專利名稱：經(jīng)培養(yǎng)的胰腺細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞，尤其涉及從糖尿病動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)胰腺組織分離得到的胰島細(xì)胞團(tuán)中培養(yǎng)和擴(kuò)增胰島干細(xì)胞，并將其進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
從1998年，James Thomson首次成功分離培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞以來(lái)，由于干細(xì)胞對(duì)將來(lái)疾病的治療有著重要的應(yīng)用前景，因此干細(xì)胞技術(shù)毋庸質(zhì)疑已成為當(dāng)今生物科技領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。而中國(guó)目前有3000多萬(wàn)糖尿病患者，而且正以每年75萬(wàn)新患者的速率遞增，糖尿病現(xiàn)已成為心腦血管病、腫瘤之后的“人類第3大殺手”嚴(yán)重危及人類健康。I型糖尿病(其也被稱作胰島素依賴型糖尿病)的患者必須每天依靠注射胰島素來(lái)維持。雖然最近在加拿大Edmonton，研究人員采用新的免疫抑制療法使胰島移植取得很好的療效，但該療法仍然沒有解決組織供體來(lái)源不足的問題。
干細(xì)胞是一類能夠自我復(fù)制、自我更新并具有分化為相應(yīng)組織細(xì)胞潛能的細(xì)胞，因此發(fā)現(xiàn)一種能夠在體外大量擴(kuò)增并能分化為胰島β細(xì)胞的干細(xì)胞，已成為目前的一個(gè)研究重點(diǎn)。
目前研究已證實(shí)，在體外可分化為胰島β細(xì)胞的干細(xì)胞主要有以下三類胚胎干細(xì)胞(ES)、胰腺腺管來(lái)源的干細(xì)胞和胰島來(lái)源的干細(xì)胞。有關(guān)研究細(xì)節(jié)在Shi，Y.，Hou，L.，Tang，F(xiàn).，Jiang，W.，Wang，P.，Ding，M.，& Deng，H.(2005).Inducing embryonic stem cells todifferentiate into pancreatic β-cells by a novel three-step approach withactivin A and all-trans retinoic acid.Stem Cells，2005，23，656-662.；Bonner-Weir，S.，Taneja，M.，Weir，G.C.，Tatarkiewicz，K.，Song，K.H.，Sharma，A.，& O’Neil，J.J.(2000).In vitro cultivation of humanislets from expanded ductal tissue.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United State of America，97，7999-8004.；Huang，H.X.，& Tang，X.M.(2003).Phenotypic determination andcharacterization of nestin-positive precursors derived from human fetalpancreas.Laboratory Investigation，83，539-547.；Wu，F(xiàn).，Jagir，M.，&Powell，J.S.(2004).Long-term correction of hyperglycemia in diabeticmice after implantation of cultured human cells derived from fetalpancreas.Pancreas，29，e23-e29.；Zulewski，H.，Abraham，E.J.，Gerlach，M.J.，Daniel，P.B.，Moritz，W.，Muller，B.，Vallejo，M.，Thomas，M.K.，& Habener，J.F.(2001).Multipotential nestin-positivestem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo intopancreatic endocrine，exocrine，and hepatic phenotypes.Diabetes，50，521-533.，等文章中已有詳盡描述。
胚胎干細(xì)胞是一種全能干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下它可分化為體內(nèi)任何組織的體細(xì)胞。Lumelsky等人報(bào)道，通過體外五步誘導(dǎo)的方法，可將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞，而Shi等在他們的研究中報(bào)道，他們通過三步法可將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成為胰島β細(xì)胞，并且這些細(xì)胞移植入糖尿病老鼠體內(nèi)后可使動(dòng)物的體重增加，存活時(shí)間延長(zhǎng)，血糖下降。但是，由于胚胎干細(xì)胞存在目前尚無(wú)法解決的致瘤性問題，因此目前離臨床運(yùn)用還有一定的距離。
對(duì)于胰腺腺管來(lái)源的干細(xì)胞，Bonner-Weir等在他們的研究報(bào)告中報(bào)道，在胰腺的腺管中存在一種CK19陽(yáng)性的干細(xì)胞，此種細(xì)胞在有KGF和Matrigel存在的情況下，可大量擴(kuò)增并分化為胰島β細(xì)胞。
對(duì)于胰島來(lái)源的干細(xì)胞，Zulewski等報(bào)道，他們從正常胰腺的胰島團(tuán)中分離培養(yǎng)出了一種表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志nestin蛋白(巢蛋白)的細(xì)胞，此種細(xì)胞可在體外大量擴(kuò)增，并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
巢蛋白是一高分子量中間絲蛋白，在分化細(xì)胞中巢蛋白表達(dá)于纖維母細(xì)胞，而未見表達(dá)于上皮細(xì)胞，但在未分化始祖上皮細(xì)胞中卻可見其表達(dá)，通過將表達(dá)有巢蛋白的胰腺導(dǎo)管未分化上皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島細(xì)胞的1個(gè)亞群，證明巢蛋白是胰腺干細(xì)胞的1種分子標(biāo)記物，它可能起著促進(jìn)胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞分化的作用。參見Peters K，Panienka R，Li J，Kloppel G，Wang R.Expression of stem cellmarkers and transcription factors during the remodeling of the ratpancreas after duct ligation.Virchows Arch 2005；44656-63。
Huang & Tang，2003；Zulewski et al.，2001文章中披露的胰腺干細(xì)胞為胰島來(lái)源的成體干細(xì)胞。Zulewski等所用的組織為正常的人或鼠的胰腺組織。由于在實(shí)踐中難以獲得足夠數(shù)量的正常的人胰腺組織，所以將該技術(shù)應(yīng)用于臨床時(shí)仍會(huì)面臨來(lái)源不足的問題。
因此，需要解決胰島移植中胰腺組織來(lái)源不足的問題，還需要解決異體移植中使用免疫抑制劑所帶來(lái)的毒性問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是用糖尿病動(dòng)物自身殘存的胰腺干細(xì)胞在體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增后，在誘導(dǎo)因子的作用下分化為有功能的成熟的胰島β細(xì)胞，然后再移植入該動(dòng)物或者其它動(dòng)物體內(nèi)。這種自體移植的方法，既解決了胰島移植中胰腺組織來(lái)源不足的問題，也解決了異體移植中使用免疫抑制劑所帶來(lái)的毒性問題。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的可分泌胰島素的成熟的胰島β細(xì)胞也可以進(jìn)行異體移植，該異體移植的方法可以解決胰島移植中胰腺組織來(lái)源不足的問題。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)糖尿病動(dòng)物胰腺組織中是否存在胰腺干細(xì)胞的方法，包括a)免疫組化檢測(cè)，包括胰腺組織固定，制作石蠟包埋切片，封閉后接觸一抗抗體，接觸二抗抗體，然后封片觀察，其中所述一抗抗體包括兔抗巢蛋白抗體；b)RT-PCR分析，包括提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，然后利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c)根據(jù)步驟a)和b)的結(jié)果確定糖尿病動(dòng)物胰腺組織中是否存在胰腺干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離殘存的胰島細(xì)胞團(tuán)的方法，包括以下步驟a)將胰腺組織剪碎成塊；b)對(duì)塊狀的胰腺組織進(jìn)行酶消化，然后終止消化；c)離心分離，去上清，清洗；d)得到分離后的胰島細(xì)胞團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法，包括以下步驟a)將從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離出的胰島細(xì)胞團(tuán)加入裝有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-5天；b)將懸浮的胰島細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；c)經(jīng)過6-20天，生長(zhǎng)出星形胰島干細(xì)胞；d)在所述星形胰島干細(xì)胞將匯合時(shí)進(jìn)行傳代，得到胰島干細(xì)胞。
所述培養(yǎng)基A包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、緩沖液、血清、氨基酸和抗生素等。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括RPMI 1640等；所述血清包括FBS等；所述緩沖液包括4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、丙酮酸鈉緩沖液等；所述氨基酸包括L-谷氨酸等；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素等。培養(yǎng)基A的一個(gè)實(shí)例為RPMI 1640、8-15％FBS、10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、1mM丙酮酸鈉緩沖液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug鏈霉素；另一實(shí)例為RPMI 1640，F(xiàn)BS，HEPES(100X)，丙酮酸鈉(100X)，L-glutamine(100X)，Antibiotic(100X)。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明披露的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域的常識(shí)和具體情況對(duì)培養(yǎng)基A的成分和數(shù)量做一些變動(dòng)或修改，例如，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為DMEM，血清可以為馬血清、新生牛血清，緩沖液可以為碳酸氫鈉緩沖液，所有這些變動(dòng)和修改都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所述培養(yǎng)基B包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、緩沖液、血清、氨基酸、抗生素和生長(zhǎng)因子。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括RPMI 1640等；所述血清包括FBS等；所述緩沖液包括4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、丙酮酸鈉緩沖液等；所述氨基酸包括L-谷氨酸等；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素等；所述生長(zhǎng)因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。培養(yǎng)基B的一個(gè)實(shí)例為RPMI 1640、8-15％FBS、10mM4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、1mM丙酮酸鈉緩沖液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug鏈霉素、10-20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10-20ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；另一實(shí)例為RPMI 1640，F(xiàn)BS，HEPES(100X)，丙酮酸鈉，L-glutamine(100X)，Antibiotic(100X)，Human bFGF，Human EGF。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明披露的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域的常識(shí)和具體情況對(duì)培養(yǎng)基B的成分和數(shù)量做一些變動(dòng)或修改，例如，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為DMEM，血清可以為馬血清、新生牛(胎牛)血清，緩沖液可以為碳酸氫鈉緩沖液，所有這些變動(dòng)和修改都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種誘導(dǎo)胰島干細(xì)胞(PPC)或者胰腺前體細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。聯(lián)合使用胰高血糖素樣生長(zhǎng)因子(GLP-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、betacellulin和煙酰胺等誘導(dǎo)分化因子，誘導(dǎo)PPC分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。一種將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)將胰島干細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)約2-5天；b)將培養(yǎng)基C更換為培養(yǎng)基D，但仍然在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)大約4-15天，得到可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
其中所述培養(yǎng)皿為細(xì)菌培養(yǎng)皿或涂有0.01％多聚鳥氨酸或多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)皿。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在第四方面的方法中，使用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿難以得到可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。當(dāng)使用細(xì)菌培養(yǎng)皿或涂有0.01％多聚鳥氨酸或多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)皿時(shí)可以獲得好的效果。
所述培養(yǎng)基C包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑、白蛋白、抗生素和生長(zhǎng)因子。其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM和NutrientMixture Ham’s F-12’；所述培養(yǎng)添加劑包括B27或者(胰島素+轉(zhuǎn)鐵蛋白+亞硒酸鈉)ITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素；所述生長(zhǎng)因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。所述培養(yǎng)基C的一個(gè)實(shí)例為48％DMEM、48％NutrientMixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/L ITS(即5mg/L胰島素+5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5ml/L亞硒酸鈉)、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug鏈霉素、10-20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10-20ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；另一實(shí)例為DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，bFGF 20ng/ml，EGF 20ng/ml，Antibiotics(100X，GIBCO)。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域的常識(shí)和具體情況對(duì)培養(yǎng)基C的成分和數(shù)量做一些變動(dòng)或修改，所有這些變動(dòng)和修改都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所述培養(yǎng)基D包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑、白蛋白、抗生素、有誘導(dǎo)功能的多肽和生長(zhǎng)因子。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培養(yǎng)添加劑包括B27或者ITS(即胰島素+轉(zhuǎn)鐵蛋白+亞硒酸鈉)；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素；所述多肽和生長(zhǎng)因子包括煙酰胺、GLP-1、HGF、Betacellulin。所述培養(yǎng)基D的一個(gè)實(shí)例為48％DMEM、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/L ITS(即5mg/L胰島素+5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5mg/L亞硒酸鈉)、0.05％-0.1％BSA、100u青霉素-100ug鏈霉素、10mM煙酰胺、10-100nM GLP-1、10ng/ml HGF、500pmol/L Betacellulin；另一實(shí)例為DMEM/F12 1∶1(5.6mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，10mM nicotinamide，Antibiotics(100X，GIBCO)，GLP-1(7-36amide)，HGF，Betacellulin。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域的常識(shí)和具體情況對(duì)培養(yǎng)基D的成分和數(shù)量做一些變動(dòng)或修改，所有這些變動(dòng)和修改都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種利用前述的從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離胰島細(xì)胞團(tuán)的方法得到的胰島細(xì)胞團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種利用前述的胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法得到的胰島干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了一種利用前述的將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法得到的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。


根據(jù)下文結(jié)合附圖進(jìn)行的描述，本發(fā)明以及其另外的目的和優(yōu)點(diǎn)將更為明了，其中圖1A顯示正常和糖尿病動(dòng)物胰腺組織的RT-PCR結(jié)果。圖1B顯示正常猴胰腺組織中胰島的免疫組化結(jié)果(a，c，e)和糖尿病猴胰腺組織中胰島的免疫組化結(jié)果(b，d，f)。其中，a和b分別表示正常猴和糖尿病猴的胰島β細(xì)胞情況；c和d分別表示正常猴和糖尿病猴的胰高血糖素細(xì)胞(α細(xì)胞)情況；e和f分別表示正常猴和糖尿病猴的δ細(xì)胞情況。結(jié)果顯示糖尿病猴胰島β細(xì)胞幾乎全部被破壞(b和a)，胰高血糖素細(xì)胞明顯增多，而分泌生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞無(wú)明顯改變。圖1C顯示針對(duì)Nestin基因的免疫組化結(jié)果，a是正常猴的結(jié)果，b是糖尿病猴的結(jié)果。圖1C顯示，對(duì)于正常猴和糖尿病猴，胰腺組織中均有Nestin的表達(dá)，只是Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的分布有所變化，在正常猴的胰腺組織內(nèi)，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞分布于胰腺腺管和胰島團(tuán)的周邊，而在糖尿病猴的胰腺組織中，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于胰島內(nèi)，并且數(shù)量明顯增多。
圖2A、2B、2C、2D顯示胰島、胰腺前體細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)結(jié)果。其中圖2A顯示在Petri dish(細(xì)菌培養(yǎng)皿)中可見漂浮的圓形或橢圓形胰島細(xì)胞團(tuán)；圖2B顯示將得到的分離后的巢蛋白陽(yáng)性的胰島細(xì)胞團(tuán)加入培養(yǎng)基A，接種于Petri dish中培養(yǎng)約3天的結(jié)果；圖2C顯示將圖2B中所示的胰島細(xì)胞團(tuán)接種于含有培養(yǎng)基B的普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15天左右的結(jié)果；圖2D顯示將得到的星形胰島干細(xì)胞(圖2C所示)用0.25％的胰酶消化下來(lái)后，Hank’s液中洗1遍，然后將細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的細(xì)菌培養(yǎng)皿中3天，得到前類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)(pre-ICC)。
圖3A為胰腺前體細(xì)胞(PPC)和ICC的RT-PCR結(jié)果。
圖3B顯示胰腺前體細(xì)胞，為巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。
圖3C顯示ICC中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于ICC的中央而胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于ICC的周邊。
圖4A和4B顯示Pre-ICCs、ICCs和正常胰島團(tuán)在30mM高糖刺激下胰島素和C肽的分泌情況。其中圖4A顯示胰島素的分泌情況，圖4B顯示C肽的分泌情況。
圖5A-5D顯示胰腺組織細(xì)胞在V型膠原酶中的消化和培養(yǎng)后得到的胰島細(xì)胞團(tuán)的照片。其中圖5A顯示消化5分鐘，培養(yǎng)2天的結(jié)果；圖5B顯示消化5分鐘，培養(yǎng)5天的結(jié)果；圖5C顯示消化10分鐘，培養(yǎng)2天的結(jié)果；圖5D顯示消化10分鐘，培養(yǎng)5天的結(jié)果。
圖6A-6D顯示根據(jù)實(shí)施例4在含培養(yǎng)基C和培養(yǎng)基D的培養(yǎng)皿中得到的類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)和胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的照片。圖6A顯示在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)2天得到的類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)，圖6B顯示在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)5天得到的類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)。圖6C顯示在培養(yǎng)基D中培養(yǎng)10天得到的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，圖6D顯示在含培養(yǎng)基D中培養(yǎng)15天所得到的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
圖7顯示正常和糖尿病動(dòng)物胰腺組織的RT-PCR結(jié)果。
圖8顯示PPC和ICC的RT-PCR結(jié)果。
圖9結(jié)果顯示當(dāng)ICC和成體胰島在不同濃度的葡萄糖或在同時(shí)含有10mM L-精氨酸的刺激下，胰島素和C-肽的分泌情況，其中圖9A1顯示ICC在存在不同濃度的葡萄糖或葡萄糖與10mM L-精氨酸同時(shí)存在的情況下胰島素的分泌情況；圖9A2顯示成體胰島在存在不同濃度的葡萄糖或葡萄糖與10mM L-精氨酸同時(shí)存在的情況下胰島素的分泌情況；圖9B1顯示ICC在存在不同濃度的葡萄糖或葡萄糖與10mM L-精氨酸同時(shí)存在的情況下C-肽的分泌情況；圖9B2顯示成體胰島在存在不同濃度的葡萄糖或葡萄糖與10mM L-精氨酸同時(shí)存在的情況下C-肽的分泌情況。
在以上圖中，insulin表示胰島素基因，Glucagon表示胰高血糖素基因，Somatostatin表示生長(zhǎng)抑素基因，PDX-1表示胰十二指腸同源異型盒基因，nestin表示巢蛋白基因，β-actin表示β肌動(dòng)蛋白基因，“-”、“Normal”表示正常猴，+STZ表示糖尿病猴，Glut-2表示葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2基因，Pre-ICC表示進(jìn)入培養(yǎng)基D之前的ICC，ICC表示經(jīng)培養(yǎng)基D分化后的ICC，Islet表示胰島。
具體實(shí)施例方式
對(duì)于患有糖尿病的動(dòng)物(哺乳動(dòng)物例如人或猴子)，由于其胰腺不能正常分泌胰島素，人們認(rèn)為不能或難以從患有糖尿病的動(dòng)物的胰腺內(nèi)分離出胰腺干細(xì)胞。如果從異體動(dòng)物的正常的胰腺內(nèi)分離出胰腺干細(xì)胞，不可能進(jìn)行自體移植，排異反應(yīng)的問題依然存在，并且從正常的胰腺內(nèi)分離出的胰腺干細(xì)胞的來(lái)源問題也無(wú)法解決。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物的胰腺內(nèi)仍然殘存有巢蛋白陽(yáng)性的胰腺干細(xì)胞。并且根據(jù)本發(fā)明提供的實(shí)施方式，已經(jīng)成功地在體外分離和培養(yǎng)出這種細(xì)胞，該細(xì)胞具有以下干細(xì)胞的分子生物學(xué)特征巢蛋白基因表達(dá)陽(yáng)性、ABCG2基因表達(dá)陽(yáng)性，如圖1A-1C所示。在有絲分裂原存在的情況下，這些細(xì)胞可長(zhǎng)期擴(kuò)增，在特殊誘導(dǎo)分化因子的作用下可分化為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞。
ABCG2ABCG2是ABC超家族的一員，它不但使腫瘤細(xì)胞具有多種藥物的耐藥性，而且最近發(fā)現(xiàn)它在維持干細(xì)胞的單一特性方面(即不分化方面)也有重要作用，目前多數(shù)學(xué)者把它也看作干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰腺干細(xì)胞中ABCG2基因表達(dá)陽(yáng)性。
CK19細(xì)胞角質(zhì)蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)，Gmyr et al發(fā)現(xiàn)成人CK19陽(yáng)性細(xì)胞能在體外再表達(dá)胰島素促進(jìn)因子1(insulinpromoter factor 1)，進(jìn)一步表明人胰腺多能前體細(xì)胞的存在，也表明CK-19可能為胰腺前體細(xì)胞的分子標(biāo)志之一。參見Gmyr V，Kerr-Conte J，Belaich S，Vandewalle B，Leteurtre E，Vantyghem MC，Lecomte-Houcke M，Proye C，Lefebvre J，Pattou F.Adult humancytokeratin 19-positive cells reexpress insulin promoter factor 1 invitrofurther evidence for pluripotent pancreatic stem cells in humans.Diabetes 2000；491671-1680。但是，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰腺干細(xì)胞中CK19基因表達(dá)陰性。
pdx-1是胰十二指腸同源異型盒基因(pdx-1)，胰腺干細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)的第1種分子標(biāo)記是1種同源區(qū)蛋白，即PDX-1。pdx-1對(duì)于出現(xiàn)在腸內(nèi)胚層背側(cè)及腹側(cè)的胰腺萌芽的生長(zhǎng)分化起重要作用，pdx-1的純合子缺失突變會(huì)導(dǎo)致胰腺無(wú)法形成。pdx-1陽(yáng)性胚胎胰腺干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化是多步驟的，pdx-1陽(yáng)性導(dǎo)管樣細(xì)胞也可產(chǎn)生外分泌腺泡細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰腺干細(xì)胞中pdx-1基因表達(dá)陰性。
ISL-1是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，它在胰島細(xì)胞的形成方面起著重要的作用。它所編碼的蛋白能夠結(jié)合到胰島素基因的增強(qiáng)區(qū)。在成體的所有胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞均有表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰腺干細(xì)胞中ISL-1基因表達(dá)陰性。
Glut-2葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2，是胰島β細(xì)胞的特定標(biāo)記物，它參與β細(xì)胞的增殖和對(duì)葡萄糖的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰腺干細(xì)胞中Glut-2基因表達(dá)陰性。Somatostatin是生長(zhǎng)抑素基因。
根據(jù)本發(fā)明，將來(lái)源于糖尿病動(dòng)物自身的干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、分化，可以將其用于糖尿病動(dòng)物的自體干細(xì)胞移植治療，也可以用于糖尿病的基因治療中的載體細(xì)胞。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然在糖尿病動(dòng)物的胰島內(nèi)，β細(xì)胞被完全破壞，但通過3mg/ml V型膠原酶的消化，仍然可以分離出殘存的胰島細(xì)胞團(tuán)，并且這些胰島團(tuán)貼壁后，可迅速長(zhǎng)成單層扁平細(xì)胞，這些細(xì)胞在7-8天時(shí)開始死亡，但是同時(shí)一種多角的星狀細(xì)胞開始迅速增殖，大概14-16天這些細(xì)胞可匯合。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示，這些多角形細(xì)胞為巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，但CK19染色為陰性，故這種多角的星狀細(xì)胞是胰島干細(xì)胞(PPC)。RT-PCR結(jié)果顯示，這些細(xì)胞除表達(dá)巢蛋白外，還同時(shí)表達(dá)另外一種干細(xì)胞的標(biāo)志ABCG2。當(dāng)這些細(xì)胞達(dá)到匯合后，繼續(xù)生長(zhǎng)，可自發(fā)形成假胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)(ICC)。當(dāng)這些細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)分化為ICC，免疫組化結(jié)果顯示，在ICC結(jié)構(gòu)中，胰島素陽(yáng)性細(xì)胞分布于ICC結(jié)構(gòu)的中央，而胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于ICC結(jié)構(gòu)的周邊。RT-PCR結(jié)果顯示，與PPC的RT-PCR結(jié)果比較，巢蛋白基因、ABCG2基因表達(dá)減弱或消失，而胰島相關(guān)基因開始表達(dá)，胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和PDX-1、ISL1、GLUT2等基因表達(dá)呈陽(yáng)性，如圖3A-C所示。本發(fā)明中所誘導(dǎo)分化得到的ICC在30mM的葡萄糖刺激下可合成分泌胰島素和C肽，分泌量約為正常胰島的1/8左右，如圖4A、4B所示。
根據(jù)本發(fā)明的一種檢測(cè)糖尿病動(dòng)物胰腺組織中胰腺干細(xì)胞的方法，包括a)免疫組化檢測(cè)，包括胰腺組織固定，制作石蠟包埋切片，封閉后接觸一抗抗體，接觸二抗抗體，然后封片觀察，其中所述一抗抗體包括兔抗巢蛋白抗體；b)RT-PCR分析，包括提取總RNA，形成cDNA，然后利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c)根據(jù)步驟a)和b)的結(jié)果確定糖尿病動(dòng)物胰腺組織中是否存在胰島干細(xì)胞。胰島干細(xì)胞的主要標(biāo)志是巢蛋白。如果糖尿病動(dòng)物胰腺組織中是存在巢蛋白表達(dá)，則存在胰島干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離殘存的胰島細(xì)胞團(tuán)的方法，包括以下步驟a)將胰腺組織剪碎成塊；b)對(duì)塊狀的胰腺組織進(jìn)行酶消化，然后終止消化；c)離心分離，去上清，清洗；d)得到分離后的胰島細(xì)胞團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法，包括以下步驟a)將從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離出的胰島細(xì)胞加入裝有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-5天；b)將懸浮的胰島細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；c)經(jīng)過6-20天，生長(zhǎng)出星形胰島干細(xì)胞；d)在所述星形胰島干細(xì)胞將匯合時(shí)傳代，直到長(zhǎng)滿傳代后的培養(yǎng)皿，得到胰島干細(xì)胞。
其中，培養(yǎng)基A包括RPMI 1640(廠家Invitrogen公司，加利福尼亞州，美國(guó))、8-15％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(廠家Invitrogen公司)、10mM HEPES Buffer Solution(4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液)(廠家Invitrogen公司)、1mMSodium pyruvate(丙酮酸鈉緩沖液)(廠家Invitrogen公司)、2mM L-glutamine(L-谷氨酸)(廠家Invitrogen公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-鏈霉素)(廠家Invitrogen公司)。所述培養(yǎng)基B包括RPMI 1640(廠家Invitrogen公司)、8-15％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(廠家Invitrogen公司)、10mM HEPES Buffer Solution(4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液)(廠家Invitrogen公司)、1mMSodium pyruvate(丙酮酸鈉緩沖液)(廠家Invitrogen公司)、2mM L-glutamine(L-谷氨酸)(廠家Invitrogen公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-鏈霉素)(廠家Invitrogen公司)、10-20ng/ml Human RecombinantBasic Fibroblast Growth Factor(bFGF)(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(R&D Systems公司，明尼蘇達(dá)州，美國(guó))、10-20ng/ml HumanRecombinant Epidermal Growth Factor(EGF)(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(R&D Systems公司)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種誘導(dǎo)PPC分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。聯(lián)合使用胰高血糖素樣生長(zhǎng)因子(GLP-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、betacellulin和煙酰胺等誘導(dǎo)分化因子，誘導(dǎo)PPC分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。一種將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)將胰島干細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-5天；b)將培養(yǎng)基C更換為培養(yǎng)基D，但仍然在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)大約4-15天，得到可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
其中，所述培養(yǎng)基C包括48％DMEM(廠家Invitrogen公司，貨號(hào)11966)、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12，(廠家Invitrogen公司，貨號(hào)11765)、2％B27(廠家Invitrogen公司)或者1g/L(5mg/L胰島素+5mg/L transferring+mgyliter selenium)ITS(廠家Sigma公司，密蘇里州，美國(guó))、0.05％-0.2％BSA(牛血清白蛋白)(廠家Sigma公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-鏈霉素)(廠家Invitrogen公司)、10-20ng/ml Human RecombinantBasic Fibroblast Growth Factor(bFGF)，(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(R&D Systems公司)、10-20ng/ml Human Recombinant EpidermalGrowth Factor(EGF)，(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(R&D Systems公司)；或者包括DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，bFGF 20ng/ml，EGF 20ng/ml，Antibiotics(100X，GIBCO)。
其中所述培養(yǎng)基D包括48％DMEM(廠家Invitrogen公司，貨號(hào)11966)、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12’(廠家Invitrogen公司，貨號(hào)11765)、2％B27(廠家Invitrogen公司)或者(5mg/L胰島素+5mg/L transferring+mgyliter selenium)ITS(廠家Sigma公司)、0.05％-0.1％BSA(牛血清白蛋白)(廠家Sigma公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-鏈霉素)(廠家Invitrogen公司)、10mM煙酰胺(廠家sigma公司)、10-100nM GLP-1(7-36amide)(胰高血糖素樣肽1，7-36氨基酸殘基)(廠家sigma公司)、10ng/ml HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(廠家R&D Systems公司)、500pmol/L Betacellulin(廠家R&D Systems公司)或者包括DMEM/F12 1∶1(5.6mM glucose)，B27(50X，Invitrogen公司)，0.075％BSA，10mM nicotinamide，Antibiotics(100X，Invitrogen公司)，10-100nM GLP-1(7-36 amide)(廠家sigma公司)，10ng/mlHGF(廠家R&D Systems公司)，500pmol/L Betacellulin(廠家R&DSystems公司)。
實(shí)施例1糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織中nestin陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)患有糖尿病的食蟹猴胰腺組織的獲得麻醉Ketamine 10mg/kg Atropine 0.04mg/kg 安定1mg/kg腹部備皮于劍突下腹正中切口，切開腹膜進(jìn)入腹腔，分離大網(wǎng)膜及腸管，于胃大彎下緣可見略帶粉紅色的胰腺，猴子的胰尾大多游離，于胰尾邊緣先縫一針，然后其周圍合包縫合一塊大約0.5×1cm大小的一塊胰腺組織，放入含有抗生素的冰冷Hank’s液中并洗2遍。
對(duì)胰腺干細(xì)胞的檢測(cè)1)免疫組化方法胰腺組織在4℃ 4％的多聚甲醛中固定24小時(shí)，然后0.01M PBS洗三遍(胰腺組織石蠟包埋切片)，5％封閉用正常羊血清室溫下封閉1小時(shí)，然后4℃一抗孵浴過夜，0.01MPBS洗三遍，熒光二抗室溫孵浴2小時(shí)，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U熒光顯微鏡下觀察。
所用到的抗血清有兔抗nestin抗體(廠家Chemicon公司，加利福尼亞州，美國(guó))、豚鼠抗胰島素抗體(廠家Zymed Laboratories公司，南加利福尼亞州，美國(guó))、小鼠抗胰高血糖素抗體(廠家Sigma公司)、兔抗生長(zhǎng)抑素抗體(DAKO公司，丹麥)。熒光二抗有Texasred羊抗兔IgG，Texas red羊抗小鼠IgG，Texas red羊抗豚鼠IgG，Cy2羊抗兔IgG，所有熒光抗體都按1∶200稀釋。
兔抗nestin抗體主要用來(lái)檢測(cè)Nestin蛋白。Nestin蛋白是一種中等纖維骨架蛋白，在神經(jīng)發(fā)育的研究中被確定為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Nestin蛋白也可作為胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物。
兔抗胰島素抗體主要用來(lái)檢測(cè)胰島β細(xì)胞，胰島β細(xì)胞是胰腺內(nèi)分泌部的主要功能細(xì)胞，它是體內(nèi)唯一可分泌胰島素的細(xì)胞。
小鼠抗胰高血糖素抗體主要用來(lái)檢測(cè)胰島內(nèi)的α細(xì)胞，α細(xì)胞是胰島內(nèi)分泌胰高血糖素的細(xì)胞。
兔抗生長(zhǎng)抑素抗體主要用來(lái)檢測(cè)胰島內(nèi)的δ細(xì)胞，δ細(xì)胞是胰島內(nèi)分泌生長(zhǎng)抑素的細(xì)胞。
結(jié)果本發(fā)明動(dòng)物模型免疫組化結(jié)果顯示，胰島的β細(xì)胞被完全破壞，同時(shí)殘存在胰島內(nèi)的α細(xì)胞明顯增生。Nestin陽(yáng)性細(xì)胞在正常情況下存在于胰島團(tuán)的邊緣和胰腺腺管，而在實(shí)施例的模型胰腺內(nèi)，nestin陽(yáng)性細(xì)胞主要存在于胰島團(tuán)內(nèi)，腺管內(nèi)分布明顯減少。
圖1B顯示正常猴胰腺組織中胰島的免疫組化結(jié)果(a、c、e)和糖尿病猴胰腺組織中胰島的免疫組化結(jié)果(b、d、f)。結(jié)果顯示糖尿病猴的胰島β細(xì)胞全部被破壞(b和a)，胰高血糖素細(xì)胞明顯增多(d和c)，而分泌生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞無(wú)明顯改變(f和e)。
圖1C顯示針對(duì)Nestin基因的免疫組化結(jié)果，a是正常猴的結(jié)果，b是糖尿病猴的結(jié)果。圖1C顯示，對(duì)于正常猴和糖尿病猴，胰腺組織中均有Nestin的表達(dá)，只是Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的分布有所變化，在正常猴的胰腺組織內(nèi)，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞分布于胰腺腺管和胰島團(tuán)的周邊，而在糖尿病猴的胰腺組織中，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于胰島內(nèi)，并且數(shù)量明顯增多。
2)RT-PCR分析方法細(xì)胞或組織的總RNA采用TRIZOL法提取，2微克的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR的反應(yīng)體系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM spermidine，20 U ofRnasin，0.5mM dNTP，0.5μg of Oligo(dT)15，50 U of SuperScriptTMIIRT(Invitrogen)，和無(wú)核酶水構(gòu)成，然后反應(yīng)體系在42℃水浴60分鐘和72℃水浴15分鐘。然后通過30-45循環(huán)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR的反應(yīng)體系由10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1.75mM MgCl2，0.4mM dNTP，0.2μM of sense and antisense primer，6.25 U Taq DNA polymerase and 3μg of cDNA構(gòu)成。變性溫度為94℃時(shí)間為45秒，退火溫度根據(jù)具體引物決定，時(shí)間為30秒，延伸溫度為72℃時(shí)間為7分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5％的凝膠電泳分離。
引物序列Insulin上游引物TCA CAC CTG GTG GAA GCT C(序列1)，下游引物ACA ATG CCA CGC TTC TGC(序列2)(179bp)。
Glucagon上游引物ATT CAC AGG GCA CAT TCA CC(序列3)，下游引物AAC AAT GGC GAC CTC TTC TG(序列4)(260bp)。
Somatostatin上游引物GTT TCT GCA GAA GTC TGG G(序列5)，下游引物AGT TCT TGC AGC CAG CTT TG(序列6)(223bp)。
PDX-1上游引物GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC ACG C(序列7)，下游引物CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC GGTC(序列8)(218bp)。
Nestin上游引物AGA GGG GAA TTC CTG GAG(序列9)和CTG AGG ACC AGG ACT CTC TA(序列10)(496bp)。
ABCG2上游引物GGT CTC AGG AAG ACT TAT GT(序列11)，下游引物AAG GAG GTG GTG TAG CTG AT(序列12)(323bp)。
Isl1上游引物CTT AAA TTG GAC TCC TAG AT(序列13)，下游引物GGA TTT GGA ATG GCA TGC GG(序列14)(280bp)。
Glut2上游引物TCC TGG CCT TTA CCC TGT TTA C(序列15)，下游引物CAG ACG GTT CCC TTA TTG TTT C(序列16)(209bp)β-actin上游引物TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAGC(序列17)，下游引物GCA CAG CTT CTC CTT AAT GTC ACGC(序列18)(396bp)。
結(jié)果本發(fā)明動(dòng)物模型胰腺組織的RT-PCR分析結(jié)果顯示如圖1A所示，其中左側(cè)的是正常猴的胰腺組織細(xì)胞的結(jié)果，右側(cè)是糖尿病動(dòng)物的胰腺組織的結(jié)果。如圖1A所示，胰島素基因(Insulin)表達(dá)轉(zhuǎn)為陰性，胰高血糖素基因(Glucagon)和生長(zhǎng)抑素基因(Somatostatin)表達(dá)仍呈現(xiàn)陽(yáng)性，PDX-1基因表達(dá)轉(zhuǎn)為陰性，β-actin基因表達(dá)仍呈現(xiàn)陽(yáng)性，干細(xì)胞標(biāo)志Nestin基因表達(dá)仍呈現(xiàn)陽(yáng)性。這說明在本發(fā)明使用的模型中，雖然胰島β細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，但在殘存的胰島內(nèi)，nestin陽(yáng)性的胰腺干細(xì)胞仍然存在于糖尿病動(dòng)物的胰腺組織中(見圖1A)。
實(shí)施例2從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離殘存的胰島細(xì)胞團(tuán)將實(shí)施例1中獲得的胰腺組織剪碎成1mm3大小的組織塊，3mg/ml的V型膠原酶中37℃消化10分鐘，然后加入等體積的冰冷的Hank’s液終止消化，1000rpm離心2-3分鐘后，去上清，冰冷Hank’s液中洗3遍，100目鋼網(wǎng)過濾，除去大塊組織后，將分離得到的細(xì)胞團(tuán)接種于含有培養(yǎng)基A的60mm的細(xì)菌培養(yǎng)皿中3天，每天用10ml的移液管吹打一次，防止細(xì)胞團(tuán)貼壁，然后于解剖鏡下挑取胰島細(xì)胞團(tuán)。參見圖2A，分離得到的胰島細(xì)胞團(tuán)在細(xì)菌培養(yǎng)皿中為漂浮的圓形或橢圓形胰島細(xì)胞團(tuán)。
另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)在V型膠原酶中的消化時(shí)間為5-10分鐘，并且細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2-5天時(shí)，均可以得到基本相同的胰島細(xì)胞團(tuán)，以下分別為消化5分鐘，培養(yǎng)2天(見圖5A)；消化5分鐘，培養(yǎng)5天(見圖5B)；消化10分鐘，培養(yǎng)2天(見圖5C)；消化10分鐘，培養(yǎng)5天得到的胰島細(xì)胞團(tuán)(見圖5D)實(shí)施例3胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)將實(shí)施例2中得到的分離后的巢蛋白陽(yáng)性的胰島細(xì)胞團(tuán)再加入培養(yǎng)基A，接種于60mm的Petri dish中3天，每天用10ml的移液管吹打細(xì)胞一次，防止胰島貼壁。3天后，將挑取的胰島細(xì)胞團(tuán)接種于含有培養(yǎng)基B的普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15天左右，當(dāng)生長(zhǎng)出來(lái)的星形胰島干細(xì)胞將匯合時(shí)傳代，參見圖2B、2C。
以下為培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B的成分，在實(shí)施例3中，采用的具體配方是配方4，但是采用文中提到的其他配方也可以同樣得到胰島干細(xì)胞。
培養(yǎng)基A成分比例廠家RPMI 1640 86％InvitrogenFBS 10％Invitrogen配方1 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 81％InvitrogenFBS 15％Invitrogen配方2 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 88％InvitrogenFBS 8％ Invitrogen配方3 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 43mlInvitrogen配方FBS 5ml Invitrogen4(等同 HEPES(100X) 0.5ml Invitrogen于配方 丙酮酸鈉(100X) 0.5ml Invitrogen1) L-glutamine(100X) 0.5ml InvitrogenAntibiotic(100X)0.5ml Invitrogen
培養(yǎng)基B成分 比例 廠家RPMI 1640 86％ InvitrogenFBS 10％ InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％Invitrogen配方1 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 81％ InvitrogenFBS 15％ InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％Invitrogen配方2 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 88％ InvitrogenFBS 8％InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸鈉(100mM) 1％Invitrogen配方3 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 43ml InvitrogenFBS 5mlInvitrogen配方HEPES(100X) 0.5ml Invitrogen4(等同 丙酮酸鈉(100X)0.5ml Invitrogen于配方 L-glutamine(100X) 0.5ml Invitrogen1) Antibiotic(100X) 0.5ml InvitrogenHuman bFGF20ng/mlR&D SystemsHuman EGF 20ng/mlR&D Systems
多角的星狀細(xì)胞(胰島干細(xì)胞或稱為胰腺前體細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞免疫組化檢測(cè)。該細(xì)胞的免疫組化染色按以下方法培養(yǎng)細(xì)胞在4℃4％的多聚甲醛中固定20分鐘，然后0.01MPBS洗三遍(培養(yǎng)細(xì)胞接種于涂有明膠的蓋玻片上)，5％封閉用正常羊血清室溫下封閉1小時(shí)，然后4℃一抗孵浴過夜，0.01MPBS洗三遍，熒光二抗室溫孵浴2小時(shí)，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U熒光顯微鏡下觀察。一抗和二抗的抗體同實(shí)施例1。
多角的星狀細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR分析采用以下方法細(xì)胞的總RNA采用TRIZOL法提取，2微克的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR的反應(yīng)體系由50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、20U Rnasin、0.5mMdNTP、0.5μg Oligo(dT)15、 50U SuperScriptTMII RT(廠家Invitrogen)、和無(wú)核酶水構(gòu)成，然后反應(yīng)體系在42℃水浴60分鐘和72℃水浴15分鐘。然后通過30-45循環(huán)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR的反應(yīng)體系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有義和反義引物、6.25U TaqDNA聚合酶、以及3μg cDNA構(gòu)成。變性溫度為94℃時(shí)間為45秒，退火溫度根據(jù)具體引物決定，時(shí)間為30秒，延伸溫度為72℃時(shí)間為7分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5％的凝膠電泳分離。
引物序列胰島素上游引物TCA CAC CTG GTG GAA GCT C(序列19)，下游引物ACA ATG CCA CGC TTC TGC(序列20) (179bp)
Somatostatin上游引物GTT TCT GCA GAA GTC TGG G(序列21)，下游引物AGT TCT TGC AGC CAG CTT TG(序列22)(223bp)PDX-1上游引物GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC ACG C(序列23)，下游引物CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC GGTC(序列24)(218bp)。
巢蛋白上游引物AGA GGG GAA TTC CTG GAG(序列25)和CTG AGG ACC AGG ACT CTC TA(序列26)(496bp)。
ABCG2上游引物GGT CTC AGG AAG ACT TAT GT(序列27)，下游引物AAG GAG GTG GTG TAG CTG AT(序列28)(323bp)。
Isl1上游引物CTT AAA TTG GAC TCC TAG AT(序列29)，下游引物GGA TTT GGA ATG GCA TGC GG(序列30)(280bp)。
Glut2上游引物TCC TGG CCT TTA CCC TGT TTA C(序列31)，下游引物CAG ACG GTT CCC TTA TTG TTT C(序列32)(209bp)。
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列33)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列34)(396bp)。
免疫組化結(jié)果顯示這些多角形細(xì)胞為巢蛋白基因陽(yáng)性細(xì)胞，如圖3B所示。RT-PCR結(jié)果如圖3A中左側(cè)的PPC所示，對(duì)于該多角形細(xì)胞，下列基因表達(dá)為陽(yáng)性巢蛋白，ABCG2，β-actin，而下列基因表達(dá)為陰性PDX-1、ISL-1、Glut-2、胰島素基因、生長(zhǎng)激素抑制素基因(Somatostatin)。
實(shí)施例4將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞將實(shí)施例3中得到的星形胰島干細(xì)胞用0.25％的胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)后，Hank’s液中洗1遍，然后將細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的細(xì)菌培養(yǎng)皿中3天，得到前類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)(pre-ICC)，圖2D。3天后將培養(yǎng)基更換為培養(yǎng)基D，但仍然在細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)大約4-6天，得到ICC結(jié)構(gòu)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
以下為培養(yǎng)基C和培養(yǎng)基D的成分，在實(shí)施例4中，我們采用的具體配方都是配方7，但是采用文中提到的其他配方也可以同樣得到胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在含培養(yǎng)基C(配方7)的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)可以為2-5天，如圖所示，分別為培養(yǎng)2天(圖6A)和5天(圖6B)得到的類胰島團(tuán)樣結(jié)構(gòu)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在培養(yǎng)基D(配方7)中培養(yǎng)4-15天均可以得到胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，如圖所示，分別為培養(yǎng)10天(圖6C)和15天(圖6D)所得到的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
培養(yǎng)基C成分 比例 廠家DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen配方1 5％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF 20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素1％ Invitrogen配方2 DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Sigma10％BSA 1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF 20ng/ml Invitrogen
10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)48％ InvitrogenF1248％ InvitrogenB272％ Sigma配方3 20％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方4 5％BSA 1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l萄萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方5 10％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方6 20％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM/F12(5.6mM葡萄糖) 48ml InvitrogenB27(50×) 1ml Invitrogen7.5％BSA 0.5mlInvitrogen配方7 bFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml InvitrogenAntibiotics(100×) 0.5mlInvitrogen
培養(yǎng)基D成分 比例 廠家DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen5％BSA 1％ Invitrogen配方1 煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen10％BSA 1％ Invitrogen配方2 煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen20％BSA 1％ Invitrogen配方3 煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ Invitrogen配方4 DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma5％BSA 1％ Invitrogen煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM Sigma
HGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma10％BSA 1％ Invitrogen配方5 煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma20％BSA 1％ Invitrogen配方6 煙酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug鏈霉素 1％ InvitrogenDMEM/F12(5.6mM葡萄糖)48ml InvitrogenB27 1ml Invitrogen配方7 7.5％BSA(100×) 0.5mlInvitrogen(等同 煙酰胺 10mM Sigma于配方 GLP-1(7-36 amide)10nM Sigma1) HGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D SystemsAntibiotics(100×) 0.5mlInvitrogen對(duì)ICC結(jié)構(gòu)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫組化檢測(cè)。免疫組化染色按以下方法ICC在4℃ 4％的多聚甲醛中固定1小時(shí)，然后0.01M PBS洗三遍(ICC接種于涂有明膠的蓋玻片上)，5％封閉用正常羊血清室溫下封閉1小時(shí)，然后4℃一抗孵育過夜，0.01MPBS洗三遍，熒光二抗室溫孵育2小時(shí)，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U熒光顯微鏡下觀察。一抗和二抗的抗體同實(shí)施例1。
ICC結(jié)構(gòu)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR分析采用以下方法細(xì)胞的總RNA采用TRIZOL法提取，2微克的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR的反應(yīng)體系由50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、20U Rnasin、0.5mMdNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50U SuperScriptTMII RT(Invitrogen)、和無(wú)核酶水構(gòu)成，然后反應(yīng)體系在42℃水浴60分鐘和72℃水浴15分鐘。然后通過30-45循環(huán)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR的反應(yīng)體系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有義和反義引物、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μg cDNA構(gòu)成。變性溫度為94℃時(shí)間為45秒，退火溫度根據(jù)具體引物決定，時(shí)間為30秒，延伸溫度為72℃時(shí)間為7分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5％的凝膠電泳分離。
RT-PCR分析結(jié)果顯示，ICC與PPC比較，ICC的巢蛋白基因、ABCG2基因表達(dá)減弱或消失，而胰島相關(guān)基因開始表達(dá)，胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和PDX-1、ISL1、GLUT2等基因表達(dá)呈陽(yáng)性，見圖3A。免疫組化檢測(cè)顯示，ICCs中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于ICC的中央而胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于ICC的周邊，見圖3C。
胰島素和C肽含量的測(cè)定鏡下挑選200個(gè)正常胰島、Pre-ICC(進(jìn)入培養(yǎng)基D之前的)或ICC(指經(jīng)培養(yǎng)基D分化后的ICC)，放入0.5ml的小離心管中，用無(wú)糖DMEM洗兩遍，每遍5分鐘，然后用30mM的葡萄糖于37℃(O2/CO2，95∶5)孵育90分鐘，然后再收集上清用ACTIVE InsulinELISA和ACTIVE C-Peptide of Insulin ELISA試劑盒分析測(cè)定，結(jié)果見圖4。
圖4顯示Pre-ICCs、ICCs和正常胰島團(tuán)在30mM高糖刺激下胰島素(圖4A)和C肽(圖4B)的分泌情況。
胰島素的分泌情況是(μIU/ml)pre-ICCs，3.47±1.55；ICC，45.02±2.94；胰島團(tuán)，330.63±31.70。
C肽的分泌情況是(ng/ml)pre-ICC，0±0；ICC，2.19±0.40；胰島團(tuán)，19.85±2.34。
實(shí)施例5糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織與正常動(dòng)物胰腺組織各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平比較的檢測(cè)RT-PCR分析采用以下方法細(xì)胞或組織的總RNA采用TRIZOL法提取，2微克的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR的反應(yīng)體系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、20URnasin、0.5mM dNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50 U SuperScriptTMII RT(廠家Invitrogen)、和無(wú)核酶水構(gòu)成，然后反應(yīng)體系在42℃水浴60分鐘和72℃水浴15分鐘。然后通過30-45循環(huán)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR的反應(yīng)體系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％TritonX-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有義和反義引物(senseand antisense primer)、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μgcDNA構(gòu)成。變性溫度為94℃時(shí)間為45秒，退火溫度根據(jù)具體引物決定，時(shí)間為30秒，延伸溫度為72℃時(shí)間為7分鐘。每個(gè)基因的PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線(即被擴(kuò)增的DNA片段的數(shù)量與循環(huán)圈數(shù)關(guān)系的曲線)用Real-time PCR(MJ Research，CFD-3220)的方法建立。為了比較各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，各個(gè)PCR所采用的是循環(huán)圈數(shù)是Real-timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最大循環(huán)圈數(shù)。PCR產(chǎn)物通過1.5％的凝膠電泳分離。
引物序列胰島素上游引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC(序列35)，下游引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA(序列36)(67bp)Glucagon上游引物ATTCACAGGGCACATTCACC(序列37)，下游引物AACAATGGCGACCTCTTCTG(序列38)(260bp)。
Somatostatin上游引物GCTGCTGTCTGAACCCAAC(序列39)，下游引物CGTTCTCGGGGTGCCATAG(序列40)(138bp)PDX-1上游引物TGATACTGGATTGGCGTTGT(序列41)，下游引物GCATCAATTTCACGGGATCT(序列42)(270bp)巢蛋白上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG(序列43)和TCCTGATAGCCGCGCACTG(序列44)(328bp)ABCG2上游引物GGCCTCAGGAAGACTTATGT(序列45)，下游引物AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT(序列46)(342bp)Isl1上游引物TGTTTGAAATGTGCGGAGTG(序列47)，下游引物GTTCTTGCTGAAGCCGATG(序列48)(144bp)Glut2上游引物TTGCTGGAAGAAGCATATCAGG(序列49)，下游引物TGACTAATAAGAATGCCCGTGAC(序列50)(148bp)
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列51)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列52)(396bp)。
本發(fā)明動(dòng)物模型胰腺組織的RT-PCR分析結(jié)果顯示如圖7所示，其中左側(cè)的是正常猴的胰腺組織細(xì)胞的結(jié)果，右側(cè)是糖尿病猴的胰腺組織的結(jié)果。如圖所示，糖尿病動(dòng)物胰腺組織中胰島素基因(Insulin)表達(dá)減少，胰高血糖素基因(Glucagon)表達(dá)增加和生長(zhǎng)抑素基因(Somatostatin)表達(dá)無(wú)明顯改變，PDX-1基因表達(dá)無(wú)明顯改變，β-actin基因表達(dá)無(wú)明顯改變，干細(xì)胞標(biāo)志巢蛋白基因表達(dá)有所增加，Glut-2基因表達(dá)減少。這說明在本發(fā)明使用的模型中，雖然胰島β細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，但在殘存的胰島內(nèi)，巢蛋白陽(yáng)性的胰腺干細(xì)胞仍然存在于糖尿病動(dòng)物的胰腺組織中。
實(shí)施例6對(duì)多角的星狀胰腺干細(xì)胞與誘導(dǎo)分化后的ICC各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)對(duì)實(shí)施例3的多角的星狀胰腺干細(xì)胞與實(shí)施例4的誘導(dǎo)分化后的ICC各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。細(xì)胞總RNA采用TRIZOL法提取，2微克的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR的反應(yīng)體系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、20U Rnasin、0.5mM dNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50 U SuperScriptTMII RT(廠家Invitrogen)、和無(wú)核酶水構(gòu)成，然后反應(yīng)體系在42℃水浴60分鐘和72℃水浴15分鐘。然后通過30-45循環(huán)的PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR的反應(yīng)體系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有義和反義引物(sense and antisense primer)、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μgcDNA構(gòu)成。變性溫度為94℃時(shí)間為45秒，退火溫度根據(jù)具體引物決定，時(shí)間為30秒，延伸溫度為72℃時(shí)間為7分鐘。每個(gè)基因的PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線(即被擴(kuò)增的DNA片段的數(shù)量與循環(huán)圈數(shù)關(guān)系的曲線)用Real-time PCR(MJ Research，CFD-3220)的方法建立。為了比較各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，各個(gè)PCR所采用的是循環(huán)圈數(shù)是Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最大循環(huán)圈數(shù)。PCR產(chǎn)物通過1.5％的凝膠電泳分離引物序列胰島素上游引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC(序列53)，下游引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA(序列54)(67bp)Somatostatin上游引物GCTGCTGTCTGAACCCAAC(序列55)，下游引物CGTTCTCGGGGTGCCATAG(序列56)(138bp)。
PDX-1上游引物TGATACTGGATTGGCGTTGT(序列57)，下游引物GCATCAATTTCACGGGATCT(序列58)(270bp)巢蛋白上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG(序列59)和CTGTCCTGATAGCCGCGCACTG(序列60)(328bp)。
ABCG2上游引物GGCCTCAGGAAGACTTATGT(序列61)，下游引物AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT(序列62)(342bp)Isl1上游引物TGTTTGAAATGTGCGGAGTG(序列63)，下游引物GTTCTTGCTGAAGCCGATG(序列64)(144bp)Glut2上游引物TTGCTGGAAGAAGCATATCAGG(序列65)，下游引物TGACTAATAAGAATGCCCGTGAC(序列66)(148bp)。
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列67)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列68)(396bp)。
RT-PCR結(jié)果如圖8所示ICC與PPC比較，ICC的巢蛋白基因、ABCG2基因表達(dá)減弱或消失，而胰島相關(guān)基因開始表達(dá)，胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和PDX-1、GLUT2等基因表達(dá)呈陽(yáng)性。
實(shí)施例7正常胰島和誘導(dǎo)分化得到的ICC在不同刺激物的作用下胰島素和C肽分泌量的測(cè)定鏡下分別挑選200個(gè)正常胰島或來(lái)自實(shí)施例4的ICC，放入0.5ml的小離心管中，用無(wú)糖DMEM洗兩遍，每遍5分鐘，然后分別用200ul含有不同濃度葡萄糖(0mM，5.6mM或者16.7mM)的DMEM或者200ul含有10mML-精氨酸和不同濃度葡萄糖(0mM，5.6mM或者16.7mM)的DMEM，37℃(O2/CO2，95∶5)孵育90分鐘，然后再收集上清用超敏感的胰島素ELISA和超敏感的C-Peptide胰島素ELISA試劑盒(Mercodia，Uppsala，Sweden)分析測(cè)定，結(jié)果見圖9。
圖9結(jié)果顯示當(dāng)ICC和成體胰島在不同濃度的葡萄糖或在同時(shí)含有10mM L-精氨酸的刺激下，胰島素(圖9A1、9A2)和C-肽(圖9B1、9B2)的分泌情況如下在不同濃度葡萄糖的刺激下，胰島素分泌量分別為(mIU×10-6/min/ICC or islet)在0mM濃度的葡萄糖刺激下正常成體胰島的胰島素分泌量為0.2174±0.0632，ICC為0.0561±0.0258；在5.6mM濃度的葡萄糖刺激下成體胰島的胰島素分泌量為0.9305±0.0896，ICC為0.0845±0.0339；在16.7mM濃度的葡萄糖刺激下成體胰島的胰島素分泌量為2.0907±0.2644，ICC為0.1801±0.0542；C-肽的分泌量為(pmol×10-6/min/islet or ICC)在0mM濃度的葡萄糖刺激下成體胰島的C-肽分泌量為4.441±1.218，ICC為0.0585±0.1013；在5.6mM濃度的葡萄糖刺激下成體胰島的C-肽分泌量為7.3336±1.9997，ICC為0.1295±0.1323；在16.7mM濃度的葡萄糖刺激下成體胰島的C-肽分泌量為9.4841±3.3433，ICC為0.5423±0.1382.當(dāng)在不同濃度的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，胰島素的分泌量為(mIU×10-6/min/ICCor islet)在0mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的胰島素分泌量為0.6003±0.0419，ICC為0.0641±0.0279；在5.6mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的胰島素分泌量為2.7675±0.8867，ICC為0.1809±0.0211；在的16.7mM葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的胰島素分泌量為6.1731±2.4574，ICC為0.2677±0.0792；C-肽的分泌量為(pmol×10-6/min/islet or ICC)在0mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的C-肽分泌量為5.5077±1.2808，ICC為0.2984±0.0301，在5.6mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的C-肽分泌量為7.9897±0.4765，ICC為0.4901±0.1382，在16.7mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同時(shí)刺激下，成體胰島的C-肽分泌量為12.6138±2.8141，ICC為0.6295±0.2471。
結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法，從糖尿病動(dòng)物的胰腺細(xì)胞可以獲得的ICC結(jié)構(gòu)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，該胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以分泌胰島素和C肽。該體外培養(yǎng)的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以同體或者異體移植給糖尿病動(dòng)物，使糖尿病動(dòng)物可以擺脫胰島素注射的依賴。并且解決了異體移植的排斥反應(yīng)和干細(xì)胞來(lái)源不足的問題。另外，本發(fā)明所提及的引物序列是由人工合成的(可由上海生工合成)。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)糖尿病動(dòng)物胰腺組織中胰腺干細(xì)胞的方法，包括a)免疫組化檢測(cè)，包括胰腺組織固定，制作石蠟包埋切片，封閉后接觸一抗抗體，接觸二抗抗體，然后封片觀察，其中所述一抗抗體包括兔抗巢蛋白抗體；b)RT-PCR分析，包括提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，然后利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c)根據(jù)步驟a)和b)的結(jié)果確定糖尿病動(dòng)物胰腺組織中是否存在胰腺干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)中PCR擴(kuò)增使用的引物包括巢蛋白基因的上游引物AGAGGGGAATTC CTGGAG和下游引物AGGACCAGGACTCTCTA(496bp)或者上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG和下游引物CTGTCCTGATAGCCGCGCACTG(328bp)。
3.一種從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離殘存的胰島細(xì)胞團(tuán)的方法，包括以下步驟a)將胰腺組織剪碎成塊；b)對(duì)塊狀的胰腺組織進(jìn)行酶消化，然后終止消化；c)離心分離，去上清，清洗；d)得到分離后的胰島細(xì)胞團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟b)中酶消化是在V型膠原酶中在37℃消化5-10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟b)中通過加入等體積的冰冷的Hank’s液終止消化。
6.一種胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法，包括以下步驟a)將從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離出的胰島細(xì)胞團(tuán)加入裝有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-5天；b)將懸浮的胰島細(xì)胞團(tuán)接種于含有培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；c)經(jīng)過6-20天，生長(zhǎng)出星形胰島干細(xì)胞；d)在所述星形胰島干細(xì)胞將匯合時(shí)傳代，直到長(zhǎng)滿傳代后的培養(yǎng)皿，得到擴(kuò)增的胰島干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基A包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、緩沖液、血清、氨基酸和抗生素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括RPMI1640；所述血清包括FBS；所述緩沖液包括4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、丙酮酸鈉緩沖液；所述氨基酸包括L-谷氨酸；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述培養(yǎng)基A包括RPMI1640、8-15％FBS、10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、1mM丙酮酸鈉緩沖液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug鏈霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基A的按體積計(jì)算的配方可以為86％RPMI 1640、10％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者81％RPMI 1640、15％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者88％RPMI 1640、8％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者43ml RPMI 1640、5ml FBS、0.5mlHEPES(100X)、0.5ml丙酮酸鈉(100X)、0.5ml L-glutamine(100X)、0.5ml Antibiotic(100X)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)基B包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、緩沖液、血清、氨基酸、抗生素和生長(zhǎng)因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括RPMI1640；所述血清包括FBS；所述緩沖液包括4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、丙酮酸鈉緩沖液；所述氨基酸包括L-谷氨酸；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素；所述生長(zhǎng)因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基B包括RPMI1640、8-15％FBS、10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺緩沖液、1mM丙酮酸鈉緩沖液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100u鏈霉素、10-20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10-20ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)基B包括86％RPMI 1640、10％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者81％RPMI1640、15％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者88％RPMI 1640、8％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸鈉(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者43ml RPMI 1640、5ml FBS、0.5ml HEPES(100X)、0.5ml丙酮酸鈉(100X)、0.5mlL-glutamine(100X)、0.5ml Antibiotic(100X)、20ng/ml HumanbFGF、20ng/ml Human EGF。
15.一種將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)將胰島干細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-5天；b)將培養(yǎng)基C更換為培養(yǎng)基D，但仍然在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)大約4-15天，得到可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的將胰腺干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，其中所述培養(yǎng)皿為細(xì)菌培養(yǎng)皿或涂有0.01％多聚鳥氨酸或多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)皿。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述培養(yǎng)基C包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑、白蛋白、抗生素和生長(zhǎng)因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培養(yǎng)添加劑包括B27或者1g/LITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素；所述生長(zhǎng)因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述培養(yǎng)基C包括49％DMEM、49％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/LITS、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug鏈霉素、10-20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10-20ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述培養(yǎng)基C包括48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％5％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％10％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％20％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/L ITS、1％5％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％10％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％20％BSA、20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)、B27(50X)、0.075％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、Antibiotics(100X)。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述培養(yǎng)基D包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑、白蛋白、抗生素、有誘導(dǎo)功能的多肽和生長(zhǎng)因子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培養(yǎng)添加劑包括B27或者1g/L ITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-鏈霉素；所述多肽和生長(zhǎng)因子包括煙酰胺、GLP-1、HGF、Betacellulin。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述培養(yǎng)基D包括49％DMEM、49％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/LITS、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug鏈霉素、10mM煙酰胺、10-100nM GLP-1、10ng/ml HGF、500pmol/LBetacellulin。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述培養(yǎng)基D包括48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％的5％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％的10％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者48％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％20％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％5％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％10％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；49％DMEM(無(wú)糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％20％BSA、10mM煙酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug鏈霉素；或者DMEM/F12 1∶1(5.6Mm glucose)、B27(50X)、0.075％BSA、10mM nicotinamide、Antibiotics(100X)、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pmol/LBetacellulin。
25.利用權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離得到的胰島細(xì)胞團(tuán)。
26.利用權(quán)利要求6至14中任一項(xiàng)所述的胰島干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法得到的胰島干細(xì)胞，所述胰島干細(xì)胞為多角形細(xì)胞，其中巢蛋白基因表達(dá)為陽(yáng)性。
27.利用權(quán)利要求15至24中任一項(xiàng)所述的將胰島干細(xì)胞培養(yǎng)成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法得到的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及從糖尿病動(dòng)物的胰腺組織中分離、培養(yǎng)胰島干細(xì)胞和將胰島干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離胰島細(xì)胞團(tuán)，然后a)將從糖尿病動(dòng)物胰腺組織中分離出的胰島細(xì)胞團(tuán)加入裝有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2－5天；b)將懸浮的胰島細(xì)胞團(tuán)接種于含有培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；c)經(jīng)過6－20天，生長(zhǎng)出星形胰島干細(xì)胞；d)在所述星形胰島干細(xì)胞將匯合時(shí)傳代，至到長(zhǎng)滿傳代后的培養(yǎng)皿，得到胰島干細(xì)胞。將胰島干細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基C的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2－5天；將培養(yǎng)基C更換為培養(yǎng)基D，但仍然在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)大約4－15天，得到可分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1982440SQ200610098769
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
發(fā)明者張愚, 鄒春林, 陳彪 申請(qǐng)人:北京市賽諾科生物工程技術(shù)有限公司