專(zhuān)利名稱(chēng)：一種過(guò)氧化物酶的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種過(guò)氧化物酶的提取方法，尤其是涉及一種利用雙水相萃取法提取過(guò)氧化物酶的方法。
背景技術(shù)：
過(guò)氧化物酶(Peroxidase POD)是一種以血紅素為輔基的酶分子，在生物界廣泛存在，資源豐富，尤其以辣根(屬十字花科植物)、蒿等植物中含量較高。
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，POD在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、化工等領(lǐng)域中作為工具酶正在大量使用，例如在臨床生化檢驗(yàn)中用于葡萄糖、膽固醇、脂肪、尿酸、膽紅素等含量的測(cè)定；在酶標(biāo)免疫檢驗(yàn)中，作為最常用的標(biāo)記酶；在化學(xué)上業(yè)中用于橡膠成型，塑料及多泡沫性粘合劑的合成以及纖維的漂白等；在食品加工業(yè)中用于殺菌等。
目前POD的提取方法仍以經(jīng)典鹽析法為主，其工藝路線是將原料粉碎后，經(jīng)水抽提得到粗酶液；粗酶液先用0.4飽和度的(NH4)2SO4溶液除去沉淀，再用0.8飽和度的(NH4)2SO4溶液收集沉淀；沉淀物用水溶解并經(jīng)透析處理后，再用-15℃的丙酮分級(jí)分離，并透析后，得到RZ值近于1的酶液；最后用ZnSO4溶液精制純化、透析除鹽、冰凍干燥后，得到過(guò)氧化物酶純品。
雖然采用經(jīng)典鹽析法可以提取得到高純度的過(guò)氧化物酶，但是經(jīng)典鹽析法的操作工藝十分繁瑣，不僅生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、能耗高，而且過(guò)氧化物酶的收率較低，故不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)。
雙水相萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展并應(yīng)用于生物大分子制備的新技術(shù)。雙水相是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽類(lèi)溶于同一溶液，由于聚合物溶液間或聚合物與無(wú)機(jī)鹽溶液間具有不相溶性，使得當(dāng)聚合物或無(wú)機(jī)鹽的濃度達(dá)到一定值以上時(shí)，就會(huì)分成互不相溶的兩相系統(tǒng)為雙水相系統(tǒng)，一般認(rèn)為，憎水性差異是產(chǎn)生相分離的主要推動(dòng)力。雙水相萃取技術(shù)的原理是利用兩種或兩種以上的化合物所形成的互不相溶的兩種或兩種以上的液相，使目的大分子選擇性地分配于某一相而實(shí)現(xiàn)濃縮或純化的目的。因此，雙水相萃取技術(shù)具有以下一些顯著優(yōu)點(diǎn)1、屬水相操作，目的化合物傳質(zhì)速度快，所需分配平衡的時(shí)間短；2、成相化合物對(duì)生物大分子如酶的活性具穩(wěn)定作用，因而減少了生物大分子制備過(guò)程中的活性下降；3、收率較高，可以減少目的化合物的丟失；
4、成相試劑可以回收再使用；5、此技術(shù)容易工業(yè)放大。
基于上述優(yōu)點(diǎn)，雙水相萃取技術(shù)在生物大分子的提純方面具有十分重要的作用和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種過(guò)氧化物酶的雙水相萃取提取方法，利用雙水相萃取技術(shù)的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化過(guò)氧化物酶的提取工藝，提高過(guò)氧化物酶的收率。
本發(fā)明的過(guò)氧化物酶提取方法包括以下步驟粗酶液制取將富含過(guò)氧化物酶的作物粉碎后，加水抽提，過(guò)濾后得到粗酶液；一次萃取取粗酶液，加入雙水相萃取劑聚乙二醇6000和(NH4)2SO4，使聚乙二醇6000的重量百分濃度為5～8％，(NH4)2SO4的重量百分濃度為25～35％，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅o置分層，保留上相液；二次萃取上相液中加入等體積的重量百分濃度為25～35％的(NH4)2SO4溶液，再加入NaH2PO4粉末，使其重量體積濃度達(dá)到8～12g/L，充分振蕩均勻，靜置分層，保留上相液；三次萃取上相液中加水充分振搖，靜置分層，收集下相液，剩余上相液中再加入重量百分濃度為50％的NaH2PO4溶液，充分振蕩均勻后，靜置分層，收集下相液，合并兩次收集的下相液；純化將收集液離心，去除沉淀后，取上清液加入(NH4)2SO4粉末，使其重量體積濃度達(dá)到400～450g/L，攪拌均勻，于4℃靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀物，加水溶解后透析除鹽，干燥后得到過(guò)氧化物酶純品。
其中，所述的粗酶液制取具體是先將富含過(guò)氧化物酶的作物用等體積的水抽提一次，濾渣再用1/2體積的水抽提一次，合并兩次抽提液得到粗酶液。
在三次萃取中，加入NaH2PO4溶液量的具體標(biāo)準(zhǔn)是至將NaH2PO4的重量百分濃度稀釋為10％即可。
本發(fā)明的提取方法可以適合于各種富含過(guò)氧化物酶的作物，特別是辣根和蒿中過(guò)氧化物酶的提取。
采用本發(fā)明提取方法，可以提取得到RZ＝2～2.5的過(guò)氧化物酶純品。
本發(fā)明采用雙水相萃取技術(shù)提取作物中的過(guò)氧化物酶，與經(jīng)典鹽析法比較，具有操作工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)條件要求寬松，能耗小、成本低的優(yōu)點(diǎn)，提取得到的過(guò)氧化物酶純度與經(jīng)典鹽析法相當(dāng)，但收率卻可以達(dá)到經(jīng)典鹽析法的1.5倍。
具體實(shí)施例方式
取500g辣根或蒿，洗凈后切成小段，再制成碎渣，用等體積的水在低溫下間歇攪拌浸取2h，然后壓榨、抽濾，收集濾液，碎渣再用1/2體積水?dāng)嚢璩樘?h，合并兩次濾液，得到約600ml粗酶液。
取300ml粗酶液，在不斷攪拌下緩慢加入粉末狀的聚乙二醇6000和(NH4)2SO4，大約1h內(nèi)加完，使其重量百分濃度聚乙二醇6000為5～8％，(NH4)2SO4為25～35％，充分?jǐn)嚢柚寥芙夂?，室溫下靜置1h，分為上下兩相，棄去下相液，保留上相液，約得到100～120ml。
在上相液(富集聚乙烯醇6000)中再加入100ml的25～35％(NH4)2SO4溶液和2gNaH2PO4粉末，充分振蕩，室溫下靜置1h，棄去下相液，保留上相液，約得到80ml。
在上相液中加入80ml水，充分振搖，室溫下靜置1h，收集下相液，剩余上相液中再加入50％的NaH2PO4溶液，使其稀釋至10％，充分振蕩，靜置1h，收集下相液，合并兩次收集液，約70ml。
將收集液以3000rpm室溫或低溫離心10min，去除沉淀，留上清液，按450g/L加入(NH4)2SO4粉末，置于冰箱中4℃靜置過(guò)夜，次日以5000rpm低溫離心15min，收集沉淀，用少量蒸餾水溶解，裝入透析袋中透析除鹽，得到約6ml酶液，干燥后可得RZ＝2～2.5的過(guò)氧化物酶純品。
權(quán)利要求
1.一種過(guò)氧化物酶的提取方法，包括以下步驟粗酶液制取將富含過(guò)氧化物酶的作物粉碎后，加水抽提，過(guò)濾后得到粗酶液；一次萃取取粗酶液，加入雙水相萃取劑聚乙二醇6000和(NH4)2SO4，使聚乙二醇6000的重量百分濃度為5～8％，(NH4)2SO4的重量百分濃度為25～35％，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，靜置分層，保留上相液；二次萃取上相液中加入等體積的重量百分濃度為25～35％的(NH4)2SO4溶液，再加入NaH2PO4粉末，使其重量體積濃度達(dá)到8～12g/L，充分振蕩均勻，靜置分層，保留上相液；三次萃取上相液中加水充分振搖，靜置分層，收集下相液，剩余上相液中再加入重量百分濃度為50％的NaH2PO4溶液，充分振蕩均勻后，靜置分層，收集下相液，合并兩次收集的下相液；純化將收集液離心，去除沉淀后，取上清液加入(NH4)2SO4粉末，使其重量體積濃度達(dá)到400～450g/L，攪拌均勻，于4℃靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀物，加水溶解后透析除鹽，干燥后得到過(guò)氧化物酶純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶提取方法，其特征是所述的粗酶液制取具體是先將富含過(guò)氧化物酶的作物用等體積的水抽提一次，濾渣再用1/2體積的水抽提一次，合并兩次抽提液得到粗酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶提取方法，其特征是在三次萃取中，加入NaH2PO4溶液的量為將其稀釋至重量百分濃度為10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶提取方法，其特征是使用的富含過(guò)氧化物酶的作物是辣根和/或蒿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶提取方法，其特征是提取得到的過(guò)氧化物酶純品RZ＝2～2.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雙水相萃取法提取過(guò)氧化物酶的方法，是在粗酶液中加入聚乙二醇6000和(NH
文檔編號(hào)C12N9/08GK1928078SQ20061010200
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日
發(fā)明者尹兆明, 于明江, 楊勇, 段黎萍, 張繼昌 申請(qǐng)人:山西職工醫(yī)學(xué)院