專利名稱：一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)用酶制劑的制備方法，特別涉及工業(yè)用漆酶的制備方法，確切地說(shuō)是一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物發(fā)生氧化，同時(shí)伴隨有氧還原成水。漆酶廣泛存在于植物、細(xì)菌、昆蟲(chóng)，特別是白腐真菌中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿、食品風(fēng)味的改良、飼料營(yíng)養(yǎng)的改善、紡織染料的降解與轉(zhuǎn)化、紡織纖維的柔化、新型藥物開(kāi)發(fā)、新型生物傳感器的研制及新型能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有重要(潛在)應(yīng)用價(jià)值[洪宇植等(2005)生物工程學(xué)報(bào)21547-552；Xiao YZ et al(2006)Appl Microbiol Biotechnol 71493-501]，近年來(lái)成為國(guó)際酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
目前，真菌漆酶的生產(chǎn)大多在人工合成培養(yǎng)基中進(jìn)行，需要芳香類化合物和(或)重金屬離子的誘導(dǎo)[Xiao YZ et al(2004)Mycologia 9626-35]。這些誘導(dǎo)物具有毒性，添加后使得發(fā)酵液后處理難度大、成本高，易造成環(huán)境污染。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直關(guān)注和致力于漆酶合成方法的探索，并取得了進(jìn)展(如固態(tài)發(fā)酵和異源表達(dá))。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)能夠緩解酶生產(chǎn)的污染問(wèn)題，然而其發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)(一般超過(guò)20天)；漆酶基因在多個(gè)不同宿主中異源表達(dá)的產(chǎn)量也普遍低于野生菌[Hong YZ et al(2006)FEMS Microbiol Lett 25896-101]，這些限制了漆酶的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
靈芝(Ganoderma)具有重要的藥用價(jià)值和保健功能，以往的研究主要圍繞這兩個(gè)功能展開(kāi)，而關(guān)于靈芝漆酶的應(yīng)用研究尚不多見(jiàn)。在國(guó)內(nèi)，張曉昱等將平菇(Pleurotus sp.)與靈芝(Ganoderma sp.)混合培養(yǎng)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，漆酶酶活達(dá)到2,165U/g(ABTS法)[黃慧艷等(2004)中國(guó)食用菌2331-33]；王歲樓等將Ganoderma lucidum Karst No.1進(jìn)行突變，突變株G301的最高漆酶產(chǎn)量為355U/L(愈創(chuàng)木酚法)[王歲樓等(2006)食品科學(xué)2753-57]。國(guó)際上也有關(guān)于靈芝漆酶的研究報(bào)道[Trevor M et al(1999)Appl Environ Microbiol 655307-5313]，較為突出的是，Ganoderma adspersum液體發(fā)酵14天的漆酶產(chǎn)量達(dá)到34,000U/L(ABTS法)[songulashvili G et al(2006)Biotechnol Lett 281425-1429]。在這些研究中，漆酶的產(chǎn)量較低，難以達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用的需求。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于已有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明旨在提供一種高效、環(huán)保、廉價(jià)地生產(chǎn)真菌漆酶的方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是選擇優(yōu)良的真菌菌株為材料在環(huán)保、廉價(jià)的培養(yǎng)基中高效地發(fā)酵生產(chǎn)靈芝漆酶。
所述的優(yōu)良菌株為真菌菌株樹(shù)舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)，由申請(qǐng)人自主選育。
所述的環(huán)保、廉價(jià)的培養(yǎng)基是用天然農(nóng)副產(chǎn)品配制得到的液體培養(yǎng)基。
本生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、發(fā)酵、酶分離和后處理，其特征在于將樹(shù)舌靈芝ST種液接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～8天，最后分離得到工業(yè)用漆酶制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基有以下組分和重量百分?jǐn)?shù)玉米粉0.1％～5％，糧食麩皮1％～7％，花生餅粉1％～7％，余量為自來(lái)水，培養(yǎng)基pH3～8。
優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％、余量為自來(lái)水，培養(yǎng)基pH3～8。
所述的糧食麩皮選自麥麩皮、大米皮糠等，可單獨(dú)使用，也可混合使用，優(yōu)選麥麩皮。
進(jìn)一步優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％，余量為自來(lái)水，培養(yǎng)基pH5～6。
所述的種液制備就是將樹(shù)舌靈芝ST接種在上述培養(yǎng)基中于22～35℃、100～200r/min培養(yǎng)3～6天，然后將種液按1～15％(體積分?jǐn)?shù))接種量接入同樣的培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)制備漆酶。
分離得到的漆酶制劑或凍干貯藏，或經(jīng)稀釋后直接應(yīng)用于食品、飲料、紡織印染、污水處理等工業(yè)領(lǐng)域。但若應(yīng)用于生物傳感器等高技術(shù)領(lǐng)域則需進(jìn)一步純化制備純漆酶制劑。
所述的純化在低溫下進(jìn)行，將粗酶制劑經(jīng)離心分離、超濾濃縮、透析和柱層析處理制備純漆酶制劑。
本發(fā)明在漆酶生產(chǎn)過(guò)程中使用的菌株為靈芝(具有保健功能)，所用的培養(yǎng)基成分為常見(jiàn)的農(nóng)副產(chǎn)品，其發(fā)酵廢渣可用作高蛋白類飼料。本發(fā)明發(fā)酵獲得的漆酶活力在9,000U/L以上(愈創(chuàng)木酚法)，目前該產(chǎn)量處于漆酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)法的國(guó)際領(lǐng)先水平。與其它研究相比，本發(fā)明生產(chǎn)漆酶具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單、廉價(jià)且來(lái)源廣泛；(2)酶合成無(wú)需毒性物質(zhì)誘導(dǎo)，發(fā)酵產(chǎn)物可循環(huán)利用，后加工處理簡(jiǎn)便，基本無(wú)環(huán)境污染；(3)酶產(chǎn)率高、發(fā)酵周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
申請(qǐng)人自主選育的樹(shù)舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)已于2006年09月18日送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM206100。
四.
具體實(shí)施例方式
1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備玉米、麩皮和花生餅用粉碎機(jī)粉磨成粉末，過(guò)60～200目篩后使用效果更佳。
(1)取玉米粉0.2份、糧食麩皮2份、花生餅粉2份，自來(lái)水95.8份，檸檬酸調(diào)pH4，121℃滅菌30～50min，備用。
(2)取玉米粉3份、糧食麩皮5份、花生餅粉5份，自來(lái)水87份，檸檬酸調(diào)pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(3)取玉米粉0.2份、麥麩皮5份、花生餅粉5份，自來(lái)水89.8份，檸檬酸調(diào)pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(4)取玉米粉3份、大米皮糠2份，花生餅粉2份，自來(lái)水93份，氨水調(diào)pH8，121℃滅菌30～50min，備用。
(5)取玉米粉0.3份、麥麩皮3份、大米皮糠1份，花生餅粉3份，自來(lái)水92.7份，氨水調(diào)pH8，121℃滅菌30～50min備用。
(6)取玉米粉2份、大米皮糠2份，麥麩皮1份，花生餅粉4份，自來(lái)水91份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
(7)取玉米粉0.7份、麥麩皮3份，花生餅粉3份，自來(lái)水93.3份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
2、樹(shù)舌靈芝ST種液的制備在土豆培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基20％土豆汁、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、0.4g維生素B，加1.5％瓊脂制成固體培養(yǎng)基)斜面上4℃保存的樹(shù)舌靈芝ST接種于已高溫滅菌的上述(1)～(7)的任一發(fā)酵培養(yǎng)基中，22～35℃、100～200r/min培養(yǎng)3～6天，即制成種液。
3、接種與發(fā)酵培養(yǎng)將制備的樹(shù)舌靈芝ST種液按1～15％體積分?jǐn)?shù)接種于已滅菌的上述(1)～(7)的任一發(fā)酵培養(yǎng)基中，100～200r/min、22～35℃培養(yǎng)3～8天至產(chǎn)酶高峰。以愈創(chuàng)木酚為底物測(cè)定漆酶活力的方法參照文獻(xiàn)[洪宇植等(2005)生物工程學(xué)報(bào)21547-552]。
4、酶分離與純化在漆酶活力達(dá)到高峰時(shí)，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾去除菌體和廢渣，濾液即是漆酶粗制劑。濾液或者冷凍干燥后貯藏備用，或者加水適當(dāng)稀釋后直接用于食品飲料業(yè)、紙漿漂白、工業(yè)染料脫色(特別是紡織染料)、紡織纖維軟化、飼料加工等領(lǐng)域。
粗酶制劑依次按下述步驟可獲得純酶，所有操作在4～10℃進(jìn)行①6,000g離心10min，上清液超濾濃縮10～50倍；②上清液在2mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)透析3～6小時(shí)，然后10,000g離心10min；③上清液上預(yù)先用透析液平衡的DEAE-SepharoseFF離子交換柱，并用0～0.3mol/L的硫酸銨進(jìn)行梯度洗脫，活性組分脫鹽后用滅菌水(或去離子水)稀釋，即可獲得純酶制劑(純酶制劑除了可用于上述粗酶的應(yīng)用領(lǐng)域外，還能用于生物傳感器等研究)。
5、發(fā)酵后處理由于菌株和培養(yǎng)基對(duì)人畜均安全，且過(guò)濾出的菌體和廢渣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，因此可用作飼料。
6、具體操作例(1)、玉米、麥麩和豆餅粉碎后過(guò)60目篩，按玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％的比例配比，余量為自來(lái)水(自然pH5～6)，配制后于121℃滅菌40min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
(2)、從樹(shù)舌靈芝ST的保藏斜面挑取兩塊約1cm2的菌絲塊，接種到裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，130r/min、28℃培養(yǎng)4天至漆酶活力達(dá)到700～1500U/L，制成種液。按8％的體積分?jǐn)?shù)將種液接種到350mL新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基(1L三角瓶)中，繼續(xù)培養(yǎng)5天，酶活在9,000U/L(愈創(chuàng)木酚法)以上。
(3)、發(fā)酵液用八層紗布過(guò)濾去除菌體和廢渣，濾液即是粗漆酶制劑。濾液經(jīng)超濾濃縮凍干以便貯存，或加水稀釋直接用于食品飲料業(yè)、紙漿漂白、染料脫色、污水處理、纖維軟化、飼料加工、酒精生產(chǎn)等。若需進(jìn)一步純化得到純漆酶制劑，按“4、酶分離與純化”中所述的純化步驟進(jìn)行處理。菌體和廢渣用作飼料。
權(quán)利要求
1.一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法，以樹(shù)舌靈芝ST為出發(fā)菌株，包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、發(fā)酵、酶分離和后處理，其特征在于將樹(shù)舌靈芝菌株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～6天制備種液，然后將該種液接種到同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃繼續(xù)培養(yǎng)3～8天，最后分離得到漆酶制劑；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基有以下組分和重量百分?jǐn)?shù)玉米粉0.1％～5％、糧食麩皮1％～7％、花生餅粉1％～7％，水余量，pH3～8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基各組分重量百分?jǐn)?shù)為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％，水余量，pH3～8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基各組分重量百分?jǐn)?shù)為玉米粉0.7、麥麩皮3％、花生餅粉3％，水余量，pH5～6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于玉米粉、糧食麩皮、花生餅粉細(xì)度過(guò)60～200目篩。
全文摘要
一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法，以申請(qǐng)人自主選育的樹(shù)舌靈芝ST為出發(fā)菌株，將其先接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中制備種液，再將種液接種到同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～8天，分離后得到漆酶制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基由0.1～5％的玉米粉，1～7％的糧食麩皮、1～7％的花生餅粉和余量水組成。本方法生產(chǎn)的漆酶活力在9000U/L以上(愈創(chuàng)木酚法)，該產(chǎn)量處于漆酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)法的國(guó)際領(lǐng)先水平。培養(yǎng)基為農(nóng)副產(chǎn)品，無(wú)毒、廉價(jià)、無(wú)污染。本方法工藝簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1935992SQ200610096638
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者洪宇植, 肖亞中, 李妍妍, 王林, 房偉 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)