專利名稱：從中藥玉竹中分離的蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的提取物及其用途，尤其涉及從中草藥(TCM)玉竹(Polygonatum odoratum，Liliaceae)中分離的蛋白質(zhì)及其用途。
2.發(fā)明背景玉竹，Polygonatum odoratum(Mill)Druce，屬于百合科(liliaceae)，是一種著名的中草藥，常見于土壤肥沃，干燥至濕潤的陰涼處。該多年生植物在成熟期高1-3英尺，開白色鐘形小花，且在葉腋處大多成對地結(jié)深紫色果實。根莖可食用，習用于治療咳嗽、發(fā)燒及不適引起的虛弱，以及用于治療高脂血癥、預(yù)防心血管病及改善洋地黃對心肌的毒性，還用于治療由中風引起的癱瘓。因此，由廣東北部至中國東北各省的溫帶地區(qū)都有廣泛栽植。
在《中華人民共和國藥典(2000版)》中，Polygonatum odoratum為玉竹的法定(Rhizoma Polygonati Odorati)植物品種。然而，其它相關(guān)品種也已在市場上作為“玉竹”使用。根據(jù)《中華人民共和國藥典》，玉竹的質(zhì)控標準為其中多糖的含量。多糖的含量基于硫酸-苯酚方法測定的葡萄糖含量《不少于其干重的6％)。然而，《中華人民共和國藥典》未提供蛋白質(zhì)功能方面的數(shù)據(jù)。
在中國，玉竹的使用記錄可追溯到公元一世紀的《神農(nóng)本草經(jīng)》。其具有滋陰功效，尤其適用于消化、呼吸及心血管系統(tǒng)的疾病。玉竹在中國自古以來以復(fù)方煎劑形式來治療各種疾病而無任何明顯的副作用，因此可認為該藥中的蛋白質(zhì)對人類應(yīng)相對安全。
凝集素在植物防御中起重要作用。最近我們已從研究不多的中草藥中鑒別了幾種新的高效抗病毒凝集素。我們首先從中藥玉竹(RhizomaPolygonati Odorati)的干草本和新鮮植物中分離了未見報道的抗病毒蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明予以提供。
本發(fā)明克隆了編碼從P.odoratum根莖純化的抗病毒蛋白質(zhì)的cDNA，并將其用于轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。
本發(fā)明證明了已被用作中藥的玉竹P.odoratum及玉竹的相關(guān)品種(P.odoratum varieties)的蛋白質(zhì)(POL)有高生物活性，而且本發(fā)明提供了P.odoratum中蛋白質(zhì)POL的全長cDNA克隆，因此特別具有應(yīng)用價值。憑借該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)系統(tǒng)以及將該基因轉(zhuǎn)入細菌、可食用植物或作物種子的生物技術(shù)，它們提供了可大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，并且非常經(jīng)濟。所改造的食用植物或作物種子可被人或動物直接利用并獲取其生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)及其抑制癌細胞和諸如流感病毒的病毒增殖的用途。
本發(fā)明的第一方面提供了一種蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列的同源序列。
本發(fā)明的第二方面涉及一種具有SEQ ID NO1的同源序列的核酸。
本發(fā)明的第三方面提供了一種DNA構(gòu)建體，其包括可操作地與載體連接的SEQ ID NO1的同源序列的核酸。
本發(fā)明的第四方面提供了一種宿主細胞，其表達本發(fā)明所述的DNA結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的第五方面提供了一種蛋白質(zhì)表達方法，該蛋白質(zhì)具有宿主中SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列的同源序列，包括構(gòu)建構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括可操作地與載體連接的SEQ ID NO1的同源序列的核酸；將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細胞；以及收獲和分離所述宿主細胞中所述構(gòu)建體表達的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第六方面提供了一種從中藥玉竹中分離生物活性蛋白質(zhì)的方法，包括提供玉竹材料；將所述材料與NaCl溶液接觸，得上清液；在上清液中加入硫酸銨，得沉淀物；
在蒸餾水中滲析所述沉淀物，得溶液；凍干所述溶液得粗蛋白質(zhì)；以及將所述粗蛋白質(zhì)載入瓊脂糖柱制備目標蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第七方面提供了一種包括有效治療劑量的本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的藥物。
本發(fā)明的第八方面提供了本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)在制備抑制癌細胞或病毒增殖的藥物中的用途。
本發(fā)明的第九方面提供了一種抑制癌細胞或病毒增殖的方法，其包括將本發(fā)明所述的有效量的蛋白質(zhì)與細胞或病毒接觸。
本發(fā)明的第十方面涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其包括具有SEQ ID NO.1同源序列的核酸表達的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第十一方面提供了由本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物制成的功能食品或包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能食品。本發(fā)明的再一方面提供包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的動物飼料。
在本發(fā)明的一個實施方案中，從玉竹中分離蛋白質(zhì)，該蛋白優(yōu)選在Superdex 75 HR 10/30柱中具有29.02±0.74分鐘的保留時間。分離的蛋白質(zhì)能抑制癌細胞或病毒增殖。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，蛋白質(zhì)具有分子量為14kDa的亞基；優(yōu)選地，蛋白質(zhì)為由兩個亞基組成的具有28kDa分子量的同源二聚體。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，核酸具有SEQ ID NO.1序列。以及蛋白質(zhì)由SEQ ID NO.1編碼。
本發(fā)明中提及的病毒優(yōu)選為單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒和甲型流感病毒(包括禽流感病毒H5N1)，以及癌細胞包括HL-60細胞株和MCF-7細胞株。
本發(fā)明的其它方面和事項將參考附圖具體描述如下。


圖1a顯示本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)POL(F2)在胎球蛋白-瓊脂糖柱(5×1.5cm)上的色譜圖，其流速為0.5ml/minF1以平衡緩沖液45mM Tris緩沖液(pH＝8)洗脫；F2以含50mM甘氨酸的0.5M NaCl(pH＝3)洗脫緩沖液洗脫；櫟記物1應(yīng)用平衡緩沖液；以及標記物2應(yīng)用洗脫緩沖液。
圖1b顯示本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)POL(M2)在甘露糖-瓊脂糖親和柱(5×1.5cm)上的色譜圖，其流速為0.5ml/min，其中標記物1Mes緩沖液(20mM，pH＝6.2)；標記物2含0.2M甘露糖的Mes緩沖液；以及標記物32M NaCl溶液。
圖2顯示本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)POL(峰2)在Superdex 75HR 10/30柱(Pharmacia)上的色譜圖，其中洗脫緩沖液為0.1M碳酸氫銨(pH約8)溶液；流速為每分鐘0.4ml。峰2包含M2部分的大多數(shù)，約為柱中上樣總蛋白的66.6％。然而，為確保純度，僅收集了管14和15。可將管13再次上柱以進一步純化。
圖3a顯示在Superdex 75上凝膠過濾前后M2部分的SDS-PAGE電泳圖，其中A過親和柱后且在凝膠過濾前的M2以及B凝膠過濾后的M2GF。
圖3b顯示從玉竹中分離的F2部分的SDS-PAGE電泳圖，其中A＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地湖南；B＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地湖北；C＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地廣東；D＝Polygonatumodoratum中藥干品(飲片)；以及F2＝與胎球蛋白-瓊脂糖柱結(jié)合的部分。
圖3c顯示從玉竹中分離的F2和F1M2部分的SDS-PAGE電泳圖，其中A＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地湖南；B＝Polygonatum odoratumvar.產(chǎn)地湖北；C＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地廣東；D＝Polygonatumodoratum中藥干品；F1M2＝未與胎球蛋白-瓊脂糖柱結(jié)合部分的M2部分；以及F2＝與胎球蛋白-瓊脂糖柱結(jié)合的部分。
圖4a顯示本發(fā)明第一鏈cDNA的產(chǎn)生。
圖4b顯示用于5’和3’RACE的GSP，其中GSP基因特異性引物，以及NGSP嵌套式基因特異性引物。兩種引物基于保守的cDNA區(qū)域設(shè)計。
圖4c顯示POL的5’RACE，其中一條約500kb的特異帶被5’RACE擴增(箭頭所示)。
圖4d顯示POL的3’RACE，其中一條約400kb的特異帶被3’RACE擴增(箭頭所示)。
圖4e顯示POL開放閱讀框擴增的電泳。通過去除5’和3’非翻譯區(qū)域(UTR)，使用與起始和終止密碼子序列特異性結(jié)合的引物擴增POL的開放閱讀框(ORF)。該ORF代表具有多個家族成員的483bp的POL編碼序列。
圖5a顯示POL空間表達的RNA電泳，其中從三個玉竹品種不同植物生長器官提取的總RNA以瓊脂糖凝膠電泳分離(Y＝幼；O＝老)。
附圖5b顯示POL的空間表達，Northern印記(RNA雜交)分析。將POL開放閱讀框用作探針。在三種玉竹樣品的塊莖中檢測到明顯的信號。這表明POL在根莖中顯著高效地表達，而在其它如葉和果實的植物器官中表達很少。
圖6a顯示pET-載體系統(tǒng)中的六種構(gòu)建體。
圖6b顯示重組POL的蛋白質(zhì)表達譜，SDS-PAGE電泳圖。細菌誘導后，將所有六種構(gòu)建體表達產(chǎn)物加樣，進行SDS-PAGE。pET30a和pET32a為誘導后包含背景細菌蛋白質(zhì)的對照。箭頭指示為假定的POL帶。
圖6c顯示重組POL的蛋白質(zhì)表達譜，Western印記(蛋白質(zhì)雜交)。使用抗POL一級抗體，通過蛋白質(zhì)雜交Western印記進一步研究了在(a)中的SDS-PAGE，以驗證假定帶。黑色箭頭指示特異信號。僅構(gòu)建體2、4、5和6產(chǎn)生陽性信號。
圖6d顯示IPTG誘導時程。間隔5分鐘，研究構(gòu)建體6的重組POL的SDS-PAGE。紅色框突出了假定的POL帶。該帶逐漸變濃，在25分鐘時達到最大程度。
圖7顯示來自包涵體(inclusion bodies)的POL。研究了包涵體提取后構(gòu)建體6的重組POL的SDS-PAGE。富集假定的POL蛋白質(zhì)。
圖8a顯示谷蛋白-1啟動子構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，其中Glutelin-1pro谷蛋白-1啟動子；SPPOLPOL cDNA的信號肽序列；SPGt1谷蛋白-1基因的信號肽序列；BP-80結(jié)合蛋白-80kDa；CT細胞質(zhì)尾部；以及TMD跨膜結(jié)構(gòu)域。
圖8b顯示構(gòu)建體1)Gt1/SPPol/POL的DNA雜交Southern印記分析，其中WT野生型japonica(culitvar 9983)；+ve陽性對照，質(zhì)粒pSB130/Gt1/SPPOL/POL；以及M地高辛標記的DNA分子量標記物III(Roche)。
圖8c顯示構(gòu)建體2)Gt1/SPGt1/POL-BP-80(右)和構(gòu)建體3)Gt1/SPGt1/AB-POL(左)的DNA雜交Southern印記分析，其中WT野生型japonica(culitvar 9983)；1+ve陽性對照，質(zhì)粒pSB130/Gt1/SPGt1/AB-POL/Nos；2+ve陽性對照，質(zhì)粒pSB130/Gt1/SPGt1/POL/BP-80CT/BP-80TMD/Nos；以及M地高辛標記的DNA分子量標記物III(Roche)。
圖8d顯示構(gòu)建體1)Gt1/SPPol/POL的Northern印記分析，其中(A)將4μg水稻種子總RNA溶于1％瓊脂糖/甲醛凝膠；(B)使用POL cDNA作探針對轉(zhuǎn)基因水稻的Northern印記分析；12Gt1/SPPOL/POL轉(zhuǎn)基因株；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及M0.15kb-1.77kb RNA ladder(Invitrogen)。
圖8e顯示構(gòu)建體2)Gt1/SPGt1/POL-BP-80的Northern印記分析，其中B和CPOL-BP-80獨立轉(zhuǎn)基因株；D和GPOL-a-TIP獨立轉(zhuǎn)基因株；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及M0.15kb-1.77kb RNAladder(Invitrogen)。
圖8f顯示使用POL cDNA作探針對構(gòu)建體3)Gt1/SPGt1/AB-POL的Northern印記分析，其中1C、A、B和5獨立轉(zhuǎn)基因株；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及M0.24kb-9.5kb RNA ladder(Invitrogen)。B和D屬于同一轉(zhuǎn)基因株。
圖8g顯示構(gòu)建體1)Gt1/SPPol/POL的Western印記分析，其中3A和3B3號轉(zhuǎn)基因株的2種水稻種子；1212號轉(zhuǎn)基因株的水稻種子；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及M精確加蛋白雙色標準(PrecisionPlus Protein Dual Color Standards，Bio-Rad)。
圖8h顯示構(gòu)建體2)Gt1/SPGt1/POL-BP-80的Western印記分析，其中C24-26，C28-29轉(zhuǎn)基因株C的5種獨立的水稻種子；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及MPrecision Plus Protein Dual ColorStandards(Bio-Rad)。
圖8i顯示構(gòu)建體3)Gt1/SPGt1/AB-POL的Western印記分析，其中1C-6、1C-8和1C-9轉(zhuǎn)基因株1C的3種水稻種子；WT野生型japonica(cultivar 9983)；以及MPrecision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)。
具體實施例方式
本發(fā)明的上述方面及其它方面將利用參考文獻和附圖進一步具體地描述。
定義本發(fā)明中涉及的術(shù)語“玉竹”指一種植物，其屬于通常被定義為中藥的品種。本發(fā)明中，玉竹包括那些來自廣東、湖南及湖北等省的品種。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“POL”指Polygonatum odoratum lectin(玉竹凝集素)的縮寫，以及從植物玉竹中分離的蛋白質(zhì)的同義詞。
“分離的蛋白質(zhì)”指從玉竹中提取和分離的具有很強生物活性的蛋白質(zhì)。
此處所用的術(shù)語“同源性”或“同源的”用來描述兩種或多種氨基酸序列或核酸序列之間的一致性，亦指兩種或多種氨基酸或核酸序列或亞序列完全相同或具有相當高百分比的一致性。例如，在一個具體區(qū)域內(nèi)有約80％、85％、90％或95％的一致性。
本發(fā)明的第一方面提供了一種蛋白質(zhì)，具有由SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列的同源序列。其中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選為具有SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明已從玉竹中獲得一種“分離的蛋白質(zhì)”。該蛋白質(zhì)在FPLC系統(tǒng)上的Superdex 75HR 10/30柱中具有29.02±0.74分鐘的保留時間，此蛋白質(zhì)(POL)具有很強生物活性。
本發(fā)明還提供了一種從玉竹中提取分離的蛋白質(zhì)的方法。根據(jù)《中華人民共和國藥典(2000版)》所述的任何玉竹種類都可用作提取材料，本發(fā)明優(yōu)選使用來自中國廣東省的玉竹干草本材料。
POL的提取方法可包括獲得粗蛋白質(zhì)和“分離的蛋白質(zhì)”。在本發(fā)明的一些實施方案中，獲得粗蛋白質(zhì)通常包括但不局限于用NaCl水溶液勻漿切成片的玉竹干材料；緩慢地將硫酸銨加入產(chǎn)生的上清液中至飽和；收集產(chǎn)生的沉淀物；將沉淀物重新溶解于蒸餾水中；在蒸餾水中充分滲析產(chǎn)生的溶液；以及凍干產(chǎn)生的上清液，得粗蛋白質(zhì)粉末。
然后從所述的粗蛋白質(zhì)中分離具有生物活性的蛋白質(zhì)(分離的蛋白質(zhì))。本發(fā)明中使用具有特異性親和配體的瓊脂糖柱和Superdex分子篩層析柱來分離靶蛋白質(zhì)。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可用其它的方法，例如SDS-PAGE是一種由組合物中分離靶蛋白質(zhì)的常規(guī)方法，但本發(fā)明優(yōu)選使用效果較佳的親和色譜柱和分子篩層析柱。
本發(fā)明更優(yōu)選應(yīng)用了兩種瓊脂糖柱。通常，可使用兩種純化策略。
一種是胎球蛋白-瓊脂糖柱與甘露糖-瓊脂糖柱的結(jié)合應(yīng)用。首先，將粗蛋白質(zhì)載入諸如Sigma產(chǎn)品的胎球蛋白-瓊脂糖的柱子(5×1.5cm)上獲得結(jié)合蛋白質(zhì)，即“分離的蛋白質(zhì)”，然后將未結(jié)合的蛋白質(zhì)再載入諸如Sigma產(chǎn)品的甘露糖-瓊脂糖的柱子(5×1.5cm)，再取得“分離的蛋白質(zhì)”。
另一種替代的方法是將粗蛋白質(zhì)只載入甘露糖-瓊脂糖柱，從粗蛋白質(zhì)中直接獲得“分離的蛋白質(zhì)”。
優(yōu)選使用兩種親和柱的方法，因為由此獲得的產(chǎn)量比單獨使用甘露糖-瓊脂糖柱時高。前者的總產(chǎn)量為粗蛋白質(zhì)總量的約2％，而后者為約1％。
用已知標準物構(gòu)建的標準曲線校準，本發(fā)明分離的靶蛋白質(zhì)以分子篩層析柱(Superdex 75)證實具有28kDa的分子量。但由十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果表明分離的蛋白質(zhì)由兩個14kDa的亞基組成。
結(jié)合HPLC系統(tǒng)的Edman降解法通常用于篩查本領(lǐng)域中的氨基酸序列。本發(fā)明中，將“相同的”或“百分一致性”的同源性搜索用于確定所分離的蛋白質(zhì)的N-端氨基酸順序。
本發(fā)明POL是否含有碳水化合物以下述方法測試用Western印記把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移于固定膜(PVDF)上后，用高碘酸希夫氏染色法(PAS)染色。首先將PVDF膜上的蛋白質(zhì)用三氯乙酸(12.5％)固定。通過與氧化劑(該氧化劑含有1％高碘酸的3％乙酸溶液)反應(yīng)完成碳水化合物的氧化。然后將碳水化合物氧化后所暴露的醛基與亞硫酸品紅希夫氏(Schiff’s)試劑(Sigma)于暗處反應(yīng)，再用硫代硫酸鈉處理即得在白色背景下顯示出粉紅色的復(fù)合物(Ooi，1998)。
因此，由PAS染色陰性結(jié)果判斷POL不是糖蛋白。
本發(fā)明“分離的蛋白質(zhì)”已被證明可抑制如流感病毒的感染，以及抑制癌細胞的增殖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，那些與“分離的蛋白質(zhì)”具有同源性的蛋白質(zhì)將與在本發(fā)明中“分離的蛋白質(zhì)”具有類似的生物活性。
因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可作為藥物活性成分使用來抑制病毒感染和癌細胞的增殖。
本發(fā)明的藥物包括有效劑量的本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)。應(yīng)當了解，本發(fā)明的藥物可包括任何可藥用的載體。
本發(fā)明中可用的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。合適的載體按照所制備的藥物制劑和本發(fā)明所用的活性成分來選擇。
本發(fā)明提供了在個體中抑制病毒感染的方法，包括對所述個體進行有效劑量的本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)或本發(fā)明所述的藥物的給藥。
本發(fā)明的另一方面，提供了抑制癌細胞生長的方法，包括將有效劑量的本發(fā)明蛋白質(zhì)或藥物與癌細胞接觸。
本發(fā)明提供了在宿主細胞中表達本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的方法。為了在宿主細胞如細菌和植物細胞中表達靶蛋白質(zhì)，應(yīng)克隆該蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明中優(yōu)選使用植物細胞。
從玉竹的根、莖、葉及果實等不同的生長器官中分離總RNA。從玉竹中分離RNA有許多方法，例如，苯酚/氯仿提取法、RNAimage Kit(GenHunter Corporation，USA)。本發(fā)明優(yōu)選使用苯酚/氯仿提取法從冰凍研磨的組織中提取RNA。所用的所有設(shè)備和溶液以DiethylenePyrocarbonate(DEPC)處理以抑制RNA酶。整個提取過程應(yīng)保持在4℃低溫或在冰上以降低降解速度。然后以RNA凝膠電泳或紫外分光計鑒定RNA質(zhì)量。將RNA樣品保存在至少-70℃以備隨后的RT-PCR及Northern印記分析之用。當植物組織是新鮮收集的時候應(yīng)盡快提取RNA以使其質(zhì)量最佳。
將總RNA用于反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，以擴增目標蛋白質(zhì)的cDNA。擴增中的第一步為合成被擴增區(qū)域(總RNA的mRNA)的DNA拷貝(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄可作為一個單獨的步驟完成，或在同類的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)中完成，該反應(yīng)是擴增RNA的聚合酶鏈式反應(yīng)的一種改動。適于核糖核酸PCR擴增的方法描述于Romero和Rotbart的Diagnostic Molecular BiologyPrinciples and Applications(診斷分子生物學原則與應(yīng)用)pp.401-406、Persing et al.eds.，(Mayo Foundation，Rochester，MN 1993)以及Egger et al.，J.Clin.Microbiol.331442-1447(1995)中。
已證明使用簡并密碼引物難以獲得特異性擴增產(chǎn)物。通過在基因庫中同源性搜索所有Polygonatum種屬的甘露糖結(jié)合凝集素(MBLs)，可獲得靶蛋白質(zhì)的更具體信息。鑒別了兩種同源的Polygonatum MBL基因。它們來自cDNA序列間具有83％相似度的P.multiflorum(Van Damme etal.，1996)和P.cyrtonema(Bao et al.，2002)。然后將該相似度作為設(shè)計基因特異性引物(GSP)的指導。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用5’和3’cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)克隆全長POL cDNA。
因為單子葉植物的甘露糖結(jié)合蛋白(MBL)是異源的，(Van Dammeet al.，1996)，因此，可鑒別的是基因的開放閱讀框(ORF)而不是高度可變的5’和3’非翻譯區(qū)域(UTRs)。本發(fā)明中，將擴增產(chǎn)物導入pGEM-T載體以測序，以及在克隆的基因家族的異源成員中，將與存放于基因庫中的來自P.multiflorum和P.cyrtonema的兩個MBL家族基因具有最高同源性的那個基因選擇用于克隆及表達研究。
本發(fā)明中，利用Northern印記分析來檢測目標基因，尤其是POL基因空間表達的mRNA的存在。應(yīng)當了解，其它方法如RT-PCR和寡核苷酸分析也可用于檢測基因的空間表達。
利用開發(fā)的靶基因的編碼順序，本發(fā)明提供了將基因?qū)氡磉_載體系統(tǒng)來進行細菌表達的方法。本發(fā)明優(yōu)選使用pET-載體系統(tǒng)，如pET30a和pET32a表達載體(Novagen，USA)，其中pET32a包含比pET30a更大的融合標簽以便能產(chǎn)生更大的融合結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明另外的實施方案中，還優(yōu)選使用binary(雙元)載體系統(tǒng)，例如pBI121載體(Clontech，USA)。
然后可將本發(fā)明中克隆的靶基因用于轉(zhuǎn)化，來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的靶蛋白質(zhì)。優(yōu)選在可被人或動物食用的植物部分中，尤其是表達的蛋白質(zhì)可穩(wěn)定積聚的植物種子中。因此，本發(fā)明還提供了通過Agrobacterium介導的轉(zhuǎn)化將克隆的cDNA轉(zhuǎn)入植物，如japonica水稻的方法。我們成功地證明了轉(zhuǎn)基因整合及POL基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達，其中也證明了來自水稻的POL蛋白質(zhì)的抗病毒活性。因此，本發(fā)明可用于在大部分主要作物中生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)以供人和動物使用。
實施例實施例1 生物活性蛋白質(zhì)的分離I.玉竹的粗提物(蛋白質(zhì))將切成片的干燥玉竹，Polygonatum odoratum(來自中國廣東，)材料(250g)以0.2M NaCl水溶液(2ml/g)勻漿。高速離心(14,000×g)后取上清液，再緩慢加入硫酸銨[(NH4)2SO4，每升561g]至80％的飽和度，收集沉淀物。然后將該沉淀物溶于最小量蒸餾水中，并將其轉(zhuǎn)入透析袋(12K)中，在4℃于磁力攪拌器之上以十倍溶液體積的蒸餾水充分透析三個循環(huán)，每個循環(huán)4小時，并更換新鮮的蒸餾水。然后離心取上清液，再將其冷凍干燥即得粗蛋白質(zhì)粉末(約1.9g)。
II.用胎球蛋白瓊脂糖柱分離為了得到最佳結(jié)果，將上述部分I中制備的粗蛋白質(zhì)粉末(25mg)溶于45mM tris緩沖液(pH8.0)(25ml)中，濃度以不超過每毫升含2毫克蛋白質(zhì)為度。將該溶液載入已用相同緩沖液平衡的胎球蛋白-瓊脂糖(Sigma，U.S.A.)柱(5×1.5cm)。將未吸附的蛋白質(zhì)用平衡緩沖液洗脫后，再以含50mM甘氨酸的0.5M NaCl(pH3)洗脫吸附的蛋白質(zhì)(F2)。將未結(jié)合的部分F1(如下述表1b和1c)使用如III所述的甘露糖-瓊脂糖柱進一步分離M2，而得F1M2。如此分離的總活性化合物(F2+F1M2)約為總提取蛋白質(zhì)的2.1％。
III.以甘露糖瓊脂糖柱分離對于粘稠樣品，為獲得最佳結(jié)果，應(yīng)使用更稀的樣品濃度，如將提取物的粗制粉末(15mg)溶于23ml 20mM Mes緩沖液(pH6.2)，其中蛋白質(zhì)濃度不超過每毫升1毫克。將該溶液載入已用相同緩沖液平衡的甘露糖-瓊脂糖(Sigma，U.S.A.)柱(5×1.5cm)。將未吸附的蛋白質(zhì)用平衡緩沖液洗脫后，再用含0.2M甘露糖的洗脫緩沖液洗脫吸附的蛋白質(zhì)(M2)。
表1a

#(占總提取蛋白質(zhì)的％)表1b

表1c

實施例2 靶蛋白質(zhì)分子量的測定I.通過凝膠過濾(分子篩層析)將實施例1中制備的分離復(fù)合物(M2，F(xiàn)2或F1M2)進一步在FPLC系統(tǒng)上的Superdex 75HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)上純化，該系統(tǒng)以碳酸氫銨緩沖液(100mM，pH8)預(yù)先平衡，并以包含牛血清白蛋白、碳酸酐酶、細胞色素C、抑酶肽及胞苷的標準分子標記物(Sigma)校準。以標準物分子量(取對數(shù)值)和在柱上的相對保留時間構(gòu)建的標準曲線推斷出未知化合物的分子量。收集圖2中所示的保留時間為29.02±0.74分鐘(平均值±標準差，n＝12)的純蛋白質(zhì)，并稱之為POL。POL的分子量為28kDA。將POL及提取的靶蛋白的產(chǎn)量總結(jié)于表1a、1b及1c中。
II.通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來檢測分離的蛋白質(zhì)純度，如Laemmli(1970)所述。其為具有15％分離膠(pH8.9)和4％濃縮膠(pH6.8)的不連續(xù)系統(tǒng)。電泳之前，將所有樣品溶解在上樣緩沖液(內(nèi)含2％2-巰基乙醇及2％SDS)并煮沸5分鐘。將樣品在minielectrophoresis system(Bio-Rad Mini-PROTEANII Elecrophoresis Celland Power pack 300)中恒壓(200V)室溫下電泳48分鐘。電泳后，凝膠用考馬斯亮藍R-250染色30分鐘。
如圖3a、3b及3c所示，POL被推測為具有28kDa分子量的同源二聚體，由兩個14kDa的亞基組成。
實施例3 N-端氨基酸序列的分析將實施例2中在SDS-PAGE凝膠上分離的POL的樣品立即轉(zhuǎn)入minitrans-blot cell(Bio-Rad)在恒壓(30V)及4℃條件下轉(zhuǎn)印至聚二氟乙烯膜(PVDF)上。所用的緩沖液是Dunn’s改良緩沖液(由10mM NaHCO3、3mMNa2CO3和0.02％SDS組成，pH9.9)，時間約為1小時。將14kDa亞基切下，并用HP G1000A Edman degradation unit和HP-1000 HPLC系統(tǒng)來分析。
表2顯示，將POL的N-端氨基酸序列與單子葉植物Alliaceae、Amaryllidaceae和Liliaceae等科中的甘露糖結(jié)合凝集素(lectin)進行了比較。這些凝集素包括1ATL，Allium tuberosum凝集素(Ooi et al.，2002)；2ASA I，Allium sativum凝集素(VanDamme et al.，1992)；3ACA，Alliumcepa凝集素(VanDamme et al.，1995)；4GNA，Galanthus nivalis凝集素(VanDamme et al.，1991)；5NTL，Narcissus tazetta凝集素(Ooi et al.，2000)；6AAA，Aloe arborescens凝集素(Koike et al.，1995)；7POL，本研究中的Polygonatum odoratum凝集素；8.PMA，Polygonatum multiflorum凝集素(VanDamme et al.，1996)；9.PCA，Polygonatum cryptonema凝集素(Bao etal.，NCBI數(shù)據(jù)庫)。
在開始的20個氨基酸上POL序列表現(xiàn)出與P.multiflorum(VanDamme et al.，1996)的有甘露糖結(jié)合特異性的凝集素的序列相同(表2，下劃線的序列)。
表2

實施例4 克隆I.植物組織中RNA的分離分別從玉竹的不同生長器官分離總RNA，該器官包括根莖、葉及果實。使用苯酚/氯仿提取法(Altenbach et al.，1989)將其從冰凍研磨的組織(Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地廣東)提取出來。然后用RNA凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。將RNA樣品保存在-80℃以備隨后的RT-PCR及Northern印記分析之用。
II.Polygonatum odoratum凝集素(POL)cDNA的克隆用總RNA進行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)以再生第一鏈cDNA。該合成可與MMLV反轉(zhuǎn)錄酶-H-突變體聯(lián)用，后者作為末端轉(zhuǎn)移酶將3至5個核苷酸殘基(主要是dC)加至第一鏈cDNA的3’末端。該dC短寡核苷酸可方便隨后的擴增，使用試劑盒中以G結(jié)尾的短引物(SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，Clonetech Co.，Catalogue no.K1811-1)(圖4a)。
參照附圖4b，基于P.multiflorum和P.cyrtonema的MBL之間的保守序列設(shè)計基因特異性引物(GSP)。使用第一個由6個氨基酸組成的N端序列和GSP將部分cDNA(約300bp的特異帶)以RT-PCR克隆?；诓糠謈DNA序列，使用5’和3’cDNA末端快速擴增(RACE)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)(SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，CLONTECH)，克隆了全長cDNA，如圖4c和4d所示。
擴增了5’和3’非翻譯區(qū)域(UTR)，但因為它們是高度不保守的，僅通過識別起始和終止密碼子克隆了開放閱讀框(ORF)(附圖4e)。
設(shè)計兩個引物(5’POL5’ATC TAC ATA TGG CAG CTA GTA ATAGTT C 3’；3’POL5’GTA TAC GGA TCC TAC TCA TTA AGC ATC GCT C3’)以擴增POL cDNA的開放閱讀框。PCR反應(yīng)在25μl反應(yīng)混合物(0.2μgDNA模板、1μM 5’引物、1μM 3’引物、1×PCR緩沖液、1mM MgCl2、0.1mM dNTP、2.5單位Taq聚合酶)中，于下述反應(yīng)條件下進行94℃5分鐘，然后25個循環(huán)94℃30秒，56℃30秒以及72℃1分鐘，然后1個循環(huán)72℃7分鐘。
將擴增產(chǎn)物導入pGEM-T載體用于測序。分離并測序了十二個隨機克隆。發(fā)現(xiàn)它們彼此間僅幾個堿基對略有不同。將與P.multiflorum和P.cyrtonema的MBL具有最高同源性的克隆選作進一步克隆及表達，其序列被描述為SEQ ID No.1。
實施例5 表達I.空間表達分析克隆POL cDNA后，研究了POL基因的空間表達。進行了RNA電泳，其中將6μg來自不同組織的總RNA變性，在1％瓊脂糖凝膠中分離，并使用地高辛標記的POL ORF作為探針雜交。將RNA ladder(0.24-9.5kb)用作分子量標記物。
Northern印記分析顯示，尤其在所有三種玉竹品種，即P.odoratum var.廣東(小玉竹)、P.odoratum var.湖南(中玉竹)以及P.odoratum var.湖北(大玉竹)的塊莖中檢測到信號，但在其它器官如葉和果實中未檢測到。POL mRNA具有約700bp的大小(圖5a和5b)。
實施例6 玉竹活性蛋白質(zhì)(POL)的定性從中藥玉竹中純化的蛋白質(zhì)(POL)顯示了對單純皰疹病毒(HSV-1，HSV-2)、呼吸道合胞體病毒(RSV)和甲型流感病毒的顯著抗病毒活性以及其為禽流感病毒(禽流感病毒H5N1)的強抑制劑。
I.凝血試驗根據(jù)在先前所述(Ooi et al.，1998)的U形微量滴定板進行本分析。凝血滴度被定義為顯示出凝血的最高稀釋度的倒數(shù)，并等于一個凝血單位。表3中將特異性凝血活性表示為每毫克蛋白質(zhì)的凝血單位數(shù)。取兔、人(ABO型)以及雞的紅血球用于凝血試驗。伴刀豆球蛋白A(ConA)用作陽性對照，而磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1M，pH7.4)用作陰性對照。試驗過程如下在室溫下，在U形微量滴定板中加入凝集素溶液((50μl，溶解在PBS中)的連續(xù)兩倍稀釋液(如2，4，8...等倍)，然后將每一稀釋液與50μl 2％紅血球PBS懸液混合。約1小時后，當陰性對照(僅具有紅細胞和緩沖液)完全沉淀時讀取結(jié)果。本研究包括總的粗蛋白質(zhì)溶液(274μg/ml)、M1溶液(未與甘露糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，387μg/ml)、M2溶液(甘露糖結(jié)合蛋白，191μg/ml)和純化的POL溶液(278μg/ml)以及ConA溶液(800μg/ml)。
表3顯示了如前述從Polygonatum ordoratum(PO)中純化的POL作為上述的凝集素發(fā)揮作用，對兔子紅血球有弱凝血活性，人或雞的紅血球均不被凝集。
表3

在表3中，當與ConA相比時，POL為兔紅血球的一種弱凝集素。然而，人或雞的紅血球均不被凝集。
II.抗病毒活性同時利用細胞病變效應(yīng)(CPE)和/或使用Vero細胞(對HSV)、HEp2細胞(對RSV)和MCDK細胞(對甲型流感病毒)的空斑減少試驗(Plaquereduction test)來檢測POL、病毒對照及陽性對照的抗病毒活性。IC50值為抑制50％病毒感染所需的蛋白質(zhì)濃度。較低的IC50值意味著需要較少的蛋白質(zhì)抑制病毒感染。因此，IC50值越低，抗病毒活性越高。
1)空斑減少試驗本試驗用Vero細胞單層作為病毒宿主。Vero細胞在塑料培養(yǎng)皿(60mm)中培養(yǎng)，然后用每0.2毫升100空斑形成單位(PFU)的HSV-1、HSV-2或RSV于37℃，5％CO2及潮濕空氣條件下的培養(yǎng)箱中進行感染。感染1小時后，洗去多余的接種物，再以4ml含有不同劑量提取物的營養(yǎng)甲基纖維素(0.8％)培養(yǎng)基覆蓋細胞單層，在37℃培養(yǎng)3天，(提取物的劑量分別在1.55μg/ml至50μg/ml范圍內(nèi))。最后將被感染的細胞固定(用10％福爾馬林)和染色(用1％結(jié)晶紫)，并計算空斑數(shù)。將空斑減少試驗中對各株HSV-1、HSV-2和RSV的IC50總結(jié)于表4中?？瞻邷p少試驗中對HSV-1(15577)、HSV-1(阿昔洛韋抗性株)、HSV-1(臨床株)、HSV-2(臨床株)和RSV(長株)的IC50分別為2.6、6.8、9.5、14.96及25μg/ml。另外一份相同Vero細胞培養(yǎng)物用作陽性對照試驗，而用作陽性對照的藥物是阿昔洛韋和利巴韋林。
表4顯示了空斑減少試驗中對各株病毒HSV1、HSV2和RSV的IC50。
表4

2)細胞病變效應(yīng)(CPE)抑制試驗將提取物的連續(xù)兩倍稀釋液(1.55μg/ml至50μg/ml范圍)和等體積的病毒懸液[103×TCID50/ml(每毫升病毒懸液可致50％組織培養(yǎng)細胞受感染的劑量)]覆蓋96孔板中的細胞單層。感染后第三天在倒置相差顯微鏡下觀察病毒誘導的CPE。以病毒對照組為百分之百，將試驗組病毒增殖的減少比對病毒對照組來計算，(病毒對照組的百分比＝CPE試驗組/CPE病毒對照組×100)。相對于病毒對照組，提取物或藥物能導致試驗組病毒減少50％CPE的濃度，將其定義為50％抑制濃度(IC50)。
將中藥玉竹干品分離的POL的抗病毒活性總結(jié)于表4a中，而將從同區(qū)域收集的新鮮植物分離的POL抗病毒活性總結(jié)于表4b中。高效蛋白質(zhì)POL的抗病毒作用可與當前所用的抗病毒藥物相媲美。例如在相同的試驗條件下，以CPE法測定的阿昔洛韋對HSV-1和HSV-2的IC50為0.25μg/ml和0.35μg/ml；以及當在Vero細胞中以空斑減少試驗測定的IC50為0.15μg/ml和0.13μg/ml。此外，以CPE法測定的利巴韋林對RSV的IC50為6.3μg/ml；以及當在HEp 2細胞中以空斑減少試驗測定的IC50為3.3μg/ml。
表4a-4b概述了購買的玉竹藥材干品和從同區(qū)域收集的新鮮玉竹的抗病毒結(jié)果(以CPE法)。
表4a玉竹(藥材干品)IC50(μg/ml)

表4b玉竹(新鮮草本)IC50(μg/ml)

3)細胞毒性測試以Vero細胞測試POL的體外細胞毒性作用。將2×105/ml細胞接種于96孔板的孔中，以1％基本培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)24小時。24小時后將所有培養(yǎng)基移出，加入各劑量樣品(溶在MEM中)[樣品劑量為連續(xù)兩倍稀釋液(在15.6至5000μg/ml范圍)]，再培養(yǎng)3天。用MTT方法檢測活細胞數(shù)量。將細胞毒性表示為50％細胞毒性濃度(CC50)，其為抑制50％細胞生長的物質(zhì)濃度。
當終濃度為0.5mg/ml的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)加至培養(yǎng)物時，將培養(yǎng)物進一步于37℃培養(yǎng)3小時，使MTT被活細胞的線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化為formazan。因此，該測試評價了化合物抑制線粒體脫氫酶代謝活性的能力。以A690nm作參照，使用多路掃描平板讀數(shù)器(multiscan plate reader)于A540nm測定formazan。
將POL對Vero細胞的細胞毒性作用以其CC50表示，約為156μg/ml。因其IC50約為2.2μg/ml，所以選擇性指數(shù)(SI)為156/2.2＝71。
4)直接抗病毒活性測試為測試可能存在的抗病毒活性，將POL(50μg/ml)與HSV-1(15577)病毒[具有3.2×106PFU(空斑形成單位)]共培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)1小時。然后將混合物迅速稀釋至10-5倍，并測定殘余病毒。將抗病毒作用以空斑減少試驗測定。數(shù)據(jù)顯示了僅11-12％的病毒失活。
5)POL預(yù)處理對Vero細胞作用的測試將Vero細胞單層分別與POL(濃度為12.5、6.25、3.125、或1.56μg/ml)在37℃培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，用培養(yǎng)基洗滌細胞單層兩次以去除過量的POL，然后用HSV-1病毒感染并讓空斑形成。將未用POL處理的細胞作對照。數(shù)據(jù)顯示了即使在病毒感染前存在POL，Vero細胞不能受保護而仍然被病毒感染。因此，POL預(yù)防病毒感染的機制與多糖(通常以通過細胞吸附機制)不同。有待進一步研究其抑制病毒感染的能力和機制。
6)凝集素抑制劑的測試甘露聚糖(甘露糖的低聚糖)通?？梢种聘事短墙Y(jié)合凝集素的凝血活性。當甘露聚糖(達25μg/ml)和POL同時存在在培養(yǎng)基中時，其抗病毒(HSV-1)結(jié)果不受影響。數(shù)據(jù)表明了甘露聚糖自身不具有破壞POL抗病毒活性的能力，也不能增強或抑制病毒的復(fù)制。
III.體外抗癌細胞增殖的作用從美國典型培養(yǎng)物保藏中心American Type Culture Collections(ATCC)(Rockville，Maryland)獲得人白血病HL-60和人乳腺癌MCF-7細胞株。按照ATCC說明書保存所有培養(yǎng)物。將懸浮的癌細胞株HL-60，在生長培養(yǎng)基中的細胞濃度調(diào)節(jié)至每毫升含1×105細胞，然后將樣品材料連續(xù)兩倍稀釋，從200μg/ml降至0.78μg/ml。將細胞-樣品混合物(100μl)加至圓底96孔板的各孔中，并在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)72小時。然后，將各濃度樣品中的細胞數(shù)量以細胞計數(shù)測定。
為評價POL對MCF-7癌細胞株的生長抑制效果，采用MTT[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物]定量比色法測定細胞生長和存活。將細胞以2.5×103細胞/孔/100μl的密度接種于96孔微量滴定板中，再加入連續(xù)兩倍稀釋的POL的各濃度由200μg/ml降至6.25μg/ml。處理72小時后，將10μl MTT(5mg/ml)加至各孔，再于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時?；罴毎械幕钚跃€粒體脫氫酶將淺黃色的四唑鹽轉(zhuǎn)化為深藍色的formazan產(chǎn)物。將沉淀的formazan以150μl HCl-異丙醇(0.04N)溶解，在570nm處檢測吸光度。平均值和標準差來自三次的測試數(shù)據(jù)點。將獨立的試驗重復(fù)三次。在72h時測定了對MCF-7細胞的50％抑制濃度(IC50)。
POL對HL-60白血病及MCF-7細胞株的抗增殖作用具有劑量依賴性模式，其IC50在150至200μg/ml。
POL對禽流感(H5N1)的抗病毒活性的預(yù)測試顯示了其具有抗H5N1活性的潛力，其IC50約為15-30μg/ml。
實施例7 生物活性重組(POL)在細菌中的表達I.重組POL構(gòu)建體及其表達設(shè)計的六種構(gòu)建體(圖6a)pET30a構(gòu)建體1T7pro/POL(ORF)/T7ter構(gòu)建體2T7pro/POL(ORF w/o SP)/T7ter構(gòu)建體3T7pro/His.Tag/S.Tag/POL(ORF)/T7ter構(gòu)建體4T7pro/His.Tag/S.Tag/POL(ORF w/o SP)/T7terpET32a構(gòu)建體5T7pro/TrxA-Tag/His-Tag/POL(ORF)/T7ter構(gòu)建體6T7pro/TrxA-Tag/His-Tag/POL(w/o SP)/T7ter所有的六種基因構(gòu)建體在IPTG誘導下被成功表達。對于pET30a表達系統(tǒng)，非融合構(gòu)建體1和2顯示了SDS-PAGE中的主要多肽分別為約15和14kDa，其中在構(gòu)建體2中去除了SP。對于融合構(gòu)建體3和4，它們產(chǎn)生了大小約為20kDa的主帶，然而，pET32a系統(tǒng)中的更大的融合構(gòu)建體5和6編碼了約30kDa的融合POL(圖6b)。在沒有SP的所有3種構(gòu)建體，即構(gòu)建體2、4和6中檢測到強烈的信號，但在具有SP的構(gòu)建體，即1、3和5中信號微弱或甚至沒有信號(圖6c)。同樣，在融合構(gòu)建體中檢測到的信號似乎強于該非融合構(gòu)建體中的信號。表達及檢測特征概述于表5中。
表5

II.在細菌系統(tǒng)中表達的重組POL將POL在pET細菌系統(tǒng)中成功表達(表5)。設(shè)計六種構(gòu)建體來研究和定性1)融合和非融合構(gòu)建體之間以及2)信號肽序列(SP)存在和不存在時的表達水平上的差異。結(jié)果顯示了所有融合構(gòu)建體(3、4、5及6)比非融合構(gòu)建體(1和2)都具有更好的表達和檢測水平。此外，較大的融合構(gòu)建體(5和6)似乎具有甚至比較小的融合構(gòu)建體(3和4)更好的結(jié)果。本發(fā)明采用了融合蛋白策略，其有助于穩(wěn)定表達的蛋白質(zhì)以及有效預(yù)防蛋白質(zhì)的降解。另一方面，我們還證明了在信號肽研究中，無SP的所有構(gòu)建體(2、4和6)比那些具有SP的構(gòu)建體(1、3和5)具有更高的表達及檢測水平。該結(jié)果表明了POL信號肽序列能引起在細菌系統(tǒng)中較低的蛋白質(zhì)表達。
將構(gòu)建體6用于0.1M IPTG誘導時程的研究。將IPTG加入培養(yǎng)物后(時間為0)，間隔5分鐘取出1ml細菌培養(yǎng)物并離心。采用SDS-PAGE分析樣品，被假定的POL帶(約30kDa)變得越來越濃，最后于誘導后25分鐘時達到最大程度(圖6d)。對于IPTG誘導時程的研究，按照pET表達系統(tǒng)操作手冊(Novagen)，表明了重組蛋白質(zhì)應(yīng)以0.1M IPTG誘導3小時就能得到最佳結(jié)果。然而，本發(fā)明提供的方法顯示了重組POL的表達能在25分鐘內(nèi)達到最高水平。最近，Sanden et al.(2003)的工作支持了該發(fā)現(xiàn)，其報道了核糖體和rRNA誘導后又被降解(從100％至20％)，因為重組產(chǎn)物水平高。因此，翻譯似乎是蛋白質(zhì)合成能力的起始限制性因素。此外，轉(zhuǎn)錄分析顯示了β-半乳糖苷酶特異性信使RNA在誘導后(＜5min)立即形成，因此，因為核糖體的數(shù)量有限，重組蛋白質(zhì)能在誘導5分鐘后立即被合成并迅速達到最大值。
為了獲得更好的轉(zhuǎn)化和表達結(jié)果，將5μl細菌甘油原料接種于5ml LB培養(yǎng)液中并于37℃振搖16小時。然后將接種物于100ml LB中以1∶100比例并于37℃振搖繼續(xù)培養(yǎng)3小時。將IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)以0.1M的終濃度加至培養(yǎng)物，然后于37℃振搖3h。
III.體外重組POL的抗病毒活性定性了重組POL的生物活性。使用各種動物細胞系以細胞病變效應(yīng)(CPE)分析檢測粗制融合產(chǎn)物中重組POL的抗病毒活性。首先分離細菌的包涵體以富集重組的POL。然后將提取的包涵體通過甘露糖親和柱來純化重組蛋白質(zhì)。然后將純化的蛋白質(zhì)用于CPE分析，其中將蛋白質(zhì)與欲測試病毒(HSV、RSV和FluA)在不同細胞系中培養(yǎng)以得到IC50(50％抑制濃度)，即抑制50％病毒感染所需的蛋白質(zhì)濃度。這通過顯微抑制觀察來完成。HSV和FluA感染將導致細胞變成圓形，而RSV感染將引起細胞-細胞融合。
細菌誘導后首先將重組POL從包涵體中分離(圖7)。在CPE分析中研究了構(gòu)建體1、2和6來鑒別信號肽和融合蛋白質(zhì)對抗病毒方面的作用(IC50)。
如表6所示，前兩行是從植物組織中直接的POL提取物的結(jié)果。其值相對較低，這意味著對三種病毒的抗病毒活性非常高。中間的三行是三種重組POL構(gòu)建體的結(jié)果。構(gòu)建體6表現(xiàn)出相對較低的抗病毒活性，而構(gòu)建體1和2具有比構(gòu)建體6更高的活性，但仍比直接的POL提取物低一點。在最后兩行中的未過柱的pET載體對照蛋白質(zhì)，顯示了細菌背景蛋白質(zhì)對HSV和Flu A無抑制作用，但對RSV具有某種抗病毒作用。
將CPE分析總結(jié)于表6中。
表6

*IC50值小玉竹＝Polygonatum odoratum var.產(chǎn)地廣東在功能分析中，使用Vero細胞(對于HSV)、HEp2細胞(對于RSV)及MCDK細胞(對于甲型流感病毒)的CPE分析對重組POL的抗病毒活性進行測試。使用融合或非融合構(gòu)建體產(chǎn)物的提取物的連續(xù)兩倍稀釋液(1.56至500μg/ml)及等體積的病毒懸液[103TCID50/ml(50％組織細胞感染劑量每ml)]將96孔板中的四份融合細胞單層覆蓋。在感染后第3天，在倒置相差顯微鏡下進行病毒誘導的CPE評價。以病毒對照組的百分比計算試驗組病毒增殖的減少(病毒對照組的百分比＝CPE試驗組/CPE病毒對照組×100)。繪圖推算相對于病毒對照，導致試驗組病毒增殖減少50％CPE的濃度，將其定義為50％抑制濃度(IC50)。被測試的三種構(gòu)建體(1、2和6)顯示了對所有三種病毒(HSV、Flu A和RSV)的抑制活性(表6)。構(gòu)建體6是無SP的融合構(gòu)建體，其產(chǎn)物的活性與其它相比略低一點。這可能因為與等量的非融合構(gòu)建體相比，融合構(gòu)建體產(chǎn)物中存在的POL數(shù)量較少。融合構(gòu)建體中的POL量較少意味著甘露糖結(jié)合位點較少，因此抗病毒活性較低。對于非融合構(gòu)建體(1和2)，對三種病毒的抗病毒活性非常高，但IC50值仍接近粗制POL提取物的一半。
實施例8 具有生物活性的POL在主要作物中的表達I.重組的POL表達構(gòu)建體如圖8a所示，設(shè)計了三種構(gòu)建體。以谷蛋白-1啟動子啟動所有嵌合基因。將三種構(gòu)建體設(shè)計如下構(gòu)建體1)將具有信號肽序列的POL cDNA插入Gt-1啟動子與Nos終止子之間；構(gòu)建體2)蛋白質(zhì)靶向構(gòu)建體，其中將靶向序列BP-80CT和BP-80TMD插入在構(gòu)建體1)中的POL cDNA之后；以及構(gòu)建體3)谷蛋白融合構(gòu)建體，其中將POL插入在谷蛋白基本單位中間。
II.植物系統(tǒng)中重組POL的表達將圖8a中構(gòu)建的所有嵌合基因轉(zhuǎn)化入Agrobacterium EHA105。將轉(zhuǎn)化的細胞涂于具有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂平板上。從各種構(gòu)建體中選出單克隆，涂于具有50mg/L卡那霉素的另一個LB瓊脂平板上。將此平板上的單克隆用于水稻轉(zhuǎn)化。
將用于植物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基和方法，優(yōu)選在主要作物中，提供如下。將未成熟的種子(開花后10-15天)浸入50％Chlorox滅菌，振搖90分鐘。然后，將種子以滅菌水洗滌8-10次。將胚芽從未成熟的種子中切下并于N6D2培養(yǎng)基上(表7)避光生長5天。
表7顯示了用于水稻轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
表7


在28℃下，將攜帶了嵌合基因的Agrobacterium單克隆于3ml具有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時。然后，將接種物以1∶100的比例于AB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7小時。通過離心獲得細菌顆粒并將其重懸于AAM培養(yǎng)基中。將誘導的愈傷組織浸入此培養(yǎng)基中15分鐘，并在滅菌的濾紙上干燥。然后，將愈傷組織于N6D2C(表7)中避光生長3天。
然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至N6D2S(表7)避光生長2周，以選擇轉(zhuǎn)化的細胞。將選擇的愈傷組織進一步于HigrowRice medium(GIBCOBRL)上生長2周1周避光，1周16小時光照，然后8小時避光。再生前期后，于28℃通過將愈傷組織置于MSR培養(yǎng)基(表7)上光照16小時然后避光8小時誘導發(fā)芽。將再生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基MSH(表7)上，然后，將整株幼苗于溫室中生長。
轉(zhuǎn)基因POL與HPT(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)的整合為Southern分析所證實。轉(zhuǎn)基因植物包括POL或HPT基因多達3個拷貝(圖8b和圖8c)。為檢測靶蛋白質(zhì)在未成熟的水稻種子中的mRNA表達，將從各種獨立的轉(zhuǎn)基因株中收集4μg水稻種子總RNA并溶于1％瓊脂糖/甲醛凝膠。將POL cDNA作為探針進行Northern印記分析。在所有三種構(gòu)建體中檢測到未成熟水稻種子中POL的mRNA表達和融合蛋白質(zhì)(圖8a、圖8b和圖8c)。
此外，利用多克隆兔抗POL抗體對POL的表達和融合蛋白質(zhì)進行檢測，并評價了表達水平。將10μg水稻種子總蛋白質(zhì)溶于兩性離子緩沖劑SDS-PAGE作凝膠染色。將100μg溶解的水稻種子總蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，使用多克隆兔抗POL抗體檢測。為評價表達水平，將0.2μg-0.6μg純化的POL蛋白質(zhì)一起載入以作比較。在三種構(gòu)建體中，構(gòu)建體1)(圖8g)和構(gòu)建體3)(圖8h)具有比構(gòu)建體2)(圖8i)更高的POL表達水平。
III.體外重組POL的生物活性從構(gòu)建體2POL-BP-80的T1種子中提取水稻種子總蛋白質(zhì)。選擇兩種T1轉(zhuǎn)基因株B-2和B-6。提取后，將種子蛋白質(zhì)在蒸餾水中充分滲析以去除鹽和SDS。然后，將樣品凍干保存。
表8簡明地顯示了谷蛋白-1啟動子構(gòu)建體的表達水平。除非特別說明，該表中測試的所有水稻種子來自T0轉(zhuǎn)基因植物。因AB-POL構(gòu)建體的蛋白質(zhì)提取緩沖液與其它構(gòu)建體的不同，不能評價POL占總的可提取蛋白質(zhì)的百分比。
表8

還研究了轉(zhuǎn)基因水稻種子的生物活性，并證明了重組蛋白質(zhì)對三種病毒HSV-1、RSV和甲型流感病毒的有效作用，其中利用CPE分析評價不同樣品對HSV、RSV和甲型流感病毒(Flu A)的IC50。粗制玉竹蛋白質(zhì)和E.coli表達的POL的結(jié)果也被包括在內(nèi)以作比較(表9)。
表9顯示了轉(zhuǎn)基因和野生型植物蛋白質(zhì)CPE分析的結(jié)果。
表9

因此，本發(fā)明提供了一種有高生物活性的純化蛋白質(zhì)(POL)，以及POL蛋白質(zhì)的編碼基因，該基因顯示了在細菌和水稻中的高表達水平，而來自細菌和水稻的重組POL蛋白質(zhì)都證明了具有高生物活性。能經(jīng)濟地生產(chǎn)重組POL蛋白質(zhì)以制備藥物和營養(yǎng)物，并可能用于制備家禽飼料以預(yù)防禽流感。
本發(fā)明不受以上所述和實施例的限制。以示例性方式提供優(yōu)選實施方案，不應(yīng)被看作是本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明的精神下作改動和變化。本發(fā)明的范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書來定義。
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序列表<110>香港中文大學黃秀美辛世文黃榮春<120>從中藥玉竹中分離的蛋白質(zhì)(POL)及其用途<130>US Patent Application NO.11/189,342<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>483<212>DNA<213>Polygonatum odoratum<400>1atggcagcta gtaatagttc aatcctcctg atcctcatgg ccaccatcgc catctttggc 60ctcatggttg catcgccatg cgcagcggac aattctctga cctcccccaa cagcctcggc120tccggccatt ccctcgacac gggctcttac cgtgccatca tgcagggaga ctgcaactta180gtggtgtacg actcaggcaa acctgtttgg gcgtccaaca ccggcgggct cgcccgtgac240tgccgcttga cgttgcacaa caacgggaac ctcgtcatct acgataggag caaccgtgtg300atttggcaga ccaagacgaa cgggaaggag gaccactacg tgctggtgct gcagcaagac360cgcaatttgg tcatctacgg ccctgcagtc tgggccaccg gctctggacc ggccgtcgga420ctcacccttg ttccgcataa cgttactgct attgttgatg ctagagcgat gcttaatgag480tag 48權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列的同源序列的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)從玉竹中分離，抑制癌細胞或病毒的增殖。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有分子量為14kDa的亞基。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)為由兩個亞基組成的具有28kDa分子量的同源二聚體。
6.如權(quán)利要求2的所述的蛋白質(zhì)，其在Superdex 75 HR 10/30柱中具有29.02±0.74分鐘的保留時間。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，其中所述病毒選自單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒和甲型流感病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其中所述單純皰疹病毒為HSV-1或HSV-2。
9.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其中所述甲型流感病毒包括禽流感病毒(H5N1)。
10.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其中所述癌細胞包括MCF-7細胞或HL-60細胞株。
11.具有SEQ ID NO1的同源序列的核酸。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸，其具有SEQ ID NO1序列。
13.DNA構(gòu)建體，其包括具有可操作地與載體連接的SEQ ID NO1的同源序列的核酸。
14.如權(quán)利要求13所述的DNA構(gòu)建體，其中所述核酸具有SEQ IDNO1序列。
15.如權(quán)利要求14所述的DNA構(gòu)建體，其中所述載體為pET載體。
16.表達權(quán)利要求13的DNA構(gòu)建體的宿主細胞。
17.如權(quán)利要求16所述的宿主細胞，其選自細菌細胞或植物細胞。
18.如權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其中所述植物細胞為單子葉植物或雙子葉植物。
19.在宿主細胞中表達權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的方法，包括構(gòu)建構(gòu)建體，其包括可操作地與載體連接的SEQ ID NO1的同源序列的核酸；將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細胞；以及收獲和分離所述宿主細胞中所表達的蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO1序列。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述宿主細胞為細菌細胞。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述宿主細胞為植物細胞。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物細胞為單子葉植物或雙子葉植物。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述宿主細胞為植物種子。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述載體為binary載體。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述載體為pBI121載體。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述載體為pET載體。
28.從中藥玉竹中分離有生物活性的蛋白質(zhì)的方法，包括提供玉竹材料；將所述材料與NaCl溶液接觸，得上清液；向所述上清液中加入硫酸銨，得沉淀物；在蒸餾水中滲析所述沉淀物，得溶液；凍干所述溶液得粗蛋白質(zhì)；以及將所述粗蛋白質(zhì)載入瓊脂糖柱制備靶蛋白質(zhì)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述瓊脂糖柱為甘露糖-瓊脂糖柱。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述載入步驟利用含有甘露糖的pH值為6.2的Mes緩沖液完成。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述載入步驟包括將粗蛋白質(zhì)載入胎球蛋白-瓊脂糖柱，獲得第一部分；將所述第一部分載入甘露糖-瓊脂糖柱；以及洗脫胎球蛋白-瓊脂糖柱和甘露糖-瓊脂糖柱，獲得靶蛋白質(zhì)。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述將甘露糖-瓊脂糖柱的洗脫是利用pH值為6.2的含有甘露糖的Mes緩沖液完成的。
33.包括治療有效劑量的權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的藥物。
34.如權(quán)利要求33所述的藥物，其中所述蛋白質(zhì)從玉竹中分離。
35.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制癌細胞和病毒的增殖。
36.抑制癌細胞或病毒增殖的方法，包括將有效劑量的權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)與細胞或病毒接觸。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述病毒選自單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒和甲型流感病毒。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述單純皰疹病毒為HSV-1或HSV-2。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述甲型流感病毒包括禽流感病毒(H5N1)。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述癌細胞包括MCF-7細胞或HL-60細胞株。
41.轉(zhuǎn)基因植物，包括具有SEQ ID NO.1同源序列的核酸表達的蛋白質(zhì)。
42.如權(quán)利要求41所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述蛋白質(zhì)由SEQ IDNO.1表達。
43.由轉(zhuǎn)基因植物制成的功能食品，所述植物包括具有SEQ ID NO.1同源序列的核酸表達的蛋白質(zhì)。
44.如權(quán)利要求43所述的功能食品，其中所述蛋白質(zhì)由SEQ ID NO.1表達。
45.包括具有SEQ ID NO.1同源序列的核酸表達的蛋白質(zhì)的動物飼料。
46.如權(quán)利要求45所述的動物飼料，其中所述的蛋白質(zhì)由SEQ IDNO.1表達。
全文摘要
本發(fā)明闡明了從中草藥玉竹，Polygonatum odoratum(Liliaceae)中分離及公開的蛋白質(zhì)為一種有效制劑，顯示出高效的抗病毒活性，同時證明了在體外對HL－60白血病和MCF－7乳腺癌細胞株的抗增殖作用。本發(fā)明還提供了獲得該靶蛋白質(zhì)的方法及其用途。
文檔編號C12N15/09GK1974598SQ20061009952
公開日2007年6月6日 申請日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月26日
發(fā)明者黃秀美, 辛世文, 黃榮春 申請人:香港中文大學