專利名稱：細(xì)胞生長表面的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種生長表面、細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)和制造方法，特別是一種可大量收獲細(xì)胞的生長表面、細(xì)胞培養(yǎng)的制造方法。
背景技術(shù)：
生物科技及基因工程的革命性進(jìn)步創(chuàng)造了細(xì)胞產(chǎn)品的高市場需求，諸如蛋白質(zhì)藥物、細(xì)胞激素(cytokines)、干擾素(interferon)、單細(xì)胞繁殖抗體(monoclonal antibodies)、荷爾蒙、生長因子、胰島素(insulin)、病毒性產(chǎn)品、疫苗(vaccines)、核酸(nucleic acids)、酵素(enzymes)以及移植細(xì)胞或移植組織等。該產(chǎn)品的市場需求因此帶動(dòng)了對經(jīng)濟(jì)、有效的大規(guī)模生產(chǎn)方法的需求。
真核細(xì)胞(Eukaryotic cells)，例如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，應(yīng)用在生產(chǎn)高品質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品已經(jīng)越來越普遍，利用培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)疫苗、基因工程蛋白質(zhì)、藥物和其它細(xì)胞產(chǎn)品的方法已持續(xù)很長一段時(shí)間；一般來說，真核細(xì)胞分為貼附依賴性細(xì)胞(anchorage-dependent)、非貼附依賴性細(xì)胞(anchorage-independent)、或兩者皆是；然而，真核細(xì)胞通常為貼附依賴性細(xì)胞，因此需要一生長表面(growth surface)使之固定、增生、以及制造出所需的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；貼附依賴性細(xì)胞例如有纖維組織母細(xì)胞(fibroblasts)、上皮細(xì)胞(epithelial cells)及內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells)；真核細(xì)胞當(dāng)中的淋巴細(xì)胞(lymphocytes)、某些型變(transformed)細(xì)胞和癌細(xì)胞為非貼附依賴性細(xì)胞，可懸浮生長不需依賴某支撐物；不論真核細(xì)胞為貼附依賴性細(xì)胞或非貼附依賴性細(xì)胞或兩者皆是，大部分的真核細(xì)胞在培養(yǎng)過程中有下述共同特點(diǎn)，且該特點(diǎn)在設(shè)計(jì)有效生長表面及培養(yǎng)組件時(shí)，扮演著重要的角色。
在所有類型的培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)中，包含但不限制于傳統(tǒng)的單層(mono-layer)培養(yǎng)或利用載體(carrier)培養(yǎng)或微載體系統(tǒng)，貼附依賴性細(xì)胞中用來貼附附的生長表面對細(xì)胞活性是重要關(guān)鍵和基礎(chǔ)，由于貼附依賴性細(xì)胞的增殖(proliferation)只會(huì)于貼附在一適當(dāng)?shù)纳L表面之后發(fā)生，因此使用一可增強(qiáng)細(xì)胞貼附度的表面和培養(yǎng)程序?yàn)橐幌喈?dāng)重要的課題；細(xì)胞貼附包含貼附因子的吸附，比方說蛋白質(zhì)貼附于一培養(yǎng)表面、透過培養(yǎng)生長表面與細(xì)胞接觸、細(xì)胞貼附于一處理過且適合細(xì)胞貼附的表面、細(xì)胞的延展及復(fù)制增生使其遍及于一生長表面上的各處，直到這些細(xì)胞接觸到其它的培養(yǎng)(surface-growing)細(xì)胞為止(亦即所謂的抑制接觸(contact inhibition))。
可實(shí)行的貼附依賴性細(xì)胞培養(yǎng)，必須包含一個(gè)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)生長表面或載體、可提供不同種類細(xì)胞循環(huán)性培養(yǎng)的培養(yǎng)基的機(jī)械結(jié)構(gòu)，以及可供給足夠氣體以支撐和維持細(xì)胞生長的適當(dāng)環(huán)境；培養(yǎng)細(xì)胞有多種不同的方法，其中包含于培養(yǎng)的過程當(dāng)中除了氧氣之外，不再補(bǔ)充培養(yǎng)液的批次系統(tǒng)(batchsystem)；以及滋養(yǎng)物和氧氣(feed)被監(jiān)控且于必要時(shí)會(huì)再補(bǔ)充的饋料批次系統(tǒng)(fed-batch)；以及滋養(yǎng)物和廢棄物被監(jiān)控又不間斷地填充新鮮的培養(yǎng)基的灌流系統(tǒng)(perfusion system)。
培養(yǎng)載體有許多已知的不同型樣種類，例如葡萄糖聚體(如CytodexI、二乙氨基乙基葡聚精(DEAE-dextran)和Cytodex III、豬的覆蓋膠原蛋白的葡萄糖聚體(porcine collagen-coated dextran)；Amersham-Pharmacia，UK)或涂上聚苯乙烯(coated polystyrene-based)為基底的微載體；典型的微載體非常細(xì)小且直徑大約只有50至250微米，然而，更大或更小尺寸的微載體也曾被使用過(美國專利號(hào)5114855，于1992年5月19日頒布)。第二種細(xì)胞培養(yǎng)載體的型樣包含一由陶瓷、聚氨酯泡棉、或聚乙烯對苯二甲酸酯(polyethylene terephthalate，PET)、或聚乳酸聚甘醇酸(poly-(lactic-co-glycolic)-acid，PLGA)，其為生物所能分解的材質(zhì)、膠原蛋白、或殼聚糖(chitosan)所組成的多孔隙基質(zhì)材質(zhì)；此類產(chǎn)品為以聚乙烯對苯二甲酸酯為基礎(chǔ)所衍生出的產(chǎn)品(例如由臺(tái)灣CESCO Bioengineering，公司所生產(chǎn)的BioNOC II載體，及由美國New Brunswick Scientifics公司生產(chǎn)的FibraCel載體)。
細(xì)胞培養(yǎng)載體更可根據(jù)其表面的特性予以分類，舉例說明，可區(qū)分成非多孔隙式或無孔隙式；一般來說，多孔隙載體相對于非多孔隙式的載體而言，具有較多的優(yōu)點(diǎn)，多孔隙載體不但提供了一較大面積/體積比例，而且也提供了一屏障以保護(hù)細(xì)胞；因?yàn)槎嗫紫遁d體的本質(zhì)，這些載體于生長表面內(nèi)形成了三維孔穴，因此可使得細(xì)胞貼附產(chǎn)生最大化，同時(shí)也保護(hù)細(xì)胞使之遠(yuǎn)離由于攪拌、充氣所造成的剪應(yīng)力(shearing stress)和在飼育或收獲細(xì)胞過程時(shí)被逐出或被毀壞的風(fēng)險(xiǎn)。
目前多數(shù)已知可實(shí)行的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是利用多孔隙/非多孔隙式/或無孔隙的微載體，目前的貼附依賴性細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)利用微載體小珠(beads)當(dāng)作微載體，此微載體必須與活躍或具有充氣能力的設(shè)備結(jié)合，然而，微載體系統(tǒng)的常見問題為支撐細(xì)胞培養(yǎng)所需的活躍的行動(dòng)會(huì)毀壞或甚至摧毀細(xì)胞，如此一來，培養(yǎng)系統(tǒng)的效率和細(xì)胞產(chǎn)品的產(chǎn)量將會(huì)降低。
微載體系統(tǒng)也可制造于一小型球體內(nèi)，由離子交換膠(ion exchange gel)、葡萄聚糖(dextran)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)或膠原蛋白材質(zhì)所形成；這些材質(zhì)是根據(jù)本身與細(xì)胞之間的適合性、攪拌后的恢復(fù)力、以及能維持微載體懸浮于培育培養(yǎng)基間的獨(dú)特引力所挑選出，微載體通常會(huì)保持在培養(yǎng)基內(nèi)且隨著輕柔的攪拌而懸浮于在器皿中，其中攪拌是為了確保所有細(xì)胞皆能分配到同量的滋養(yǎng)物和空氣。因?yàn)槲⑤d體的高面積/體積比例以及能夠平均分配營養(yǎng)至細(xì)胞的特性，所以微載體系統(tǒng)目前被認(rèn)為是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中最適宜的系統(tǒng)。
然而，目前的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)仍具有許多缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)包含高成本和由于在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞暴露在攪拌及充氣所造成的高度剪力(shearforces)環(huán)境下所致的細(xì)胞損耗率高。一般來說，大多數(shù)微載體利用多孔隙且非剛性的葡萄聚糖作為一支撐基質(zhì)，此可壓縮的基質(zhì)是用來減少微載體在劇烈反應(yīng)而碰撞時(shí)該微載體及粘附于微載體的細(xì)胞毀壞的可能性(Microcarrier Cell CulturePrinciples and Methods，Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden，pages 5-33(1981))。然而，這些多孔隙微載體在培養(yǎng)過程中吸附了培養(yǎng)基中的成長因子，因而造成細(xì)胞生長減緩(Butler，M.，“GrowthLimitations in Microcarder Cultures”，Adv.Biochem.Eng./Biotech.457-84(1987))。
美國專利號(hào)5015576，1991年5月14日頒布，此專利提出制造粒塵(particles)的方法，于一基質(zhì)材料的水般(親水)溶劑內(nèi)，加入一不溶水的固體、液體或形成孔穴的氣體，產(chǎn)生一混合物以封住孔穴，接著，利用在一不溶水的散布溶液中散步以形成顆粒，此基質(zhì)利用冷卻、共價(jià)交聯(lián)(covalent cross-linking)、或聚合作用(polymerization)使之不溶于水。待形成孔穴的混合物被洗掉之后，粒塵便可在膠體過濾(filtration)、疏水性層析法(hydrophobic chromatography)或于親和性(affinity)層析法過程中，用以作為離子轉(zhuǎn)換器(ion exchanger)，而后隨意衍生出粒塵；這些顆粒也可用以當(dāng)作用來培養(yǎng)貼附依賴性細(xì)胞的微載體。
美國專利號(hào)5385836，1995年1月31日頒布，此專利有關(guān)于一種當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)或當(dāng)欲固定動(dòng)物細(xì)胞時(shí)供動(dòng)物細(xì)胞粘附的載體；此載體的制造方法是于多孔隙基質(zhì)(substrate)上涂上一層以包含甲殼素(chitosan)的混合物形式的細(xì)胞粘性材質(zhì)。多孔隙基質(zhì)為一由充滿不織布(non-woven fabric)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物及和搭配一包含絲蛋白(silk firoin)、動(dòng)物膠(gelatin)和殼聚糖的粘附樹脂所形成的不織布；不織布的外層使不織布與一將絲蛋白和動(dòng)物膠加入酸性水般的殼聚糖溶劑內(nèi)的溶劑接觸，以形成涂層；接著，風(fēng)干此具有涂層的不織布，并利用強(qiáng)堿處理使殼聚體不溶于水。
美國專利號(hào)5565361，于1996年10月15日頒布，此專利是關(guān)于一種用以增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)和增殖細(xì)胞的生物反應(yīng)器，其包含一殼體、一靜態(tài)攪拌組件，細(xì)胞貼附在該攪拌組件上以及提供培養(yǎng)基以允許貼附的細(xì)胞成長和分裂；靜態(tài)攪拌組件以及生物反應(yīng)器包含一多孔隙纖維狀的薄片材料，如波紋狀(corrugated)材料或編織(knitted woven)金屬線材料，如不銹鋼或鈦金屬，和一個(gè)預(yù)先決定尺寸的纖維以提供細(xì)胞貼附生長的最大表面積。
美國專利號(hào)5739021，于1998年4月14日頒布，是關(guān)于一供生物催化劑、一不溶水的無機(jī)注入器以及從聚乙烯和聚丙烯挑選出的一聚烯烴類粘附劑使用的一多孔隙載體，此多孔隙載體為打開孔隙并允許細(xì)胞穿過其中且于孔隙內(nèi)生長，密度約1g/cm3。
美國專利號(hào)6214618，于2001年4月10日頒布，是關(guān)于利用少量苯乙烯共聚物核心(styrene copolymer core)與功能性群組交叉結(jié)合于小珠的表面上，以形成微載體小珠的方法，以及利用堿性和酸性溶劑清洗微載體小珠使之適合細(xì)胞培養(yǎng)的方法；微載體小珠也可由苯乙烯共聚物核心和已經(jīng)利用堿性及酸性溶劑清洗過的三甲胺(tri-methylamine)外表所形成，使小珠適合于細(xì)胞培養(yǎng)。
盡管有多樣化的先前技術(shù)提出有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)的載體，卻沒有一個(gè)載體是適用于可程控降解(programmable degradation)和允許在細(xì)胞培養(yǎng)釋放細(xì)胞的同時(shí)，仍可保持高面積/體積比例以及細(xì)胞粘附度的特性。
隨著生物科技的快速發(fā)展，任何細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，不論是真核細(xì)胞或真核基因細(xì)胞，都日益重要，一般來說，真核細(xì)胞成長速度較緩慢也較易因剪應(yīng)力和污染而受到損傷；多數(shù)的真核細(xì)胞為粘附性細(xì)胞，需要一生長表面供粘附性細(xì)胞粘附和生長，為了適應(yīng)真核細(xì)胞的培育，不同的載體和生長表面也被一一發(fā)展出來；目前大多可實(shí)行的載體為平滑表面的載體，其形成于葡萄聚糖材料、由聚氨酯或聚乙烯對苯二甲酸酯所形成的多孔隙基質(zhì)和半滲透膜(如由中空纖維或醋酸纖維所形成的空心纖維)上。然而，透過這些載體所培殖出的細(xì)胞獲量是令人討厭的、容易被污染影響的缺點(diǎn)，尤其是多孔隙架構(gòu)的載體幾乎不可能培養(yǎng)出良好的細(xì)胞。因此，粘附性細(xì)胞的培育為緩慢、勞力密集和昂貴的工藝，因此，發(fā)展一可解決收獲細(xì)胞的培養(yǎng)載體實(shí)為一個(gè)迫切課題。
貼附依賴性細(xì)胞的載體有兩種主要的形態(tài)，分別為微粒狀(particulate)的平滑表面載體(非多孔隙式或無孔隙)和多孔隙載體；平滑表面無法適用于大生長表面區(qū)域，因此細(xì)胞粘附和生長的數(shù)目也會(huì)被限制；另外一方面，多孔隙載體提供至少三維的孔穴以供細(xì)胞安居，這些載體的多孔隙性也創(chuàng)造了額外的表面區(qū)域供載體粘附，因此可保護(hù)細(xì)胞遠(yuǎn)離直接與由充氣、攪拌及培育所產(chǎn)生的剪應(yīng)力接觸的風(fēng)險(xiǎn)。
應(yīng)用藻素酸(alginic acid)或褐藻膠(alginate)所形成的載體來包埋固定細(xì)胞的方法已經(jīng)實(shí)行很長一段時(shí)間，然而，在無菌條件下進(jìn)行細(xì)胞包埋是一種非常冗長、容易造成污染且通常只局限于非貼附依賴性細(xì)胞的技術(shù)。褐藻膠載體容易利用添加螯合劑(chelating agent)(例如二乙胺四乙酸，Ethylene-diamine-tetraacetic acid(EDTA)或檸檬酸鈉，sodium citrate)予以分解。待載體分解完畢后細(xì)胞則非常容易地被釋放，因此褐藻膠為大量培養(yǎng)細(xì)胞或組織的有潛力的材料。
但是，利用褐藻膠當(dāng)作培養(yǎng)細(xì)胞/組織的載體有三大主要問題1.為了包埋細(xì)胞，常見的褐藻膠微珠內(nèi)的養(yǎng)分交換和質(zhì)傳遭受嚴(yán)重限制，因此，于培養(yǎng)過程中會(huì)局限細(xì)胞的密度及其生存能力；2.褐藻膠通常被視為是細(xì)胞粘附抗體(cell adhesion resistant，CAR)材料，因此，大部分的粘附性細(xì)胞無法于褐藻膠的表面粘附和生長，進(jìn)而限制了褐藻膠的應(yīng)用；3.多孔隙式褐藻膠載體的機(jī)械強(qiáng)度很低，在激烈的培養(yǎng)環(huán)境中對降解非常敏感，尤其是包含鈉和鉀離子的培養(yǎng)基。因此，褐藻膠的應(yīng)用只局限在靜態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境，且無法應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)。根據(jù)上述褐藻膠的限制，藻素酸甚少被用來當(dāng)作大量生產(chǎn)粘附性細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)的材料。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，即，在培養(yǎng)過程中經(jīng)攪拌和充氣使微載體培養(yǎng)系統(tǒng)暴露在高程度的剪力中所造成的高成本和高損耗率，本發(fā)明提供一種利用堅(jiān)硬、多孔隙固體層保護(hù)細(xì)胞生長表面完整性的方法。
為了解決上述多孔隙微載體為了固定導(dǎo)致成長因子吸附作用的細(xì)胞產(chǎn)品和培養(yǎng)基內(nèi)的其它組件，本發(fā)明在培養(yǎng)媒介中添加額外的鈣離子圍繞在褐藻水膠表面使得粘附性細(xì)胞以一可比較的成長速度和密度粘附延展和增生。
為了解決上述藻素酸(或褐藻膠)所形成的載體的缺點(diǎn)，包括細(xì)胞密度和可用性被培養(yǎng)過程中被限制、大部分的粘附性細(xì)胞無法于褐藻膠表面上粘附或成長以及多孔隙褐藻膠載體的機(jī)構(gòu)強(qiáng)度過低；本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加額外的鈣離子圍繞在褐藻水膠表面使得粘附性細(xì)胞以可比較的成長速度及密度粘附延展和成長，保護(hù)多孔隙褐藻膠基質(zhì)于一網(wǎng)內(nèi)，多孔隙培育基質(zhì)的完整性于細(xì)胞培養(yǎng)過程中可維持很長的周期。
為了解決上述細(xì)胞培養(yǎng)的載體的缺點(diǎn)，包括平滑表面的載體(非多孔隙式或無孔隙的載體)無法適合于大的生長表面區(qū)域，因此，粘附或生長的細(xì)胞數(shù)目被限制、欲利用多孔隙載體培養(yǎng)出大量細(xì)胞通常非常困難，以及沒有任何一個(gè)載體適合使用可程控降解和適合于細(xì)胞培養(yǎng)中，在保持高面積/體積比例及細(xì)胞粘附特性下仍能容易地釋放細(xì)胞等；本發(fā)明提供一種制造方法，該方法為提供多孔隙、能夠被完全降解、以及在培養(yǎng)過程結(jié)束時(shí)能釋放所有的細(xì)胞、因此很容易達(dá)成高細(xì)胞密度的培養(yǎng)以及高良率的細(xì)胞收獲量目的的簡化工藝。
本發(fā)明披露了一供培養(yǎng)細(xì)胞使用的新穎可降解的生長表面和結(jié)構(gòu)，該生長表面可使細(xì)胞粘附度達(dá)到最大值，促進(jìn)細(xì)胞生長，增加機(jī)械強(qiáng)度，可利用幾何操作有效地增加表面區(qū)域以增加細(xì)胞密度。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，以供細(xì)胞/組織大量生產(chǎn)。
本發(fā)明目的還在于提供在可程控降解之前仍可保持多孔隙載體機(jī)械強(qiáng)度的培育載體系統(tǒng)，此培育載體系統(tǒng)可向上堆疊在其它培育載體系統(tǒng)上而彼此不重疊，于培養(yǎng)器皿或生物反應(yīng)器中提供至少一三維的空間使簡化培養(yǎng)載體的流程不受拘束且單一化；另外，當(dāng)細(xì)胞培育完成后，載體系統(tǒng)的單一降解特性可簡化細(xì)胞或組織的產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的還在于提供一可支撐細(xì)胞粘附力和生長的細(xì)胞培養(yǎng)生長表面、提供一在攪拌培養(yǎng)環(huán)境中可承擔(dān)機(jī)械壓力且可維持載體完整性的結(jié)構(gòu)，以及提供一可程控降解且可于培養(yǎng)完成后簡化組織或細(xì)胞產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)生長表面。
為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞生長表面的制法，其為一種用以促進(jìn)細(xì)胞粘附、分布和生長并通過可程控降解作用(programmabledegradation)釋放細(xì)胞或組織的細(xì)胞生長表面的制造方法，該方法包含提供三維陰離子多糖親水凝膠(three-dimensional anionic polysaccharidehydrogel)以作為該細(xì)胞生長表面；補(bǔ)充濃度超過2.3mM的過量二價(jià)-陽離子(di-cation)于該三維陰離子多糖親水凝膠內(nèi)和/或含浸此三維陰離子多糖親水凝膠的培養(yǎng)基中(surrounding culture media)，二者至少擇一。
上述細(xì)胞生長表面的制造方法，其中提供該三維陰離子多糖親水凝膠的步驟還可包含交聯(lián)一陰離子多糖聚合物(anionic polysaccharide polymer)以形成該三維陰離子多糖親水凝膠；或者優(yōu)選還包含交聯(lián)一藻素酸(alginicacid)或藻素酸混合物或其衍生物以形成該三維陰離子多糖親水凝膠；更優(yōu)選包含于該三維陰離子多糖親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙(pores)的步驟。
上述制造方法中形成所述孔隙的步驟還可包含冷凍和凍干(lyophilzing)該三維陰離子多糖親水凝膠。
本發(fā)明提供一種由陰離子多糖類材質(zhì)(特別是藻素酸或其衍生物)所形成的三維多孔隙生長表面，三維多孔隙生長表面可改善粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)效果，增強(qiáng)細(xì)胞生長表面，提升細(xì)胞固定性和繁殖性，維持表面結(jié)構(gòu)的完整性，激活可程控降解，以及增加細(xì)胞生產(chǎn)量。
本發(fā)明還提出一利用堅(jiān)硬和多孔隙固體層保護(hù)生長表面以增強(qiáng)生長表面完整性的方法，其為一種用以促進(jìn)細(xì)胞粘附、分布與生長并通過可程控降解作用(programmable degradation)釋放細(xì)胞或組織的細(xì)胞生長表面的制造方法，該方法包含提供一堅(jiān)硬支撐物(rigid support)；于堅(jiān)硬支撐物上凝固(solidifying)一陰離子多糖聚合物(anionic polysaccharide polymer)以形成一三維親水凝膠(three-dimensional hydrogel)；補(bǔ)充濃度超過2.3mM的過量二價(jià)-陽離子(di-cation)于該三維親水凝膠內(nèi)和含浸該三維陰離子多糖親水凝膠的培養(yǎng)基中(surrounding culture media)，二者至少擇一。
上述制造方法中采用的堅(jiān)硬支撐物為多孔隙或非多孔隙，優(yōu)選多孔隙并具有一網(wǎng)(netting)結(jié)構(gòu)或一篩網(wǎng)(mesh)結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)結(jié)構(gòu)與該篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)的材質(zhì)為聚合物，優(yōu)選為聚丙烯(polypropylene)或尼龍(nylon)。該堅(jiān)硬支撐物為[形、U形、V形、W形、橢圓形、O形、碗形(或稱錐臺(tái)形)或鏟狀物形以限制于該堅(jiān)硬支撐物內(nèi)的該細(xì)胞生長表面。該堅(jiān)硬支撐物優(yōu)選為多孔隙且具有至少兩側(cè)，該兩側(cè)用以遮蓋該細(xì)胞生長表面，并加以保護(hù)，避免其于細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分解作用(decomposition)，并提供機(jī)械強(qiáng)度使其互相堆疊；該堅(jiān)硬支撐物優(yōu)選還可為多孔隙且具有環(huán)繞部(circling-portion)，該環(huán)繞部用以環(huán)繞該細(xì)胞生長表面加以保護(hù)，避免其于細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分解作用(decomposition)，并提供機(jī)械強(qiáng)度使其互相堆疊；該堅(jiān)硬支撐物還可為非孔隙狀且由堅(jiān)硬生物可適應(yīng)的材質(zhì)所制成，優(yōu)選為非孔隙狀且具有一平板或片狀的形狀。
本發(fā)明細(xì)胞生長表面的制造方法，其中所述的多糖聚合物為藻素酸(alginic acid)或其衍生物；所述的凝固步驟還包含冷凍或以陽離子交聯(lián)該陰離子多糖聚合物。
本發(fā)明還提供一種適當(dāng)環(huán)境的方法，其利用在細(xì)胞生長表面的周圍或在培養(yǎng)載體內(nèi)部或在適當(dāng)環(huán)境內(nèi)加入二價(jià)-陽離子，所采用的二價(jià)-陽離子選自鈣(calcium)離子(例如濃度高于2.3mM的鈣離子)、鎂(magnesium)離子和鋇(barium)離子中任一或至少一個(gè)；優(yōu)選該二價(jià)-陽離子為鈣(calcium)離子，該鈣離子的濃度約為2.3mM至300mM，優(yōu)選為3mM至60mM，更優(yōu)選為3mM至10mM。另外其修正步驟還包含利用設(shè)計(jì)的多孔隙和三維結(jié)構(gòu)增加表面區(qū)域，利用在生長表面的周圍或培養(yǎng)載體內(nèi)部或生長表面內(nèi)部增加鈣離子濃度的步驟處理生長表面。該生長表面能夠使用可程控降解及當(dāng)培養(yǎng)完成后可輕易釋放細(xì)胞/組織的質(zhì)量。
本發(fā)明還包含一通過涂布多價(jià)陽離子修飾該細(xì)胞生長表面的步驟，其中該多價(jià)陽離子選自聚-L-離氨酸(poly-L-lysine)、聚-D-離氨酸(poly-D-lysine)、蛋白氨酸(polyarginine)、聚乙亞胺(polyethyleneimine)、聚-D-鳥胺酸(poly-D-ornithine)和聚-L-鳥氨酸(ploy-L-ornithine)中至少一種。
上述制造方法，其中還包含冷凍和凍干(lyophilzing)該三維親水凝膠以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙；或者，還包含使用鹽析(saltleaching)以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙；或者，還包含冷凍與干燥該該三維親水凝膠以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙。
其中所述的堅(jiān)硬支撐物優(yōu)選具有至少一褶層(fold)或至少一變形(deformation)以產(chǎn)生至少一三維孔穴(three-dimensional cavity)；所述的細(xì)胞生長面為用以生長真核細(xì)胞(eukaryotic cell)，優(yōu)選為用以生長依賴固著生長的細(xì)胞(anchorage-dependent cell)。
本發(fā)明的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中還包含培養(yǎng)和回收(harvesting)細(xì)胞，其中該培養(yǎng)和收獲細(xì)胞的步驟包含任意分布該細(xì)胞生長表面于一培養(yǎng)腔(culture chamber)內(nèi)；培養(yǎng)多數(shù)個(gè)細(xì)胞于該細(xì)胞生長表面上；于該些細(xì)胞培養(yǎng)完成后通過添加一螯合劑(chelating agent)分離該細(xì)胞生長表面；以及通過一分離裝置以獲得釋放后的上述細(xì)胞。
上述的細(xì)胞生長表面的制造方法還包含添加酵素分離所述細(xì)胞成為單一細(xì)胞顆粒，其中該酵素選自膠原酵素(collagenase)與胰蛋白酶(trypsin)中至少一種，其中該螯合劑選自檸檬酸鈉(sodium citrate)與檸檬酸(citricacid)中至少一種，其中該分離裝置為離心機(jī)(centriifge)。


圖1根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維的V形結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠為隔絕設(shè)置于V形支撐層的內(nèi)部以及在表面上結(jié)網(wǎng)；圖2根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維U形結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠隔絕設(shè)置于U形支撐層的內(nèi)部；圖3根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維W形結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠隔絕設(shè)置于W形支撐層的內(nèi)部；圖4根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例的載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維的O形結(jié)構(gòu)，或一圓柱狀結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠隔絕設(shè)置于O形支撐層的內(nèi)部；圖5根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例的載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維的橢圓形結(jié)構(gòu)，或一圓柱狀結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠隔絕設(shè)置于橢圓形支撐層的內(nèi)部；圖6根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的碗狀的生長表面示意圖；圖7細(xì)胞培養(yǎng)前的多孔隙生長表面結(jié)構(gòu)圖；圖8細(xì)胞于生長表面中的細(xì)胞生長形態(tài)；圖9細(xì)胞于2％的褐藻膠生長表面的培育圖，其中褐藻膠生長表面并無經(jīng)過任何表面處理及鈣離子強(qiáng)化動(dòng)作；圖10生長表面降解之后細(xì)胞/組織釋放圖；圖11根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的制造細(xì)胞生長表面方法流程圖。
附圖標(biāo)號(hào)10——提供三維陰離子多糖親水凝膠20——于三維陰離子多糖親水凝膠和/或環(huán)境培養(yǎng)基中補(bǔ)充二價(jià)-陽離子具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。
于本實(shí)驗(yàn)室中，令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)通過在環(huán)繞于褐藻酸鹽親水凝膠表面之培養(yǎng)媒介中添加額外的鈣離子，許多原先通常無法附著、伸展與成長于褐藻酸鹽表面的貼附依賴性的細(xì)胞(anchorage-dependent cell)，于本發(fā)明中都可伸展與生長于表面上且具有和現(xiàn)有組織培養(yǎng)皿可比較的生長速率與密度，且無需進(jìn)一步涂布任何額外細(xì)胞基質(zhì)(extra-cellular matrix)成分，如膠原或纖維粘連蛋白(fibronectin)于褐藻酸鹽表面以改善細(xì)胞附著、伸展與成長過程。在該設(shè)計(jì)理念中，通過供應(yīng)離子螯合劑，如二乙胺四乙酸EDTA或檸檬酸鈉(sodium citrate)可程控地降解褐藻酸鹽生長面。另一發(fā)現(xiàn)是將褐藻酸鹽親水凝膠制作成三維生長基質(zhì)時(shí)，在一攪動(dòng)的培養(yǎng)環(huán)境中很容易受到破壞，為了解決該問題，申請人發(fā)現(xiàn)通過在一網(wǎng)中保護(hù)多孔隙褐藻酸鹽基質(zhì)，此多孔隙生長基質(zhì)可于細(xì)胞培養(yǎng)期間長時(shí)間保持其完整性。兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)使申請人可構(gòu)建一生長基質(zhì)并允許應(yīng)用于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中，且能夠在無須酵素性的處理(enzymatic treatment)下收獲細(xì)胞/組織。并且，此添加額外鈣離子的發(fā)現(xiàn)同樣可以應(yīng)用于無孔隙或多孔隙褐藻酸鹽親水凝膠基質(zhì)且無網(wǎng)狀物保護(hù)時(shí)的狀態(tài)。這表示此發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于以任何方式保護(hù)或配置的褐藻酸鹽親水凝膠基質(zhì)于貼附依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用。
褐藻酸鹽，為藻素酸(alginic acid)，其為含beta(1-4)-linked D-mannuronicacid(M)與alpha-(1-4)-linked L-guluronic acid(G)的線形非支鏈高分子(linearunbranched polymers)。褐藻酸鹽可以被冷固化(cold setting)存在于鈣離子或其它多價(jià)金屬離子中，如二價(jià)鎂(Mg++)、二價(jià)鍶(Sr++)與二價(jià)鋇(Ba++)。通過添加螯合劑，如檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸(EDTA)也可輕易地降解褐藻酸鹽親水凝膠。因此，此材質(zhì)是用來控制釋放的理想材質(zhì)，如藥物釋放控制。通過一般冷凍/凍干程序，褐藻酸鹽親水凝膠可被制作成多孔隙結(jié)構(gòu)。如此多的優(yōu)點(diǎn)來自于藻素酸材料，故此材料多被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥或其它產(chǎn)業(yè)上。然而，由于其為細(xì)胞貼附抵抗(cell adhesion resistant，CAR)的特性，故貼附依賴性的細(xì)胞(anchorage-dependent cell)難以附著(anchor)和生長在褐藻酸鹽表面。因此，即使褐藻酸鹽應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域已數(shù)十年之久，但僅限定于極少數(shù)種類細(xì)胞，且大部分為依賴固著生長的細(xì)胞，如融合瘤細(xì)胞(hybridoma)。然而，如果褐藻酸鹽生長表面更進(jìn)一步被處理成一多孔隙結(jié)構(gòu)，其于含鈉或鉀離子溶液中會(huì)變成非常脆弱且于攪拌培養(yǎng)環(huán)境中被破壞。如表1所示，當(dāng)放置多孔隙褐藻酸鹽結(jié)構(gòu)于一攪拌培養(yǎng)表面時(shí)，僅有本發(fā)明具有三維折疊網(wǎng)(3-D folded netting)保護(hù)的褐藻酸鹽可維持其完整性至少10天，無保護(hù)或僅一側(cè)保護(hù)的褐藻酸鹽在24小時(shí)內(nèi)結(jié)構(gòu)被破壞怠盡。因此，于一動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下無任何額外保護(hù)下使用多孔隙褐藻酸鹽生長表面作為載體用來大量培養(yǎng)是非常困難的。
表1多孔隙褐藻酸鹽結(jié)構(gòu)放置于攪動(dòng)培養(yǎng)表面(agitating culture surface)的完整性維持時(shí)間

本發(fā)明提供了由多糖材料制成的一三維多孔隙生長表面，特別是藻素酸與其衍生物或其混合物中至少一個(gè)，可改進(jìn)細(xì)胞生長表面，促進(jìn)細(xì)胞固化(cell immobilization)，維持表面結(jié)構(gòu)完整性(surface structure integrity)，可程控降解作用(programmable degradation)以及增加細(xì)胞產(chǎn)量。本發(fā)明提供的方法通過在堅(jiān)硬多孔固態(tài)層內(nèi)保護(hù)生長表面可改善生長表面的完整性。本發(fā)明還提供修飾真核細(xì)胞(eukaryotic)或原核生物(prokaryotic)的生長表面的方法，包括通過產(chǎn)生多孔與三維結(jié)構(gòu)增加表面積，對表面進(jìn)行處理以增進(jìn)細(xì)胞附著，促進(jìn)細(xì)胞的生長與增生(proliferation)并處理在傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)裝置內(nèi)的生長表面。該生長表面在細(xì)胞培養(yǎng)完成后通過添加螯合劑(chelatingagent)，如檸檬酸鈉(sodium citrate)或二乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，可以程控降解予釋放細(xì)胞/組織團(tuán)塊(cell/tissue mass)。此細(xì)胞/組織團(tuán)塊通過添加胰蛋白酶(trypsin)、蛋白酵素(protease)與脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNAse)中至少一種后，也可被進(jìn)一步分解以獲得獨(dú)立細(xì)胞。
以下通過具體實(shí)施例配合附圖詳加說明，可更容易了解本發(fā)明的目的、技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)及所達(dá)成的功效，并據(jù)以實(shí)施，但不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。依據(jù)本發(fā)明所揭示的實(shí)施例可應(yīng)用于真核細(xì)胞與原核生物的至少一種的細(xì)胞培養(yǎng)，特別是動(dòng)物與哺乳類動(dòng)物的任意一種。本發(fā)明尤其提供適用于培養(yǎng)任何細(xì)胞的新型的生長表面和結(jié)構(gòu)，可承受機(jī)械強(qiáng)度，控制降解并于生長表面降解后容易收獲細(xì)胞/組織團(tuán)塊。
根據(jù)本發(fā)明提供的具有新穎性的生長表面由一堅(jiān)硬支撐物加上一生物可分解(biodegradable)的、有彈性(flexible)、堅(jiān)固(sturdy)且能維持所給予結(jié)構(gòu)的材質(zhì)的組合所制成。
該具有新穎性的生長表面由下列步驟制成首先，構(gòu)建一固體支撐物以形成一三維形狀；然后，將固體支撐物浸入褐藻酸鹽溶液并將相當(dāng)數(shù)量褐藻酸鹽溶液限制于固體支撐物內(nèi)；之后，通過冷凍固化褐藻酸鹽溶液或于多價(jià)金屬離子，如鈣離子、鎂離子或鋇(barium)離子(特別是鈣離子)溶液內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)以形成一凝膠；接著繼續(xù)，于膠化程序之前或之后利用已知冷凍/凍干程序可于褐藻酸鹽凝膠內(nèi)形成孔洞；然后，于此多孔藻酸鹽凝膠內(nèi)或環(huán)繞于生長表面提供過量兩價(jià)陽離子并使生長表面干燥或是供應(yīng)過量兩價(jià)陽離子，尤其是鈣離子，并使培養(yǎng)過程中整體兩價(jià)陽離子于培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)濃度超過2.3mM。
該堅(jiān)硬支撐物可為由聚丙烯或尼龍制成的網(wǎng)狀或篩狀物。該堅(jiān)硬支撐物可被彎曲或回火以形成I形、[形、U形、V形、W形、()形(橢圓形)、O形、碗形(錐臺(tái)形)或鏟狀物形狀以于該堅(jiān)硬支撐物內(nèi)限制該細(xì)胞生長表面并保護(hù)多孔生長表面。請參閱圖1至6，為根據(jù)本發(fā)明不同載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中多孔隙載體防護(hù)物的外表層為三維的V形、U形、W形、O形(或柱狀)、橢圓形與碗形結(jié)構(gòu)，多孔隙褐藻膠隔絕設(shè)置于支撐層的內(nèi)部。在附圖中，102表示網(wǎng)狀物，而100則表示多孔隙生長表面。該堅(jiān)硬支撐物具有至少兩側(cè)用以遮蓋細(xì)胞生長表面，或是具有環(huán)繞部(circling-portion)以環(huán)繞細(xì)胞生長表面加以保護(hù)避免其于細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分解作用(decomposition)，并提供機(jī)械強(qiáng)度使其可以互相堆疊。
此堅(jiān)硬支撐物為多孔隙，如此細(xì)胞/組織于接種(inoculation)時(shí)能夠穿透進(jìn)入生長表面，于生長表面降解后穿出生長表面，并能夠幫助養(yǎng)分與氧氣傳送進(jìn)入生長表面。此堅(jiān)硬支撐物可為非多孔隙，如此可適用于相對靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境。堅(jiān)硬支撐物的孔洞直徑約為500μm至2mm。
褐澡酸鹽溶液的濃度范圍約為1％至5％。此多孔隙結(jié)構(gòu)的褐藻酸鹽親水凝膠可通過其它普通顆粒來提供形成多空隙結(jié)構(gòu)，如鹽析(salt leaching)、相分離(phase separation)或發(fā)泡冷凍干燥(aphron freeze-and-dry)。優(yōu)選為冷凍凍干與aphron冷凍干燥。于多孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)孔洞尺寸約為10μm至500μm，優(yōu)選約為50μm至500μm。根據(jù)本發(fā)明所述的孔隙可提供一最大表面區(qū)域供細(xì)胞附著、貼固與增生(proliferation)，故可提供最大細(xì)胞密度和最大細(xì)胞產(chǎn)量。
由于褐藻酸鹽表面對于細(xì)胞附著和生長的惰性，故稱為細(xì)胞貼附抵抗(cell adhesion resistant，CAR)材質(zhì)，可通過添加過量兩價(jià)陽離子增強(qiáng)此生長表面，如鈣離子，于培養(yǎng)前或培養(yǎng)進(jìn)行時(shí)，并可選擇性地涂布多價(jià)陽離子高分子，如聚-L-賴氨酸(poly-L-lysine)、聚-D-賴氨酸(poly-D-lysine)、聚精氨酸(蛋白氨酸polyarginine)、聚乙亞胺(polyethyleneimine)、聚-D-鳥氨酸(poly-D-omithine)或是聚-L-鳥氨酸(ploy-L-ornithine)。更特別的是，鈣離子被選用是因其經(jīng)濟(jì)性與生物兼容可行性。褐藻酸鹽生長表面更可選擇性的涂布胞外基質(zhì)(extra-cellular matrix)或粘著因子(attachment factors)，如。膠原(collagen)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、附著性分子(laminins)、(trhombospondin 1)、玻連蛋白(virtonectin)、彈性蛋白(elastin)、肌糖蛋白(tenascin)或其它細(xì)胞粘著分子。然而，涂布胞外基質(zhì)(extra-cellular matrix)或粘著因子在本發(fā)明中并非必要的。
只要依據(jù)本發(fā)明精神，本發(fā)明的新穎的生長表面可以是任何尺寸、形狀、外形、結(jié)構(gòu)或幾何型態(tài)。此生長表面可以是任何適當(dāng)外形，例如顆粒狀物(pellet)、條狀物(strip)或任何三維結(jié)構(gòu)。于一實(shí)施例中，生長表面的外形為條狀物。該生長表面也可為顆粒狀物，如尺寸多樣且直徑范圍約為1mm至250mm，然而直徑尺寸仍需取決于個(gè)別需要。優(yōu)選的，該生長表面為一顆粒狀物的外形，其于培養(yǎng)槽內(nèi)或培養(yǎng)燒瓶或生物反應(yīng)瓶內(nèi)為零散堆積的基質(zhì)。該多孔隙載體或生長表面或顆粒狀物可以形成一零散堆積床，于接種時(shí)允許細(xì)胞簡單有效率的分布，并獲得最大量細(xì)胞附著于多孔顆粒狀物或多孔生長表面或多孔隙載體上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可了解一生長表面的某些特性從其效能上可得到的效果。載體或是表面特性，如表面性質(zhì)、載體密度、尺寸、毒性(toxicity)與堅(jiān)硬度(rigidity)，可影響生長表面效能和細(xì)胞培養(yǎng)效能，特別是有關(guān)于細(xì)胞密度和細(xì)胞產(chǎn)物的整體產(chǎn)量。特別地，生長表面孔隙尺寸會(huì)影響細(xì)胞效能。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解已知任何生長表面孔洞尺寸都為恰當(dāng)，此孔洞尺寸優(yōu)選的范圍約為50μm至500μm。
然而，此表面應(yīng)用方法在增進(jìn)整體效能方面也相當(dāng)重要且關(guān)鍵，特別是，通過在表面存放的環(huán)境中保持過量鈣離子濃度，其可能的原因之一是培養(yǎng)基質(zhì)中鉀與鈉離子容易將鈣離子置換造成此褐藻酸鹽凝膠被分解，因而阻礙了(impede)細(xì)胞伸展與增生。即使大部分細(xì)胞培養(yǎng)基已含有約1.8mM(200mg/L)氯化鈣濃度，然而，并不帶來促進(jìn)細(xì)胞附著與伸展于褐藻酸鹽生長表面上的效益。只有增加培養(yǎng)媒介內(nèi)鈣離子濃度至約2.3mM，細(xì)胞才會(huì)有出現(xiàn)顯著附著與伸展于褐藻酸鹽生長表面的效果，當(dāng)鈣離子濃度增加時(shí)細(xì)胞附著與伸展于褐藻酸鹽生長表面的效果亦同時(shí)增加。于培養(yǎng)媒介中鈣(calcium)離子整體濃度范圍約為2.3mM至300mM，優(yōu)選范圍約為2.3mM至60mM，更優(yōu)選范圍約為2.3mM至10mM。本發(fā)明添加過量兩價(jià)陽離子，特別是鈣離子，于褐藻酸鹽生長表面上或其內(nèi)顯著增加依賴固著生長的細(xì)胞可應(yīng)用于生物降解材料。此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明確支持通過使用該新穎性生長表面與本發(fā)明所提供的實(shí)測狀況所產(chǎn)生的驚人成果。
實(shí)施例1制備多孔隙生長表面本實(shí)施例描述本發(fā)明多孔隙結(jié)構(gòu)的制法，改多孔隙結(jié)構(gòu)如同支架用以物理性地支撐活細(xì)胞的生長。材料與方法分別為一般店家購買1m/m×1m/m網(wǎng)目尺寸的聚丙烯網(wǎng)(PolyPropylene Netting)。自FMC BioPloymer(Philadelphia，PA 19103，USA)購買的藻素酸(alinic acid，or alginate)。氯化鈣則自Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)購買。聚丙烯網(wǎng)切割成10cm長與3cm寬，折疊并融接加熱以形成具有1cm寬度和3mm高度的3維()形(橢圓)狀圓柱。藻素酸(alginic acid)粉末溶解于去離子水中以形成重量/體積為2％的藻素酸溶液。將()形狀圓柱聚丙烯網(wǎng)放置于一槽，注入藻素酸溶液于放置()形狀圓柱聚丙烯網(wǎng)的槽內(nèi)并讓藻素酸溶液填滿網(wǎng)狀支撐物內(nèi)部，讓在網(wǎng)狀支撐物內(nèi)的具有2％的藻素酸溶液的網(wǎng)狀支撐物浸入濃度為300mM的氯化鈣溶液中，并使其進(jìn)行膠化30分鐘。之后將此網(wǎng)狀/膠狀物放置于攝氏負(fù)80度的冰箱內(nèi)2小時(shí)并于真空脫水冷凍干燥(dehydrated)。此時(shí)于膠體內(nèi)會(huì)形成一內(nèi)部連接的多孔狀結(jié)構(gòu)，此孔洞尺寸約為30～200μm。將網(wǎng)狀/多孔膠狀物切割成1em長的顆粒狀物(pellet)。此多孔隙結(jié)構(gòu)于光學(xué)顯微鏡下的觀察如圖7所示。
實(shí)驗(yàn)2表面修飾接著將改網(wǎng)狀/多孔膠狀的顆粒狀物以含有過量100mM CaCl2的去離子水沖洗并使這些顆粒狀物干燥。此控制組(對照組)的制備并無添加過量氯化鈣，而是僅通過去離子水沖刷清洗確保無多余的鈣離子殘存于褐藻酸鹽表面并使其干燥。然后將此生長結(jié)構(gòu)置于UV燈下超過一夜以消毒殺菌。
實(shí)驗(yàn)3細(xì)胞培養(yǎng)于M199/5％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero種細(xì)胞。將每一上述多孔褐藻膠載體顆粒放置于12孔盤中并于每一顆粒添加2ml培養(yǎng)基以及播種1×105個(gè)細(xì)胞。此時(shí)，含有過量氯化鈣的上述載體顆粒內(nèi)的鈣離子被培養(yǎng)基所稀釋，培養(yǎng)基溶液內(nèi)的鈣離子濃度大致是稀釋至10mM左右。之后，于培養(yǎng)第五天，通過95％乙醇連續(xù)干燥固定其中一個(gè)載體顆粒的細(xì)胞并以考馬斯亮藍(lán)G(Coomassie brilliant blue G.)染色觀察。細(xì)胞形態(tài)(Cell morphology)如圖8所示，顯示Vero細(xì)胞可于本發(fā)明生長表面增生且完全占據(jù)生長表面空間。相反的，如圖9所示的控制組并無過量鈣離子于褐藻酸鹽載體顆粒上或于培養(yǎng)媒介內(nèi)，細(xì)胞無法附著于生長表面且形成團(tuán)塊聚集并增生失敗。
實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞/組織釋放取一顆粒狀物浸入濃度為1.6％的檸檬酸鈉(sodium citrate)溶液內(nèi)，振動(dòng)數(shù)分鐘直到凝膠溶解，僅有細(xì)胞組織留下。如圖10所示，由于此生長表面為三維多孔隙結(jié)構(gòu)，細(xì)胞生長在孔隙內(nèi)部形成了片狀或三維組織結(jié)構(gòu)。之后，將此細(xì)胞組織離心且再懸浮此細(xì)胞組織于酵素溶液中以分離組織形成單一獨(dú)立的細(xì)胞顆粒。于本實(shí)施例中，可自一多孔隙褐藻酸鹽載體上收集到8.0×105個(gè)細(xì)胞，表示于細(xì)胞5天的培養(yǎng)過程中約有8倍的細(xì)胞增生。此吻合在Vero細(xì)胞增生速度(propagation)的合理范圍內(nèi)。相反的，如圖9所示的控制組并無過量鈣離子于褐藻酸鹽載體顆上或于培養(yǎng)媒介內(nèi)，細(xì)胞無法附著于生長表面且形成聚集團(tuán)塊，增生速率低且于相同培養(yǎng)期間內(nèi)僅有1.7倍的增加。此顯示本發(fā)明所提供的生長表面與結(jié)構(gòu)可提供細(xì)胞附著、細(xì)胞增生且于此生物可降解多孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)大量回收細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)5測試其它貼附依賴性生長的細(xì)胞株本發(fā)明于細(xì)胞生長表面的培養(yǎng)效能更進(jìn)一步地由不同的貼附依賴固著生長的細(xì)胞株(anchorage-dependent cellline)來加以評量，包括Vero、MDCK、MDBK、BHK-2l、CHO-k1、HEK-293、RK-13與3T3。經(jīng)過五天的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2所示表2不同生長依賴固著生長細(xì)胞株的培養(yǎng)效能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

除了CHO不是絕對的貼附依賴性生長細(xì)胞株外，其它細(xì)胞株在兩種不同基質(zhì)中的生長皆顯示出顯著的不同。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出本發(fā)明的確證實(shí)了現(xiàn)有常識(shí)將褐藻酸當(dāng)作細(xì)胞附著抵抗物質(zhì)(Cell Adhesive Resistant，CAR)是不適當(dāng)?shù)?。此外，對褐藻酸鹽生長表面以過量兩價(jià)陽離子適當(dāng)處理后，幾乎可進(jìn)行各式各樣的生長依賴固著生長細(xì)胞株的培養(yǎng)。
圖11為根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的制造細(xì)胞生長表面方法流程圖。首先，提供一三維親水凝膠(步驟10)。于一實(shí)施例中，此三維親水凝膠的制備時(shí)通過交聯(lián)一多糖高分子于一堅(jiān)硬支撐物上。可選擇性地，通過折疊一固體支撐物以形成一三維結(jié)構(gòu)，之后將此固體支撐物浸入褐藻酸鹽溶液或含有褐藻酸鹽的混合物(alginate)使其可很容易被限制在該固體支撐物內(nèi)。接著，此褐藻酸鹽溶液于兩價(jià)陽離子溶液中被固化(solidified)以形成一親水凝膠，該兩價(jià)陽離子為鈣離子?？蛇x擇性地，通過冷凍并凍干(lyophilization)該親水凝膠以于其內(nèi)部形成多數(shù)個(gè)孔洞。另外，亦可通過涂布非共價(jià)的陽離子聚合物(non-covalent polycation)以修飾親水凝膠的細(xì)胞表面。于另一實(shí)施例中，可通過冷凍與干燥(dry)來形成孔洞。
于另一實(shí)施例中，利用水分散性(water-dispersible)及水溶性(water-soluble)的褐藻膠(褐藻酸鈉sodium alginate(水溶性)和褐藻酸鈣calcium alginate(水分散性))來制備三維親水凝膠，冷凍干燥此液態(tài)褐藻膠懸浮液以形成一褐藻海綿(resulting algin sponge)。于又一實(shí)施例中，通過在褐藻酸鹽溶液(alginate solution)內(nèi)發(fā)泡來制備三維親水凝膠，冷凍干燥此發(fā)泡的液態(tài)褐藻溶液或懸浮液以形成一似泡沫狀(foam-like)結(jié)構(gòu)的三維親水凝膠泡棉。于另外實(shí)施例中，此三維親水凝膠可通過混合水溶性褐藻酸鹽液態(tài)溶液和水溶性螯合劑劑(water soluble sequestering agent)的組成，于混合液中添加塑化劑(plasticizer)和表面活性劑，添加多價(jià)金屬離子(multi-valent metal ion)以形成不可水溶的褐藻酸鹽水膠(water-insolublealginate hydrogels)，冷凍此褐藻酸鹽水膠與凍干此冷凍褐藻酸鹽水膠?？蛇x擇性地，此三維親水凝膠的制備可通過提供可溶于水的多糖溶液，冷凍此溶液以形成冷凍固體，以含有雙價(jià)陽離子溶液交聯(lián)該冷凍固體且通過溶劑干燥該已經(jīng)交聯(lián)的多糖材料?？蛇x擇地，該三維親水凝膠的制備可通過多糖溶液，將多糖溶液膠化，冷凍該凝膠并干燥該冷凍凝膠以獲得多糖海綿狀物。于另一實(shí)施例中，此三維親水凝膠的制備可通過以氣體乳化的水溶性褐藻酸鹽溶液(gas emulsion)，冷凍并凍干該乳化褐藻酸鹽溶液，以含雙價(jià)陽離子溶液交聯(lián)該乳化褐藻酸鹽物質(zhì)，并再次凍干該物質(zhì)。因此，三維親水多孔凝膠的制備有多種方法，本發(fā)明三維親水凝膠的制備并不僅限于上述制法。
其次，在培養(yǎng)過程中供應(yīng)濃度超過2.3mM的過量兩價(jià)陽離子(步驟20)。在一實(shí)施例中，在三維親水凝膠或培養(yǎng)基中補(bǔ)充二價(jià)-陽離子?？蛇x擇地，在三維親水凝膠與培養(yǎng)基中補(bǔ)充二價(jià)-陽離子(di-cation)。
以上所述的實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想和特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，但不能以此限定本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，大凡依本發(fā)明所提供的精神所作的均等變化或修飾，仍應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用以促進(jìn)細(xì)胞粘附、分布和生長并通過可程控降解作用釋放細(xì)胞或組織的細(xì)胞生長表面的制造方法，該方法包含提供三維陰離子多糖親水凝膠以作為該細(xì)胞生長表面；以及補(bǔ)充濃度超過2.3mM的過量二價(jià)-陽離子于該三維陰離子多糖親水凝膠內(nèi)和/或含浸此三維陰離子多糖親水凝膠的培養(yǎng)基中，二者至少擇一。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中提供該三維陰離子多糖親水凝膠的步驟還包含交聯(lián)一陰離子多糖聚合物以形成該三維陰離子多糖親水凝膠。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中提供該三維陰離子多糖親水凝膠的步驟還包含交聯(lián)一藻素酸或其混合物或其衍生物以形成該三維陰離子多糖親水凝膠。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中提供該三維陰離子多糖親水凝膠的步驟還包含于該三維陰離子多糖親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中形成所述孔隙的步驟還包含冷凍和凍干該三維陰離子多糖親水凝膠。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該二價(jià)-陽離子選自鈣離子、鎂離子和鋇離子中至少一個(gè)。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該二價(jià)-陽離子為鈣離子。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為2.3mM至300mM。
9.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為3mM至60mM。
10.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為3mM至10mM。
11.一種用以促進(jìn)細(xì)胞粘附、分布與生長并通過可程控降解作用釋放細(xì)胞或組織的細(xì)胞生長表面的制造方法，該方法包含提供一堅(jiān)硬支撐物；于堅(jiān)硬支撐物上凝固陰離子多糖聚合物以形成三維親水凝膠；補(bǔ)充濃度超過2.3mM的過量二價(jià)-陽離子于該三維親水凝膠內(nèi)和含浸該三維陰離子多糖親水凝膠的培養(yǎng)基中，二者至少擇一。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該二價(jià)-陽離子補(bǔ)充于該三維親水凝膠和含浸該三維親水凝膠的培養(yǎng)基內(nèi)。
13.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為多孔隙或非多孔隙。
14.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為多孔隙并具有一網(wǎng)結(jié)構(gòu)或一篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)。
15.如權(quán)利要求14所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該網(wǎng)結(jié)構(gòu)與該篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)的材質(zhì)為高分子聚合物。
16.如權(quán)利要求14所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該聚合物為聚丙烯或尼龍。
17.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物系為[形、U形、V形、W形、()形、O形、碗形或鏟狀物形以限制在該堅(jiān)硬支撐物內(nèi)的細(xì)胞生長表面。
18.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為多孔隙且具有至少兩側(cè)，該兩側(cè)用以遮蓋該細(xì)胞生長表面，并加以保護(hù)，避免其于細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分解作用，并提供機(jī)械強(qiáng)度使其互相堆疊。
19.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為多孔隙且具有環(huán)繞部，該環(huán)繞部用以環(huán)繞該細(xì)胞生長表面加以保護(hù)，避免其于細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分解作用，并提供機(jī)械強(qiáng)度使其互相堆疊。
20.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為非孔隙狀且由堅(jiān)硬生物可適應(yīng)的材質(zhì)所制成。
21.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物為非孔隙狀且具有平板或片狀的形狀。
22.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該多糖聚合物為藻素酸、藻素酸混合物或其衍生物。
23.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該二價(jià)-陽離子為鈣離子。
24.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為2.3mM至300mM。
25.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為2.3mM至60mM。
26.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該鈣離子的濃度為3mM至10mM。
27.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，還包含通過涂布多價(jià)陽離子修飾該細(xì)胞生長表面的步驟。
28.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該多價(jià)陽離子選自聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚精氨酸、聚乙亞胺、聚-D-鳥氨酸和聚-L-鳥氨酸中至少一種。
29.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中還包含冷凍和凍干該三維親水凝膠以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙。
30.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，還包含使用鹽析以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙。
31.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，還包含冷凍與干燥該三維親水凝膠以于該三維親水凝膠內(nèi)形成多數(shù)個(gè)孔隙。
32.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該堅(jiān)硬支撐物具有至少一褶層或至少一變形以產(chǎn)生至少一三維孔穴。
33.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該細(xì)胞生長面為用以生長真核細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該細(xì)胞生長面為用以生長依賴固著生長的細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，還包含培養(yǎng)和回收細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求35所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該培養(yǎng)和收獲細(xì)胞的步驟包含任意分布該細(xì)胞生長表面于一培養(yǎng)腔內(nèi)；培養(yǎng)多數(shù)個(gè)細(xì)胞于該細(xì)胞生長表面上；于該些細(xì)胞培養(yǎng)完成后通過添加螯合劑分離該細(xì)胞生長表面；以及通過一分離裝置以獲得釋放后的上述細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求36所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，還包含添加酵素分離所述細(xì)胞組織成為單一細(xì)胞顆粒。
38.如權(quán)利要求37所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該酵素選自膠原蛋白酵素與胰蛋白酶或其混合物。
39.如權(quán)利要求36所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該螯合劑選自檸檬酸鈉和檸檬酸或其混合物。
40.如權(quán)利要求36所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該分離裝置為離心機(jī)。
41.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞生長表面的制造方法，其中該凝固步驟還包含冷凍或以陽離子交聯(lián)該陰離子多糖聚合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)胞生長表面的制法，包含由多糖類材質(zhì)如藻素酸形成三維多孔隙生長表面，該三維多孔隙生長表面具提高提供細(xì)胞增生的表面積、增強(qiáng)細(xì)胞貼附能力、被固定度和增殖速度、維持表面結(jié)構(gòu)完整性、激活可程控降解多孔隙生長表面等特性，通過三維多孔隙生長表面，細(xì)胞產(chǎn)量隨之增加；還提供了多種細(xì)胞生長表面的制法，包含用堅(jiān)硬支撐物保護(hù)生長表面完整性、用來增強(qiáng)細(xì)胞生長表面效能以及表面改質(zhì)以提供真核或原核細(xì)胞生長的方法，包含利用設(shè)多孔隙和三維結(jié)構(gòu)增加生長表面區(qū)域、處理生長表面促進(jìn)細(xì)胞貼附、增強(qiáng)細(xì)胞增生和擴(kuò)散、置生長表面于細(xì)胞培養(yǎng)組件，該生長表面具有可程控降解和培養(yǎng)結(jié)束后釋放細(xì)胞/組織的特性。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1884510SQ200610093120
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者劉子瑛, 王英凱, 謝幸英, 何升龍, 王昱麒, 張景明 申請人:賽宇細(xì)胞科技股份有限公司