專利名稱：石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對(duì)PCR引物(名稱為G-dloop)，尤其是涉及一種主要用于能特異地?cái)U(kuò)增大多數(shù)石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)(即控制區(qū))的擴(kuò)增引物。
背景技術(shù)：
由于動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快且不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，使其在種類鑒別和分類地位的研究方面應(yīng)用十分廣泛。線粒體基因組由37個(gè)編碼基因及一段主要的非編碼區(qū)(控制區(qū))組成，不同序列區(qū)域的進(jìn)化速率不同。其中進(jìn)化速率最快的是控制區(qū)，它適于親緣關(guān)系較近的群體間的比較研究。
當(dāng)前通過(guò)序列差異來(lái)鑒別外型上相似的魚類是一種十分便利準(zhǔn)確的方法，其中線粒體控制區(qū)序列差異的研究，如應(yīng)用于種類鑒別和分子系統(tǒng)進(jìn)化分析等，國(guó)內(nèi)外已有一些相關(guān)報(bào)道，主要有1)rnachez L，Danzamann R D.Congruence in control～region brook charr(Salvelinusfontinalis)[J].Mol Biol Evol，1993，101002～1014.
2)Zhu D，Jamieson B G M，Hugall A，et al.Sequence evolution and phylogenetic signal incontrol～region and cytochrome b sequences of rainbow fishes(Melantotaeniidae)[J].Mol BiolEvol，1994，11672～683.
3)Alex P，Kornfied I.Evolution of the mitochondrial DNA control region in the mbuna(Cichlidae)species flock of Lake Malawi，East Africa[J].J Mol Evol，1997，4570～83.
4)鄭冰蓉，等.鯉屬魚類mtDNA控制區(qū)D環(huán)區(qū)序列的變異性分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2002，26(4)289～294.
5)胡文革，等.新疆3種雅羅魚線粒體DNA控制區(qū)序列的差異和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(9)970～975.
6)張燕，等.中國(guó)鲿科魚類線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)發(fā)育分析.水生生物學(xué)報(bào)，2003，27(5)463～467.
石斑魚種間外部形態(tài)相似，為其種類鑒定帶來(lái)極大困擾。而其遺傳上也具有異常相近的親緣關(guān)系，因此只有選擇進(jìn)化速度最快的線粒體基因組高變異區(qū)(即控制區(qū)或稱D-LOOP環(huán))才能最有效進(jìn)行近緣種間甚至同種不同群體間的鑒別。然而石斑魚線粒體基因組高變異區(qū)兩端序列較為特化，使用已報(bào)道的其他物種線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物，如L15926(Kocher et al.，1989)、H16498(Meyer et al.，1990)、L16518(Meyer)等均無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一對(duì)可高效擴(kuò)增大多數(shù)石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)的擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)方法。
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個(gè)堿基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位于tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個(gè)堿基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一個(gè)為簡(jiǎn)并堿基，位于12SrRNA基因3’起始端。
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法其步驟為1)登陸Genebank搜索脊椎動(dòng)物線粒體DNA細(xì)胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區(qū)，經(jīng)同源比對(duì)，獲得一對(duì)擴(kuò)增引物為輕鏈28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3’；重鏈16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其擴(kuò)增范圍包括線粒體基因組中細(xì)胞色素b基因、控制區(qū)(即高變異區(qū))、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和間隔區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小在4.5～5.5kb之間。
2)采用步驟1)中所述的擴(kuò)增引物，通過(guò)長(zhǎng)PCR方法擴(kuò)增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之間，最后32種石斑魚類均擴(kuò)增獲得了單一的目的DNA片段，產(chǎn)物大小為4.5～5.5kb，對(duì)所得的32種石斑魚類的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
3)使用同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)，找出32種石斑魚類線粒體基因組細(xì)胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用簡(jiǎn)并性原則，設(shè)計(jì)出石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)。
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的應(yīng)用主要有種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源評(píng)估等方面。
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)對(duì)32種石斑魚(32種石斑魚是實(shí)驗(yàn)組歷時(shí)3年，于我國(guó)東南沿海海岸線采集所得32種石斑魚樣本，基本涵蓋了分布于我國(guó)近海的石斑魚類群)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得片段大小在1000～1200bp之間的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序及與Genbank上同源序列的比較，證實(shí)為包含線粒體基因組高變異區(qū)全序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。從而為我國(guó)石斑魚類的種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源的評(píng)估提供了一個(gè)有力的工具。使用引物G-dloop的PCR擴(kuò)增，最突出的優(yōu)點(diǎn)在于可以快速地對(duì)某些難于鑒別的近緣種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，此外，還可以在我國(guó)石斑魚類的地理種群鑒別和種質(zhì)資源及群體遺傳多樣性評(píng)估發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個(gè)堿基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位于tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個(gè)堿基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一個(gè)為簡(jiǎn)并堿基，位于12SrRNA基因3’起始端。
上述引物對(duì)32種石斑魚進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得片段大小在1000～1200bp之間的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序及與Genbank上同源序列的比較，證實(shí)為包含線粒體基因組高變異區(qū)全序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。從而為我國(guó)石斑魚類的種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源的評(píng)估提供了一個(gè)有力的工具，通過(guò)使用引物G-dloop的PCR擴(kuò)增，使得在分子水平上快速準(zhǔn)確高效地對(duì)我國(guó)石斑魚類的種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源評(píng)估成為現(xiàn)實(shí)。
本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物采用以下方法設(shè)計(jì)1)登陸Genebank，(網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov，全稱是National Center forBiotechnology Information，該網(wǎng)站收錄有當(dāng)今世界上所有已公開的基因序列)搜索脊椎動(dòng)物線粒體DNA細(xì)胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區(qū)，經(jīng)同源比對(duì)，獲得一對(duì)擴(kuò)增引物為輕鏈28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3’；重鏈16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其擴(kuò)增范圍包括線粒體基因組中細(xì)胞色素b基因、控制區(qū)(即高變異區(qū))、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和間隔區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小在4.5～5.5kb之間。
上述擴(kuò)增引物其主要用處在于擴(kuò)增出包括所需的目的(即高變異區(qū))序列及其前后基因序列，為高變異區(qū)引物的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。
2)采用步驟1)中所述的擴(kuò)增引物，通過(guò)長(zhǎng)PCR方法擴(kuò)增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之間，部分?jǐn)U增特異性較差的種類通過(guò)降落PCR法提高其特異性，最后32種石斑魚類均擴(kuò)增獲得了單一的目的DNA片段，產(chǎn)物大小為4.5～5.5kb，對(duì)所得的32種石斑魚類的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所涉及的32種石斑魚類為1寶石石斑魚、2布氏石斑魚、3雙棘石斑魚、4長(zhǎng)棘石斑魚、5赤點(diǎn)石斑魚、6玳瑁石斑魚、7電紋石斑魚、8鮭點(diǎn)石斑魚、9黑邊石斑魚、10六帶石斑魚、11吻斑石斑魚、12小點(diǎn)石斑魚、13斜帶石斑魚、14點(diǎn)帶石斑魚、15網(wǎng)紋石斑魚、16鑲點(diǎn)石斑魚、17云紋石斑魚、18縱帶石斑魚、19褐點(diǎn)石斑魚、20褐石斑、21青石斑、22駝背鱸、23寬額鱸、24側(cè)牙鱸、25波紋鰓棘鱸、26橫帶九棘鱸、27紅九棘鱸、28臺(tái)灣九棘鱸、29斑點(diǎn)九棘鱸、30豹紋鰓棘鱸、31橫斑鰓棘鱸、32鱖魚。
長(zhǎng)PCR方法即通過(guò)調(diào)整PCR反應(yīng)條件最終獲得較長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物。所述的調(diào)整反應(yīng)條件是指降低變性溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間(變性溫度從53℃可降到48℃，延伸時(shí)間可延長(zhǎng)至3.5min)及使用雙酶系統(tǒng)。所述的部分?jǐn)U增特異性較差即擴(kuò)增產(chǎn)物量少，并有其他非目的片段的PCR產(chǎn)物存在，表現(xiàn)為擴(kuò)增出非單一的條帶。所述的降落PCR法即在PCR反應(yīng)最初幾個(gè)循環(huán)退火溫度從一個(gè)較高溫度逐漸下降，可有效抑制非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
3)使用同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)，找出32種石斑魚類線粒體基因組細(xì)胞色素b的保守序列，并利用簡(jiǎn)并性原則，設(shè)計(jì)出石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)。
同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83可在生物軟件網(wǎng)http//www.bio-soft.net/下載。Clustal X 1.83是用來(lái)對(duì)核酸與蛋白序列進(jìn)行多序列同緣比對(duì)的軟件。由于高變異區(qū)序列正好位于細(xì)胞色素b基因和12S rRNA基因之間，因此用于設(shè)計(jì)引物的兩段保守序列分別位于高變異區(qū)的兩端，在細(xì)胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端。簡(jiǎn)并性原則是指一種氨基酸可由2種以上密碼子編碼，因此某個(gè)堿基(特別是第三密碼子位置)的替換并不影響編碼氨基酸，因此對(duì)引物中存在高變異的位點(diǎn)使用兩個(gè)以上的不同堿基，可克服部分模板由于發(fā)生堿基替換而導(dǎo)致引物的不匹配。
以下就本發(fā)明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明。其應(yīng)用主要有種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源評(píng)估等方面。
(1)種類鑒定方面的應(yīng)用①對(duì)32種石斑魚進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1000～1450bp，種間序列歧異度在6.1％～23.5％。
②對(duì)近緣種斜帶石斑魚與點(diǎn)帶石斑魚序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1000～1200bp，兩者之間的種間序列歧異度為8.3％。
③對(duì)近緣種云紋石斑魚與褐石斑魚序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1200bp左右，兩者之間的種間序列歧異度為6.1％。
(2)地理種群鑒別方面的應(yīng)用
對(duì)赤點(diǎn)石斑魚7個(gè)地理種群序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1350bp左右，不同地理種群間序列歧異度在2.3％～4.7％。
(3)種質(zhì)資源評(píng)估方面的應(yīng)用對(duì)斜帶石斑魚3個(gè)人工繁育群體序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1050～1070bp，3個(gè)種群之間的序列歧異度在1.4％～2.5％，單倍型多樣性為0.728，核苷酸多樣性為0.0105，群體間的分化系數(shù)為0.0766，說(shuō)明這三個(gè)群體的多樣性水平都較高，群體間存在明顯的基因交流。
以下給出石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的應(yīng)用實(shí)例。
(1)對(duì)32種石斑魚進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性5min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1000～1200bp，膠回收純化并測(cè)序，序列通過(guò)Genetyx軟件(可在http//www.sdc.co.jp下載)進(jìn)行同源比較，種間序列歧異度在6.1％～23.5％。
所述的Genetyx軟件即可進(jìn)行兩個(gè)序列間的同源比較并對(duì)序列進(jìn)行分析的軟件。
(2)對(duì)近緣種斜帶石斑魚與點(diǎn)帶石斑魚序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性5min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1000～1200bp，膠回收純化并測(cè)序，序列進(jìn)行同源比較，其種間序列歧異度為8.3％。
(3)對(duì)近緣種云紋石斑魚與褐石斑魚序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性5min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1200bp左右，膠回收純化并測(cè)序，序列進(jìn)行同源比較，其種間序列歧異度為6.1％。
(4)對(duì)赤點(diǎn)石斑魚7個(gè)地理種群序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性5min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1350bp左右，膠回收純化并測(cè)序，序列進(jìn)行同源比較，不同地理種群間序列歧異度在2.3％～4.7％。
(5)對(duì)斜帶石斑魚3個(gè)人工繁育群體序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性5min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在1050～1070bp，膠回收純化并測(cè)序，序列進(jìn)行同源比較，群體間序列歧異度在1.4％～2.5％。
以下給出本發(fā)明中所涉及的序列1.石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物(G-dloop)輕鏈引物G-dloop(L)有22個(gè)堿基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位于tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個(gè)堿基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一個(gè)為簡(jiǎn)并堿基，位于12SrRNA基因3’起始端。
2.長(zhǎng)PCR擴(kuò)增引物為輕鏈28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3’；重鏈16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其擴(kuò)增范圍包括線粒體基因組中細(xì)胞色素b基因、控制區(qū)(即高變異區(qū))、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和間隔區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小在4.5～5.5kb之間。
權(quán)利要求
1.石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物，其特征在于由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個(gè)堿基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位于tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個(gè)堿基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一個(gè)為簡(jiǎn)并堿基，位于12SrRNA基因3’起始端。
2.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于其步驟為1)登陸Genebank搜索脊椎動(dòng)物線粒體DNA細(xì)胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區(qū)，經(jīng)同源比對(duì)，獲得一對(duì)通用引物為輕鏈28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3’；重鏈16S-brh5’-CCG GTC TGAACT CAG ATC ACG T-3’，其擴(kuò)增范圍包括線粒體基因組中細(xì)胞色素b基因、控制區(qū)或高變異區(qū)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和間隔區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小為4.5～5.5kb；2)采用步驟1)中所述的通用引物，通過(guò)長(zhǎng)PCR方法擴(kuò)增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小為4.5～5.5kb，最后32種石斑魚類均擴(kuò)增獲得了單一的目的DNA片段，產(chǎn)物大小為4.5～5.5kb，對(duì)所得的32種石斑魚類的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；3)使用同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)，找出32種石斑魚類線粒體基因組細(xì)胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用簡(jiǎn)并性原則，設(shè)計(jì)出石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物。
3.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2)中，所述的長(zhǎng)PCR方法即通過(guò)調(diào)整PCR反應(yīng)條件最終獲得較長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2)中，所述的調(diào)整反應(yīng)條件是指降低變性溫度、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間及使用雙酶系統(tǒng)，所述的延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間是做梯度dT＝0.3℃，時(shí)間梯度dt＝10s。
5.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2)中，所述的部分?jǐn)U增特異性較差即擴(kuò)增產(chǎn)物量少，并有其他非目的片段的PCR產(chǎn)物存在，表現(xiàn)為擴(kuò)增出非單一的條帶。
6.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2)中，所述的降落PCR法即在PCR反應(yīng)最初幾個(gè)循環(huán)退火溫度從一個(gè)較高溫度逐漸下降，可有效抑制非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
7.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟3)中，所述的同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83在生物軟件網(wǎng)http//www.bio-soft.net/下載。
8.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟3)中，所述的保守序列的高變異區(qū)位置介于細(xì)胞色素b與12S rRNA之間。
9.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟3)中，所述的簡(jiǎn)并性原則是指一種氨基酸由至少2種密碼子編碼。
10.如權(quán)利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物在種類鑒定、地理種群鑒別和種質(zhì)資源評(píng)估方面的應(yīng)用。
全文摘要
石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)方法，涉及一對(duì)PCR引物(名稱為G－dloop)，提供一對(duì)可高效擴(kuò)增大多數(shù)石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)的擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)方法。擴(kuò)增引物由兩條單鏈寡聚核苷酸組成。登陸Genebank搜索脊椎動(dòng)物線粒體DNA細(xì)胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區(qū)，經(jīng)同源比對(duì)，獲得一對(duì)擴(kuò)增引物，通過(guò)長(zhǎng)PCR方法擴(kuò)增獲32種石斑魚類的目的片段并進(jìn)行測(cè)序。使用同源比對(duì)軟件Clustal X 1.83對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)，找出32種石斑魚類線粒體基因組細(xì)胞色素b5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用簡(jiǎn)并性原則，設(shè)計(jì)出石斑魚類線粒體基因組高變異區(qū)擴(kuò)增引物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1900318SQ20061009393
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者丁少雄, 杜佳瑩, 王軍, 蘇永全 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)