pro Ser His Gln Arg Leu Gln Thr His Val690 695 700<210>4<211>650<212>PRT<213>小鼠<400>4Met Leu Ala Ser Ala Leu Leu Val Phe Leu Cys Cys Phe Lys Gly His1 5 10 15
Ala Gly Trp Ser Arg Tyr Trp Ile Ser Gly Asn Ser Ala Ser Gly Gln20 25 30His Asp Leu His Ile Lys Pro Val Glu Leu Glu Asp Glu Ala Ser Tyr35 40 45Glu Cys Gln Ala Ser Gln Ala Gly Leu Arg Ser Arg Pro Ala Gln Leu50 55 60His Val Met Val Pro Pro Glu Ala Pro Gln Val Leu Gly Gly Pro Ser65 70 75 80Val Ser Leu Val Ala Gly Val Pro Gly Asn Leu Thr Cys Arg Ser Arg85 90 95Gly Asp Ser Arg Pro Ala Pro Glu Leu Leu Trp Phe Arg Asp Gly Ile100 105 110Arg Leu Asp Ala Ser Ser Phe His Gln Thr Thr Leu Lys Asp Lys Ala115 120 125Thr Gly Thr Val Glu Asn Thr Leu Phe Leu Thr Pro Ser Ser His Asp130 135 140Asp Gly Ala Thr Leu Ile Cys Arg Ala Arg Ser Gln Ala Leu Pro Thr145 150 155 160Gly Arg Asp Thr Ala Val Thr Leu Ser Leu Gln Tyr Pro Pro Met Val165 170 175Thr Leu Ser Ala Glu Pro Gln Thr Val Gln Glu Gly Glu Lys Val Thr180 185 190Phe Leu Cys Gln Ala Thr Ala Gln Pro Pro Val Thr Gly Tyr Arg Trp195 200 205Ala Lys Gly Gly Ser Pro Val Leu Gly Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu210 215 220Val Val Ala Asp Ala Thr Phe Leu Thr Glu Pro Val Ser Cys Glu Val225 230 235 240Ser Asn Ala Val Gly Ser Ala Asn Arg Ser Thr Ala Leu Glu Val Leu
245 250 255Tyr Gly Pro Ile Leu Gln Ala Lys Pro Lys Ser Val Ser Val Asp Val260 265 270Gly Lys Asp Ala Ser Phe Ser Cys Val Trp Arg Gly Asn Pro Leu Pro275 280 285Arg Ile Thr Trp Thr Arg Met Gly Gly Ser Gln Val Leu Ser Ser Gly290 295 300Pro Thr Leu Arg Leu Pro Ser Val Ala Leu Glu Asp Ala Gly Asp Tyr305 310 315 320Val Cys Arg Ala Glu Pro Arg Arg Thr Gly Leu Gly Gly Gly Lys Ala325 330 335Gln Ala Arg Leu Thr Val Asn Ala Pro Pro Val Val Thr Ala Leu Gln340 345 350Pro Ala Pro Ala Phe Leu Arg Gly Pro Ala Arg Leu Gln Cys Val Val355 360 365Phe Ala Ser Pro Ala Pro Asp Ser Val Val Trp Ser Trp Asp Glu Gly370 375 380Phe Leu Glu Ala Gly Ser Leu Gly Arg Phe Leu Val Glu Ala Phe Pro385 390 395 400Ala Pro Glu Val Glu Gly Gly Gln Gly Pro Gly Leu Ile Ser Val Leu405 410 415His Ile Ser Gly Thr Gln Glu Ser Asp Phe Thr Thr Gly Phe Asn Cys420 425 430Ser Ala Arg Asn Arg Leu Gly Glu Gly Arg Val Gln Ile His Leu Gly435 440 445Arg Arg Asp Leu Leu Pro Thr Val Arg Ile Val Ala Gly Ala Ala Ser450 455 460Ala Ala Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Thr Gly Val Val Leu Cys Cys465 470 475 480
Trp Arg His Gly Ser Leu Ser Lys Gln Lys Asn Leu Val Arg Ile Pro485 490 495Gly Ser Ser Glu Gly Ser Ser Ser Arg Gly Pro Glu Glu Glu Thr Gly500 505 510Ser Ser Glu Asp Arg Gly Pro Ile Val His Thr Asp His Ser Asp Leu515 520 525Val Leu Glu Glu Lys Glu Ala Leu Glu Thr Lys Asp Pro Thr Asn Gly530 535 540Tyr Tyr Lys Val Arg Gly Val Ser Val Ser Leu Ser Leu Gly Glu Ala545 550 555 560Pro Gly Gly Gly Leu Phe Leu Pro Pro Pro Ser Pro Ile Gly Leu Pro565 570 575Gly Thr Pro Thr Tyr Tyr Asp Phe Lys Pro His Gln Asp Leu Val Pro580 585 590Pro Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Tyr Leu Thr Thr Pro His595 600 605Pro Arg Ala Phe Thr Ser Tyr Met Lys Pro Thr Ser Phe Gly Pro Pro610 615 620Asp Leu Ser Ser Gly Thr Pro Pro Phe Pro Tyr Ala Thr Leu Ser Pro625 630 635 640Pro Ser His Gln Arg Leu Gln Thr His Val645 650<210>5<211>2980<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>5cccagagacc caggccgcgg aactggcagg cgtttcagag cgtcagaggc tgcggatgag 60cagacttgga ggactccagg ccagagacta ggctgggcga agagtcgagc gtgaaggggg 120ctccgggcca gggtgacagg aggcgtgctt gagaggaaga agttgacggg aaggccagtg 180cgacggcaaa tctcgtgaac cttgggggac gaatgctcag gatgcgggtc cccgccctcc 240
tcgtcctcct cttctgcttc agagggagag caggcccgtc gccccatttc ctgcaacagc 300cagaggacct ggtggtgctg ctgggggagg aagcccggct gccgtgtgct ctgggcgcct 360actgggggct agttcagtgg actaagagtg ggctggccct agggggccaa agggacctac 420cagggtggtc ccggtactgg atatcaggga atgcagccaa tggccagcat gacctccaca 480ttaggcccgt ggagctagag gatgaagcat catatgaatg tcaggctaca caagcaggcc 540tccgctccag accagcccaa ctgcacgtgc tggtcccccc agaagccccc caggtgctgg 600gcggcccctc tgtgtctctg gttgctggag ttcctgcgaa cctgacatgt cggagccgtg 660gggatgcccg ccctacccct gaattgctgt ggttccgaga tggggtcctg ttggatggag 720ccaccttcca tcagaccctg ctgaaggaag ggacccctgg gtcagtggag agcaccttaa 780ccctgacccc tttcagccat gatgatggag ccacctttgt ctgccgggcc cggagccagg 840ccctgcccac aggaagagac acagctatca cactgagcct gcagtacccc ccagaggtga 900ctctgtctgc ttcgccacac actgtgcagg agggagagaa ggtcattttc ctgtgccagg 960ccacagccca gcctcctgtc acaggctaca ggtgggcaaa agggggctct ccggtgctcg 1020gggcccgcgg gccaaggtta gaggtcgtgg cagacgcctc gttcctgact gagcccgtgt 1080cctgcgaggt cagcaacgcc gtgggtagcg ccaaccgcag tactgcgctg gatgtgctgt 1140ttgggccgat tctgcaggca aagccggagc ccgtgtccgt ggacgtgggg gaagacgctt 1200ccttcagctg cgcctggcgc gggaacccgc ttccacgggt aacctggacc cgccgcggtg 1260gcgcgcaggt gctgggctct ggagccacac tgcgtcttcc gtcggtgggg cccgaggacg 1320caggcgacta tgtgtgcaga gctgaggctg ggctatcggg cctgcggggc ggcgccgcgg 1380aggctcggct gactgtgaac gctcccccag tagtgaccgc cctgcactct gcgcctgcct 1440tcctgagggg ccctgctcgc ctccagtgtc tggttttcgc ctctcccgcc ccagatgccg 1500tggtctggtc ttgggatgag ggcttcctgg aggcggggtc gcagggccgg ttcctggtgg 1560agacattccc tgccccagag agccgcgggg gactgggtcc gggcctgatc tctgtgctac 1620acatttcggg gacccaggag tctgacttta gcaggagctt taactgcagt gcccggaacc 1680ggctgggcga gggaggtgcc caggccagcc tgggccgtag agacttgctg cccactgtgc 1740ggatagtggc cggagtggcc gctgccacca caactctcct tatggtcatc actggggtgg 1800ccctctgctg ctggcgccac agcaaggcct cagcctcttt ctccgagcaa aagaacctga 1860tgcgaatccc tggcagcagc gacggctcca gttcacgagg tcctgaagaa gaggagacag 1920gcagccgcga ggaccggggc cccattgtgc acactgacca cagtgatctg gttctggagg 1980agaaagggac tctggagacc aaggacccaa ccaacggtta ctacaaggtc cgaggagtca 2040gtgtgagcct gagccttggc gaagcccctg gaggaggtct cttcctgcca ccaccctccc 2100cccttgggcc cccagggacc cctaccttct atgacttcaa cccacacctg ggcatggtcc 2160ccccctgcag actttacaga gccagggcag gctatctcac cacaccccac cctcgagctt 2220tcaccagcta catcaaaccc acatcctttg ggcccccaga tctggccccc gggactcccc 2280ccttcccata tgctgccttc cccacaccta gccacccgcg tctccagact cacgtgtgac 2340atctttccaa tggaagagtc ctgggatctc caacttgcca taatggattg ttctgatttc 2400tgaggcgcca ggacaagttg gcgaccttac tcctccaaaa ctgaacacaa ggggagggaa 2460agatcattac atttgtcagg agcatttgta tacagtcagc tcagccaaag gagatgcccc 2520aagtgggagc aacatggcca cccaatatgc ccacctattc cccggtgtaa aagagattca 2580agatggcagg taggcccttt gaggagagat ggggacaggg cagtgggtgt tgggagtttg 2640gggccgggat ggaagttgtt tctagccact gaaagaagat atttcaagat gaccatctgc 2700attgagagga aaggtagcat aggatagatg aagatgaaga gcataccagg ccccaccctg 2760gctctccctg aggggaactt tgctcggcca atggaaatgc agccaagatg gccatatact 2820ccctaggaac ccaagatggc caccatcttg attttacttt ccttaaagac tcagaaagac 2880
ttggacccaa ggagtgggga tacagtgaga attaccactg ttggggcaaa atattgggat 2940aaaaatattt atgtttaata ataaaaaaaa gtcaaagagg2980<210>6<211>708<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Leu Arg Met Arg Val Pro Ala Leu Leu Val Leu Leu Phe Cys Phe1 5 10 15Arg Gly Arg Ala Gly Pro Ser Pro His Phe Leu Gln Gln Pro Glu Asp20 25 30Leu Val Val Leu Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu Pro Cys Ala Leu Gly35 40 45Ala Tyr Trp Gly Leu Val Gln Trp Thr Lys Ser Gly Leu Ala Leu Gly50 55 60Gly Gln Arg Asp Leu Pro Gly Trp Ser Arg Tyr Trp Ile Ser Gly Asn65 70 75 80Ala Ala Asn Gly Gln His Asp Leu His Ile Arg Pro Val Glu Leu Glu85 90 95Asp Glu Ala Ser Tyr Glu Cys Gln Ala Thr Gln Ala Gly Leu Arg Ser100 105 110Arg Pro Ala Gln Leu His Val Leu Val Pro Pro Glu Ala Pro Gln Val115 120 125Leu Gly Gly Pro Ser Val Ser Leu Val Ala Gly Val Pro Ala Asn Leu130 135 140Thr Cys Arg Ser Arg Gly Asp Ala Arg Pro Thr Pro Glu Leu Leu Trp145 150 155 160Phe Arg Asp Gly Val Leu Leu Asp Gly Ala Thr Phe His Gln Thr Leu165 170 175Leu Lys Glu Gly Thr Pro Gly Ser Val Glu Ser Thr Leu Thr Leu Thr
180 185 190Pro Phe Ser His Asp Asp Gly Ala Thr Phe Val Cys Arg Ala Arg Ser195 200 205Gln Ala Leu Pro Thr Gly Arg Asp Thr Ala Ile Thr Leu Ser Leu Gln210 215 220Tyr Pro Pro Glu Val Thr Leu Ser Ala Ser Pro His Thr Val Gln Glu225 230 235 240Gly Glu Lys Val Ile Phe Leu Cys Gln Ala Thr Ala Gln Pro Pro Val245 250 255Thr Gly Tyr Arg Trp Ala Lys Gly Gly Ser Pro Val Leu Gly Ala Arg260 265 270Gly Pro Arg Leu Glu Val Val Ala Asp Ala Ser Phe Leu Thr Glu Pro275 280 285Val Ser Cys Glu Val Ser Asn Ala Val Gly Ser Ala Asn Arg Ser Thr290 295 300Ala Leu Asp Val Leu Phe Gly Pro Ile Leu Gln Ala Lys Pro Glu Pro305 310 315 320Val Ser Val Asp Val Gly Glu Asp Ala Ser Phe Ser Cys Ala Trp Arg325 330 335Gly Asn Pro Leu Pro Arg Val Thr Trp Thr Arg Arg Gly Gly Ala Gln340 345 350Val Leu Gly Ser Gly Ala Thr Leu Arg Leu Pro Ser Val Gly Pro Glu355 360 365Asp Ala Gly Asp Tyr Val Cys Arg Ala Glu Ala Gly Leu Ser Gly Leu370 375 380Arg Gly Gly Ala Ala Glu Ala Arg Leu Thr Val Asn Ala Pro Pro Val385 390 395 400Val Thr Ala Leu His Ser Ala Pro Ala Phe Leu Arg Gly Pro Ala Arg405 410 415
Leu Gln Cys Leu Val Phe Ala Ser Pro Ala Pro Asp Ala Val Val Trp420 425 430Ser Trp Asp Glu Gly Phe Leu Glu Ala Gly Ser Gln Gly Arg Phe Leu435 440 445Val Glu Thr Phe Pro Ala Pro Glu Ser Arg Gly Gly Leu Gly Pro Gly450 455 460Leu Ile Ser Val Leu His Ile Ser Gly Thr Gln Glu Ser Asp Phe Ser465 470 475 480Arg Ser Phe Asn Cys Ser Ala Arg Asn Arg Leu Gly Glu Gly Gly Ala485 490 495Gln Ala Ser Leu Gly Arg Arg Asp Leu Leu Pro Thr Val Arg Ile Val500 505 510Ala Gly Val Ala Ala Ala Thr Thr Thr Leu Leu Met Val Ile Thr Gly515 520 525Val Ala Leu Cys Cys Trp Arg His Ser Lys Ala Ser Ala Ser Phe Ser530 535 540Glu Gln Lys Asn Leu Met Arg Ile Pro Gly Ser Ser Asp Gly Ser Ser545 550 555 560Ser Arg Gly Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gly Ser Arg Glu Asp Arg Gly565 570 575Pro Ile Val His Thr Asp His Ser Asp Leu Val Leu Glu Glu Lys Gly580 585 590Thr Leu Glu Thr Lys Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Tyr Lys Val Arg Gly595 600 605Val Ser Val Ser Leu Ser Leu Gly Glu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Phe610 615 620Leu Pro Pro Pro Ser Pro Leu Gly Pro Pro Gly Thr Pro Thr Phe Tyr625 630 635 640Asp Phe Asn Pro His Leu Gly Met Val Pro Pro Cys Arg Leu Tyr Arg645 650 655
Ala Arg Ala Gly Tyr Leu Thr Thr Pro His Pro Arg Ala Phe Thr Ser660 665 670Tyr Ile Lys Pro Thr Ser Phe Gly Pro Pro Asp Leu Ala Pro Gly Thr675 680 685Pro Pro Phe Pro Tyr Ala Ala Phe Pro Thr Pro Ser His Pro Arg Leu690 695 700Gln Thr His Val705<210>7<211>2976<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7gggaactggc aggcgtttca gagcgtcaga ggctgcggat gagcagactt ggaggactcc 60aggccagaga ctaggctggg cgaagagtcg agcgtgaagg gggctccggg ccagggtgac 120aggaggcgtg cttgagagga agaagttgac gggaaggcca gtgcgacggc aaatctcgtg 180aaccttgggg gacgaatgct caggatgcgg gtccccgccc tcctcgtcct cctcttctgc 240ttcagaggga gagcaggccc gtcgccccat ttcctgcaac agccagagga cctggtggtg 300ctgctggggg aggaagcccg gctgccgtgt gctctgggcg cctactgggg gctagttcag 360tggactaaga gtgggctggc cctagggggc caaagggacc taccagggtg gtcccggtac 420tggatatcag ggaatgcagc caatggccag catgacctcc acattaggcc cgtggagcta 480gaggatgaag catcatatga atgtcaggct acacaagcag gcctccgctc cagaccagcc 540caactgcacg tgctggtccc cccagaagcc ccccaggtgc tgggcggccc ctctgtgtct 600ctggttgctg gagttcctgc gaacctgaca tgtcggagcc gtggggatgc ccgccctgcc 660cctgaattgc tgtggttccg agatggggtc ctgttggatg gagccacctt ccatcagacc 720ctgctgaagg aagggacccc tgggtcagtg gagagcacct taaccctgac cccctttcag 780ccatgatgat ggagccacct ttgtctgccg ggcccggagc caggccctgc ccacaggaag 840agacacagct atcacactga gcctgcagta ccccccagag gtgactctgt ctgcttcgcc 900acacactgtg caggagggag agaaggtcat tttcctgtgc caggccacag cccagcctcc 960tgtcacaggc tacaggtggg caaaaggggg ctctccggtg ctcggggccc gcgggccaag 1020gttagaggtc gtggcagacg cctcgttcct gactgagccc gtgtcctgcg aggtcagcaa 1080cgccgtgggt agcgccaacc gcagtactgc gctggatgtg ctgtttgggc cgattctgca 1140ggcaaagccg gagcccgtgt ccgtggacgt gggggaagac gcttccttca gctgcgcctg 1200gcgcgggaac ccgcttccac gggtaacctg gacccgccgc ggtggcgcgc aggtgctggg 1260ctctggagcc acactgcgtc ttccgtcggt ggggcccgag gacgcaggcg actatgtgtg 1320cagagctgag gctgggctat cgggcctgcg gggcggcgcc gcggaggctc ggctgactgt 1380gaacgctccc ccagtagtga ccgccctgca ctctgcgcct gccttcctga ggggccctgc 1440
tcgcctccag tgtctggttt tcgcctctcc cgccccagat gccgtggtct ggtcttggga 1500tgagggcttc ctggaggcgg ggtcgcaggg ccggttcctg gtggagacat tccctgcccc 1560agagagccgc gggggactgg gtccgggcct gatctctgtg ctacacattt cggggaccca 1620ggagtctgac tttagcagga gctttaactg cagtgcccgg aaccggctgg gcgagggagg 1680tgcccaggcc agcctgggcc gtagagactt gctgcccact gtgcggatag tggccggagt 1740ggccgctgcc accacaactc tccttatggt catcactggg gtggccctct gctgctggcg 1800ccacagcaag gcctcagcct ctttctccga gcaaaagaac ctgatgcgaa tccctggcag 1860cagcgacggc tccagttcac gaggtcctga agaagaggag acaggcagcc gcgaggaccg 1920gggccccatt gtgcacactg accacagtga tctggttctg gaggaggaag ggactctgga 1980gaccaaggac ccaaccaacg gttactacaa ggtccgagga gtcagtgtga gcctgagcct 2040tggcgaagcc cctggaggag gtctcttcct gccaccaccc tccccccttg ggcccccagg 2100gacccctacc ttctatgact tcaacccaca cctgggcatg gtccccccct gcagacttta 2160cagagccagg gcaggctatc tcaccacacc ccaccctcga gctttcacca gctacatcaa 2220acccacatcc tttgggcccc cagatctggc ccccgggact ccccccttcc catatgctgc 2280cttccccaca cctagccacc cgcgtctcca gactcacgtg tgacatcttt ccaatggaag 2340agtcctggga tctccaactt gccatcctgg attgttctga tttctgagga gccaggacaa 2400gttggcgacc ttactcctcc aaaactgaac acaaggggag ggaaagatca ttacatttgt 2460caggagcatt tgtatacagt cagctcagcc aaaggagatg ccccaagtgg gagcaacatg 2520gccacccaat atgcccacct attccccggt gtaaaagaga ttcaagatgg caggtaggcc 2580ctttgaggag agatggggac agggcagtgg gtgttgggag tttggggccg ggatggaagt 2640tgtttctagc cactgaaaga agatatttca agatgaccat ctgcattgag aggaaaggta 2700gcataggata gatgaagatg aagagcatac caggccccac cctggctctc cctgagggga 2760actttgctcg gccaatggaa atgcagccaa gatggccata tactccctag gaacccaaga 2820tggccaccat cttgatttta ctttccttaa agacacagaa agacttggac ccaaggagtg 2880gggatacagt gagaattacc actgttgggg caaaatattg ggataaaaat atttatgttt 2940aataataaaa aaaagtcaaa aaaaaaaaaa aaaaaa2976<210>8<211>196<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Leu Arg Met Arg Val Pro Ala Leu Leu Val Leu Leu Phe Cys Phe1 5 10 15Arg Gly Arg Ala G1y Pro Ser Pro His Phe Leu G1n Gln Pro Glu Asp20 25 30Leu Val Val Leu Leu Gly Glu G1u Ala Arg Leu Pro Cys A1a Leu G1y35 40 45Ala Tyr Trp Gly Leu Val G1n Trp Thr Lys Ser Gly Leu Ala Leu Gly
50 55 60Gly G1n Arg Asp Leu Pro G1y Trp Ser Arg Tyr Trp Ile Ser Gly Asn65 70 75 80Ala Ala Asn Gly Gln His Asp Leu His Ile Arg Pro Val Glu Leu Glu85 90 95Asp Glu Ala Ser Tyr Glu Cys Gln Ala Thr Gln Ala Gly Leu Arg Ser100 105 110Arg Pro Ala Gln Leu His Val Leu Val Pro Pro Glu Ala Pro Gln Val115 120 125Leu Gly Gly Pro Ser Val Ser Leu Val Ala Gly Val Pro Ala Asn Leu130 135 140Thr Cys Arg Ser Arg Gly Asp Ala Arg Pro Ala Pro Glu Leu Leu Trp145 150 155 160Phe Arg Asp Gly Val Leu Leu Asp Gly Ala Thr Phe His Gln Thr Leu165 170 175Leu Lys Glu Gly Thr Pro Gly Ser Val Glu Ser Thr Leu Thr Leu Thr180 185 190Pro Phe Gln Pro195<210>9<211>1532<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>9cccagagacc caggccgcgg aactggcagg cgtttcagag cgtcagaggc tgcggatgag 60cagacttgga ggactccagg ccagagacta ggctgggcga agagtcgagc gtgaaggggg 120ctccgggcca gggtgacagg aggcgtgctt gagaggaaga agttgacggg aaggccagtg 180cgacggcaaa tctcgtgaac cttgggggac gaatgctcag gatgcgggtc cccgccctcc 240tcgtcctcct cttctgcttc agagggagag caggcccgtc gccccatttc ctgcaacagc 300cagaggacct ggtggtgctg ctgggcgagg gaggtgccca ggccagcctg ggccgtagag 360cctcagcctc tttctccgag caaaagaacc tgatgcgaat ccctggcagc agcgacggct 420ccagttcacg aggtcctgaa gaagaggaga caggcagccg cgaggaccgg ggccccattg 480
tgcacactga ccacagtgat ctggttctgg aggaggaagg gactctggag accaaggacc 540caaccaacgg ttactacaag gtccgaggag tcagtgtgag cctgagcctt ggcgaagccc 600ctggaggagg tctcttcctg ccaccaccct ccccccttgg gcccccaggg acccctacct 660tctatgactt caacccacac ctgggcatgg tccccccctg cagactttac agagccaggg 720caggctctct caccacaccc caccctcgag ctttcaccag ctacatcaaa cccacatcct 780ttgggccccc agatctggcc cccgggactc cccccttccc atatgctgcc ttccccacac 840ctagccaccc gcgtctccag actcacgtgt gacatctttc caatggaaga gtcctgggat 900ctccaacttg ccataatgga ttgttctgat ttctgaggag ccaggacaag ttggcgacct 960tactcctcca aaactgaaca caaggggagg gaaagatcat tacatttgtc aggagcattt 1020gtatacagtc agctcagcca aaggagatgc cccaagtggg agcaacatgg ccacccaata 1080tgcccaccta ttccccggtg taaaagagat tcaagatggc aggtaggccc tttgaggaga 1140gatggggaca gggcagtggg tgttgggagt ttggggccgg gatggaagtt gtttctagcc 1200actgaaagaa gatatttcaa gatgaccatc tgcattgaga ggaaaggtag cataggatag 1260atgaagatga agagcatacc aggccccacc ctggctctcc ctgaggggaa ctttgctcgg 1320ccaatggaaa tgcagccaag atggccatat actccctagg aacccaagat ggccaccatc 1380ttgattttac tttccttaaa gactcagaaa gacttggacc caaggagtgg ggatacagtg 1440agaattacca ctgttggggc aaaatattgg gataaaaata tttatgttta ataataaaaa 1500aaagtcaaag aggcaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1532<210>10<211>219<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Met Leu Arg Met Arg Val Pro Ala Leu Leu Val Leu Leu Phe Cys Phe1 5 10 15Arg Gly Arg Ala Gly Pro Ser Pro His Phe Leu Gln Gln Pro Glu Asp20 25 30Leu Val Val Leu Leu Gly Glu Gly Gly Ala Gln Ala Ser Leu Gly Arg35 40 45Arg Ala Ser Ala Ser Phe Ser Glu Gln Lys Asn Leu Met Arg Ile Pro50 55 60Gly Ser Ser Asp Gly Ser Ser Ser Arg Gly Pro Glu Glu Glu Glu Thr65 70 75 80Gly Ser Arg Glu Asp Arg Gly Pro Ile Val His Thr Asp His Ser Asp85 90 95
Leu Val Leu Glu Glu Glu Gly Thr Leu Glu Thr Lys Asp Pro Thr Asn100 105 110Gly Tyr Tyr Lys Val Arg Gly Val Ser Val Ser Leu Ser Leu Gly Glu115 120 125Ala Pro Gly Gly Gly Leu Phe Leu Pro Pro Pro Ser Pro Leu Gly Pro130 135 140Pro Gly Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Phe Asn Pro His Leu Gly Met Val145 150 155 160Pro Pro Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Tyr Leu Thr Thr Pro165 170 175His Pro Arg Ala Phe Thr Ser Tyr Ile Lys Pro Thr Ser Phe Gly Pro180 185 190Pro Asp Leu Ala Pro Gly Thr Pro Pro Phe Pro Tyr Ala Ala Phe Pro195 200 205Thr Pro Ser His Pro Arg Leu Gln Thr His Val210 215<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>11cagctccaca acctacatca ttccgt26<210>12<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭
<400>12acggaatgat gt 12<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>13gtccatcttc tctctgagac tctggt26<210>14<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>14accagagtct ca 12<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>15ctgatgggtg tcttctgtga gtgtgt26<210>16<211>12<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>16acacactcac ag 12<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>17ccagcatcga gaatcagtgt gacagt26<210>18<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>18actgtcacac tg 12<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>19gtcgatgaac ttcgactgtc gatcgt26
<210>20<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA擴(kuò)增所用的接頭<400>20acgatcgaca gt 12<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>21ggctttacac tttatgcttc cggctc26<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>22cagctatgac catgattacg ccaagc26<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物
<400>23aggcgattaa gttgggtaac gccagg 26<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>24ccagtcacga cgttgtaaaa cgacgg 26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>25cttcccgtat gctaccttgt ctccac 26<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>26tccatctctc caagtgaagg gtcttg 26<210>27<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>27ccaacagtcc tgcatgcttg taatga26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>28tccttcaatg ttcagttttg gagggg2權(quán)利要求
1.一種含有選自核苷酸序列(i)到(iv)的序列的多核苷酸，其中所述核苷酸序列編碼剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)的65B13多肽，或其抗原片段，(i)含有SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列中任意一個(gè)互補(bǔ)的序列；(ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；(iii)編碼在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失信號(hào)序列部分所得的氨基酸序列的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；(iv)編碼在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列；和(v)在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列(i)雜交的核苷酸序列。
2.一種載體，包含權(quán)利要求1的多核苷酸。
3.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求1的多核苷酸或權(quán)利要求2的載體。
4.一種多肽，由權(quán)利要求1的多核苷酸編碼。
5.權(quán)利要求4所述多肽的片段，包含至少8個(gè)氨基酸殘基。
6.抗體，抗權(quán)利要求4的多肽或權(quán)利要求5的多肽片段。
7.核苷酸鏈，編碼權(quán)利要求5的多肽片段。
8.一種選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的方法，包括將權(quán)利要求6所述抗體與認(rèn)為包含產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸的步驟。
9.一種選擇產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元的方法，包括將含有權(quán)利要求4所述多肽的至少胞外部分的肽與認(rèn)為含有產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞樣品接觸的步驟。
10.剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞，用權(quán)利要求8或9的方法選出。
11.分離基因的方法，所述基因是產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性基因以及前體細(xì)胞成熟為產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元過(guò)程中的階段-特異性基因，所述方法包括檢測(cè)和分離在權(quán)利要求10的前體細(xì)胞或其分化、誘導(dǎo)或增殖后得到的細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。
12.以成熟作為指標(biāo)進(jìn)行篩選的方法，包括如下步驟，將試驗(yàn)物質(zhì)與權(quán)利要求10的前體細(xì)胞接觸，并檢測(cè)因接觸導(dǎo)致的所述前體細(xì)胞的分化或增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及剛剛停止分裂的產(chǎn)多巴胺型神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異和瞬時(shí)表達(dá)的新基因65B13。65B13在細(xì)胞中的表達(dá)可作為指標(biāo)來(lái)選擇在其安全性、存活率和網(wǎng)絡(luò)形成能力方面適合于帕金森氏病等神經(jīng)變性疾病的移植治療的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1891826SQ20061009161
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月22日
發(fā)明者皆木康子, 尾野雄一, 坂本佳正, 水原英理, 中谷智哉, 高井義美 申請(qǐng)人:衛(wèi)材株式會(huì)社