專利名稱：利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種利用非人哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)重組人的抗凝血酶III的方法，具體涉及一種利用非人哺乳動物乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法。
背景技術：
抗凝血酶III(antithrombin III，簡稱AT-III)是人體血漿中的一種重要的抗凝血因子，它在血漿中承擔著60％～70％抗凝血酶活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血平衡中起著重要的作用，是正常人血漿中存在的重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其主要功能是滅活凝血酶，如與凝血酶Xa及XIa結合。并主要由肝臟合成。
人體內(nèi)與凝血系統(tǒng)功能相桔抗的是抗凝血系統(tǒng)，在正常情況下，兩者保持動態(tài)平衡。AT-III主要反映機體是抗凝系統(tǒng)的功能。AT-III的升高一般不會引起病理性后果，但是AT-III在人體中的量的減少常見于以下病例a)遺傳性抗凝血酶III缺乏；b)獲得性抗凝血酶III缺乏見于各種肝病，如肝硬化、重癥呷、肝癌晚期等；c)抗凝血酶III丟失增多如腎臟疾病；d)抗凝血酶III消耗增多如各種原因所造成的血液凝固性增高，抗凝血酶III中和活化的凝血因子，以致消耗增加。
e)最重要的是AT-III的先天性或后天獲得性缺乏癥可導致血栓的形成，而引起腦血栓或心肌梗塞等等非常嚴重的疾病。
因此，AT-III在臨床上，有預防和治療急慢性血栓血塞形成的作用，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果，目前市場有從人體血漿中提取的人抗凝血酶III蛋白，也有用細胞和酵母作為表達載體在體外生產(chǎn)的重組人抗凝血酶III。世界上第一個利用轉基因動物乳腺生物反應器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物——重組人抗凝血酶III(商品名ATryn，GTC生物治療公司，美國)于2006年6月通過歐洲醫(yī)藥評價署人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(EMEA)的上市評估，同年8月獲得歐洲委員會的上市許可，并將在不久的未來(2007年)開始在歐洲市場上銷售。這也證明利用哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)重組人抗凝血酶III(AT-III)的可行性和市場價值。
GTC生物治療公司在美國擁有幾個專利其中包括1轉基因方法生產(chǎn)人抗凝血酶III(Transgenically produced antithrombin III，專利號5,843,705和6,441,145)；2人抗凝血酶III及其相關方法(Human antithrombin IIIs and methods related thereto，專利號6,878,813)；3轉基因羊生產(chǎn)的重組人抗凝血酶III的治療(Treatments using transgenic goatproduced antithrombin III，專利號7,019,193)等。
本專利公開的一種利用非人哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)重組人的抗凝血酶III(AT-III)的方法與GTC生物治療公司的相關專利生產(chǎn)的人的抗凝血酶III的方法存在關鍵的區(qū)別
1，本專利生產(chǎn)的重組人的抗凝血酶III蛋白質只是抗凝血酶III蛋白質的成熟部分(即功能部分氨基酸33-464)，GTC生物治療公司生產(chǎn)的重組人的抗凝血酶III蛋白質有抗凝血酶III蛋白質的信號部分(氨基酸1-32)和成熟功能部分(氨基酸33-464)；2，本專利是將重組人的抗凝血酶III蛋白質表達載體首先轉入體外培養(yǎng)的山羊胎兒成纖維細胞中，然后再用體細胞核移植技術(克隆技術)獲得含有人的抗凝血酶III蛋白質基因的轉基因動物，GTC生物治療公司是將重組人的抗凝血酶III蛋白質表達載體直接注射到山羊受精卵的原核中(原核注射法)，所獲得含有人的抗凝血酶III蛋白質基因的轉基因動物；3，本專利的重組人的抗凝血酶III蛋白質表達載體，是用的乳腺蛋白質的分泌信號多肽(MKVLILACLVALAIAL)將表達的重組人的抗凝血酶III蛋白質從轉基因動物的乳腺細胞分泌到乳汁中，GTC生物治療公司是用的人的抗凝血酶III蛋白質的信號肽(分泌多肽)，實驗證明乳腺蛋白質的分泌信號多肽在乳腺細胞中的分泌能力比其它信號多肽的分泌能力強。
4，本專利所表達的蛋白質中含有一個Enterokinase蛋白質酶切序列(DDDK)，可將分泌多肽和重組人的抗凝血酶III蛋白質(功能部分)分開，增強重組人的抗凝血酶III蛋白質的活性和治療功能。
本發(fā)明專利采用體細胞核移植技術(克隆技術，Wilmut et al，1997)來獲得轉人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的動物，與原核注射法獲得的轉基因動物(GTC生物治療公司所用的方法)相比，大動物轉基因體細胞的克隆有以下的優(yōu)點獲得轉基因動物的效率高，資金投入少；更重要的是，可以首先對體外培養(yǎng)的細胞進行遺傳改造，如轉基因的整合及檢測，甚至監(jiān)測轉基因在細胞內(nèi)的表達量。
中國還沒有類似利用非人哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的專利，申請人檢索到幾個相關專利或申請從水蛭中分離抗凝血酶多肽的方法方面的專利(CN1066272和CN1452986等)，抗凝血酶-III的生產(chǎn)方法純化方法及含該酶的制劑(CN1189502)和凝血酶試劑，以及檢查試劑套裝(CN1504580)等專利。
本發(fā)明采用嶗山奶山羊為研究動物，嶗山奶山羊(Capra hircus)是我國的高產(chǎn)奶山羊之一，產(chǎn)奶量大，產(chǎn)奶期8個月以上，長者可達10個月，一胎羊平均年產(chǎn)奶310公斤，二胎羊平均年產(chǎn)奶590公斤，三胎羊平均年產(chǎn)奶700公斤以上，高者可達1300公斤，相當于1/3頭奶牛的產(chǎn)奶量，而且山羊的研究周期短，飼養(yǎng)管理費用低，是乳腺生物反應器的重要研究對象之一。
本發(fā)明的特點是用體細胞克隆和轉基因動物的方法在轉基因動物的乳腺中生產(chǎn)重組人的抗凝血酶III(AT-III)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因，與乳腺蛋白基因的啟動子和終止信號連接構建重組人的抗凝血酶III(AT-III)基因的表達載體，再通過轉染體細胞和體細胞核移植的方法，將人的抗凝血酶III(AT-III)基因轉入動物的基因組內(nèi)，而表達重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。在轉基因動物的乳汁中特異高效表達人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。然后通過蛋白質提純的方法將轉基因動物的重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白質提純，制成注射針劑，用于人的抗凝血酶III(AT-III)缺乏癥的治療。
本發(fā)明的技術解決方案是研制一種利用非人哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)人的抗凝血酶III(AT-III)的方法，包括下述步驟1.選用哺乳動物的乳蛋白基因為轉基因的調控區(qū)和表達框架，在乳蛋白基因的表達框架上建立一個唯一的酶切位點，然后將人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)，乳蛋白分泌序列和腸激酶(Enterokinase)蛋白質酶切序列基因，連接在乳蛋白基因的表達框架上，轉基因載體的末端再連接一個篩選基因。
2.所構建的載體經(jīng)DNA序列分析，確定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)和乳蛋白基因的DNA序列，并與乳蛋白基因本身的表達和功能基因的氨基酸組成一致；3.用電穿孔或脂質體誘導的方法將人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表達載體轉入體外培養(yǎng)的動物的體細胞中；4.在培養(yǎng)基中對細胞株進行篩選，獲得篩選后的陽性細胞株；一部分細胞冷凍保存，一部分細胞用于制備DNA；5.陽性細胞株的DNA，經(jīng)PCR和Southern雜交分析，確定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的細胞株；6.轉基因的細胞株的細胞移入山羊成熟的去核卵母細胞的卵周隙內(nèi)，然后使供核細胞和去核卵母細胞融合；7.將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，經(jīng)妊娠獲得轉基因克隆羊；8.檢測轉人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因動物的乳汁中的人抗凝血酶IH(AT-III)蛋白的含量和活性；9.含有人的抗凝血酶III蛋白的轉基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白的提純；10.純化的重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的動物試驗和人體試驗；11.重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白在人體上的應用。
上述的利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳動物的乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳漿蛋白基因或乳鐵蛋白基因。
上述的利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是將人的抗凝血酶III蛋白基因連接在乳蛋白基因的表達框架上，并轉入哺乳動物的基因組內(nèi)，然后在轉基因動物的乳汁中獲得特異高效表達。
上述的利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的哺乳動物包括牛、綿羊和山羊、豬、兔、馬。
一種利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，生產(chǎn)含有重組人的抗凝血酶III蛋白的轉基因動物，及其乳汁和制品。
上述的轉基因動物的乳汁進行提純得到的重組人的抗凝血酶III蛋白，在治療抗凝血酶III缺乏癥中的應用。
本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明是用體細胞核移植(克隆)技術獲得人抗凝血酶III基因的轉基因動物，比其他方法獲得轉基因動物的效率高。
本發(fā)明是從轉基因動物的乳汁中獲得重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白，提供制備重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的原料藥；從含有重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的轉基因動物的乳汁中提取、純化重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白，制成注射用針劑，經(jīng)注射到人體內(nèi)，達到治療人體抗凝血酶III(AT-III)蛋白缺乏癥的目的。


圖1是AT-III轉基因克隆技術路線示意圖；圖2-1、圖2-2、圖2-3是轉基因克隆羊的Southern分析數(shù)據(jù)示意圖；圖3是轉AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III含量分析數(shù)據(jù)示意圖；圖4是轉AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III的活性分析數(shù)據(jù)示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本申請的技術方案作進一步闡述。
圖1中，顯示AT-III轉基因克隆技術路線示意圖。
分為11個步驟第1步構建奶山羊基因組文庫；第2步用綿羊的部分酪蛋白基因探針獲得奶山羊β-酪蛋白基因；第3步去除部分外顯子2與7之間的奶山羊β-酪蛋白基因序列，建立乳蛋白分泌序列，唯一的Not1和Xho1酶切位點；圖中， 代表乳蛋白分泌序列第4步人的抗凝血酶III蛋白基因和Enterokinase蛋白質酶切序列的PCR。
人肝細胞mRNA的獲得，轉錄成cDNA，PCR反映獲得全部的ATIII基因編碼序列，序列分析。再用PCR反映獲得AIII基因的成熟部分DNA和乳蛋白分泌序和Enterokinase蛋白質酶切序列。
圖中， 代表酶切序列； 代表AT-III功能部分；第5步ATIII轉基因表達載體的構建；第6步新酶素基因(Neomycin)的連接；第7步體外細胞培養(yǎng)和轉化；第8步ATIII轉基因體細胞的克??；第9步克隆羊的繁殖和轉基因檢測；第10步奶中ATIII蛋白質的檢測和提純；第11步重組人的抗凝血酶III蛋白的在治療抗凝血酶III缺乏癥中的應用。
圖2中，顯示轉基因克隆羊的Southern分析數(shù)據(jù)圖2-1左側顯示的小羊(箭頭所指)是所獲得的第一只ATIII轉基因克隆，在出生后78天死亡；右側顯示克隆小羊羔DNA(1號)和供核細胞DNA(2號)的Southern雜交圖；圖2-2為轉AT-III基因的克隆羊群；圖2-3為ATIII轉基因的PCR結果圖1，2，5是寄母羊；3，4，6和7轉抗凝血酶III基因的克隆羊，8是空白對照，MW是DNA分子量。
圖3中，1.AT-HI標準品(30ug)；2.AT-IH標準品(10ug)；3.正常羊奶樣(1∶5稀釋，1ul)；4.正常羊奶樣(1∶5稀釋，3ul)；5.正常羊奶樣(1∶6稀釋，6.5ul)；6.編號A-08轉AT-III克隆后代(編號A-25)奶樣(1∶5稀釋，1ul)；7.編號A-08轉AT-III克隆后代(編號A-25)奶樣(1∶5稀釋，3ul)；8.編號A-08轉AT-III克隆后代(編號A-25)奶樣(1∶5稀釋，6.5ul)；9.編號A-05轉AT-III克隆后代(編號A-23)奶樣(1∶5稀釋，1ul)；10.編號A-05轉AT-III克隆后代(編號A-23)奶樣(1∶5稀釋，3ul)；11.編號A-05轉AT-III克隆后代(編號A-23)奶樣(1∶5稀釋，6.5ul)；12.蛋白質分子量標準(Bio-rad，貨號161-0373)；箭頭是指重組人的抗凝血酶III蛋白帶。
人血漿中的抗凝血酶III是一個432個氨基酸的糖蛋白(成熟功能部分)，分子量為58kDa(沒有糖基化的成熟AT-III的分子量為49.0kDa)。本哺乳動物乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人的抗凝血酶III(AT-III)也是糖蛋白，分子量大約為60kDa(沒有糖基化的重組人的抗凝血酶III(AT-III)的分子量為51.4kDa)。
圖4中，奶樣品經(jīng)過離心脫脂處理，然后用于Elisa試驗。采用US Biological公司(美國)的AT-III檢測試劑。經(jīng)過計算，編號A-23號羊奶中的AT-III蛋白為0.2-0.5ug/ml；編號A-25號羊奶中的AT-III蛋白為1-3mg/ml。
本發(fā)明包括下列步驟(1).選用哺乳動物的乳蛋白基因為轉基因的調控區(qū)和表達框架，在乳蛋白基因的表達框架上建立一個唯一的酶切位點和乳蛋白分泌序列。
(2)從人肝細胞cDNA，用PCR擴增的方法，獲得人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)的DNA片斷(參見附圖1的第4步)(3)然后將人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和Enterokinase蛋白酶切序列基因連接在乳蛋白基因的表達框架上，轉基因載體的末端再連接一個篩選基因。
(4).所構建的載體經(jīng)DNA序列分析，確定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和乳蛋白基因的DNA序列，并與乳蛋白基因本身的表達和功能基因的氨基酸組成一致(參見重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的氨基酸序列)。
(5).用電穿孔或脂質體誘導的方法將人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表達載體轉入動物的體細胞中。
(6).在培養(yǎng)基中對細胞株進行篩選，獲得篩選后的陽性細胞株；一部分細胞冷凍保存，一部分細胞用于制備DNA。
(7).陽性細胞株的DNA，經(jīng)PCR和Southern雜交分析，確定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的細胞株。
(8).轉基因的細胞移入山羊的成熟去核卵母細胞的卵周隙內(nèi)，然后使供核細胞和去核卵母細胞融合，激活；(9).將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，通過妊娠獲得轉基因克隆羊；(10).檢測轉人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的含量和活性。
(11).含有重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的乳汁中的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的提純(使用蛋白質親和，濃縮，過柱等方法)。
(12).純化的重組人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的動物試驗和人體試驗。
(13).重組人的抗凝血酶III蛋白在人體上的應用。
實施例1本實施例以嶗山奶山羊(Capra hircus)為例，用人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因構建了以山羊酪蛋白基因(β-casein)為框架的轉基因載體，并最終獲得以人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因為功能基因的嶗山奶山羊乳腺生物反應器。
具體操作程序如下功能基因的獲得人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因是用人的肝細胞cDNA為PCR底物，然后通過PCR擴增的方法建立兩端的連接酶切位點，PCR產(chǎn)物連接在pUC19上，在進行DNA序列分析；克隆的AT-III基因的DNA序列與已公開的AT-III蛋白基因的DNA序列相同。
具體方法是人的抗凝血酶III(AT-III)基因的制備是根據(jù)已公開的AT-III的DNA順序(GeneBankD29832和X68793)，設計PCR引物，獲得1.45KB的AT-III基因的編碼序列，PCR產(chǎn)物克隆到pUC19載體上，進行順序分析。再將DNA順序分析正確的AT-III pUC19質粒進行PCR克隆去除AT-III的分泌信號肽部分(堿基序列1-96)，并在引物前加入1個唯一的酶切位點(Xho1)，再通過PCR反應在AT-II基因前加一個Enterokinase蛋白質酶切序列。AT-III的基因片段連接到奶山羊β-酪蛋白基因DNA載體的表達框架上。
轉基因載體的構建用綿羊的β-酪蛋白基因的一片斷為探針，從嶗山奶山羊的基因組文庫中分離出β-酪蛋白基因，并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的部分第二外顯子與第七外顯子及其之間的DNA序列，建立一個唯一的Not1酶酶切位點，再合成一段含有Xho1酶酶切位點的乳蛋白分泌序列連接在Not1位點。然后將人的抗凝血酶III(AT-III)基因連接在β-酪蛋白基因的表達框架上，篩選基因連接在β-酪蛋白基因的P(A)后面，操作步驟見附圖1。
轉化受體細胞從30至45天胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，分離的細胞培養(yǎng)在DMEM-F12(1∶1)并添加10％胎牛血清(FCS)和抗菌素的培養(yǎng)基中。用電穿孔(Bio-rad)或脂質體介導法將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中，(Gene Targeting-APractical Approach，2ndEdition，Oxford University Press 1999)然后在含有G418(600ug/ml)的培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)大約15-20天；細胞株再進行擴繁，一部分細胞冷凍保存.一部分用于制備DNA。
陽性細胞株的細胞核移植山羊經(jīng)同期發(fā)情和超排處理，獲得體內(nèi)成熟的卵母細胞和寄母羊。陽性細胞在體外饑餓2-5天后，移入去核卵母細胞的卵周隙內(nèi)，用電刺激的方法將供核細胞與去核卵母細胞融合，體外培養(yǎng)4小時后，用離子霉素(Ionomycin)激活5分鐘，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5小時。最后，克隆胚胎移入正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二天，移入寄母羊輸卵管中。寄母羊懷孕，產(chǎn)出克隆母羊羔，Southern和PCR分析表明(參見附圖2)，克隆羊都含有轉人的抗凝血酶III(AT-III)基因。到目前為止，兩只克隆羊的后代母羊已產(chǎn)奶，奶中已檢測出含有大量的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白質，用于提純和臨床試驗(正在進行中)。
DNA的制備，Southern分析將培養(yǎng)的細胞和少量克隆羊的組織轉入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中，在55℃水浴鍋中過夜，然后加入兩倍的純酒精，混勻，離心；用70％的酒精洗DNA一次，自然干燥，然后加入適量的TRIS-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃的冰箱中。用Pst1酶消化DNA溶液過夜，在0.8％的凝膠上電泳，然后將DNA轉入纖維膜中，分別用P32標記探針進行雜交。獲得DNA的Southern圖片。
AT-III的含量和活性檢測AT-III的含量檢測是將轉有人的抗凝血酶III(AT-III)基因的羊的奶，離心脫脂，用0.5MEDTA稀釋溶解酪蛋白質顆粒，蛋白質凝膠跑膠(Invitrogen)，然后用Coomassie藍染色。與空白對照(羊奶)和陽性對照比較，獲得奶中AT-III蛋白質的分子量和蛋白質含量。
AT-III的活性檢測是用酶聯(lián)(Elisa)的方法。用US Biological(美國)公司的檢測人的抗凝血酶III蛋白試劑，進行檢測。
重組人的抗凝血酶III(AT-III)的氨基酸序列 MKVLILACLV ALAIALEDDD DKHGSPVDIC TAKPRDIPMN PMCIYRSPEK KATEDEGSEQKIPEATNRRV WELSKANSRF ATTFYQHLAD SKNDNDNIFL SPLSISTAFA MTKLGACNDTLQQLMEVFKF DTISEKTSDQ IHFFFAKLNC RLYRKANKSS KLVSANRLFG DKSLTFNETYQDISELVYGA KLQPLDFKEN AEQSRAAINK WVSNKTEGRI TDVIPSEAIN ELTVLVLVNTIYFKGLWKSK FSPENTRKEL FYKADGESCS ASMMYQEGKF RYRRVAEGTQ VLELPFKGDDITMVLILPKP EKSLAKVEKE LTPEVLQEWL DELEEMMLVV HMPRFRIEDG FSLKEQLQDMGLVDLFSPEK SKLPGIVAEG RDDLYVSDAF HKAFLEVNEE GSEAAASTAV VIAGRSLNPNRVTFKANRPF LVFIREVPLN TIIFMGRVANPCVK
利用哺乳動物乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III(AT-III)的方法的DNA序列表<110>青島森淼生物技術研究所<120>利用哺乳動物乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III(AT-III)的方法<130>
<140>
<141>
<160>11<170>Patent version 3.3<210>1<211>3866<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3866)<223>奶山羊β-酪蛋白的啟動區(qū)和第1外顯子和內(nèi)含子和部分，基因打靶載體的5’同源臂<400>11 GGTACCTGAT GTCATCTTAA ATTGCTGGCT TTTTGATTTT CCATTGGACA 50AGCTTCTTTC TTTAGTATAT TGTTAAGGAT TTCCTTGATC AAGATTTTAC 100CTACTTTTCT GGTCCAATTG GTGAGAGACA GTCATAAGGA AATGCTGTGT 150TTATTGCACA ATATGTAAAG CATCTTCCTG AGAAAATAAA AGGGAAATGT 2005 TGAATGGGAA GGATATGCTT TCTTTTGTAT TCCTTTTCTG AGAAATCAGA 250CTTTTTCACC TGTGGCCTTG GCCACCAAAA GCTAACAAAT AAAGGCATAT 300GAAGTAGCCA AGGCCTTTTC TAGTTATATC TATGACACTG AGTTCATTTC 350ATCATTTATT TTCCTGACTT CCTCCTGGGT CCATATGAGC AGTCTTAGAA 400TGAATATTAG CTGAATAATC CAAATACATA GTAGATGTTG ATTTGGGTTT 45010 TCTAAGCAAT CCAAGACTTG TATGACAGTA AGATGTATTA CCATCCAACA 500CACATCTCAG CATGATATAA ATGCAAGGTA TATTGTGAAG AAAAATTTTT 550AATTATGTCA AAGTGCTTAC TTTAGAAGGT CATCTATCTG TCCCAAAGCT 600GTGAATATAT ATATTGAAGG TAATGAATAG ATGAAGCTAA CCTTGTAAAA 650ATGAGTAGTG TGAAATACAA CTACAATTAT GAACATCTGT CACTAAAGAG 70015 GCAAAGAAAC TTGAAGATTG CTTTTGCAAA TGGGCTCCTA TTAATAAAAA 750GTACTTTTGA GGTCTGGCTC AGACTCTATT GTAGTACTTA GGGTAAGACC 800
CTCCTCCTGT ATGGGCTTTC ATTTTCTTTC TTGCTTCCCT CATTTGCCCT 850TCCATGAATA CTAGCTGATA AACATTGACT ATAAAAGATA TGAGGCCAAA 900CTTGAGCTGT CCCATTTTAA TAAATCTGTA TAAATAATAT TTGTTCTACA 95020 AAAGTATTAT CTAAATAAAT GTTACTTTCT GTCTTAAAAT CCCTCAACAA 1000ATCCCCACTA TCTAGAGAAT AAGATTGACA TTCCCTGGAA TCACAGCATG 1050CTTTGTCTGC CATTATCTGA CCCCTTTCTC TTTCTCTCTT CTCACCTCCA 1100TCTACTCCTT TTTCCTTGCA ATTCATGACC CAGATTCACT GTTTGATTTG 1150GCTTGCATGT GTGTGTGCTG AGTTGCGTCT GACTGTTATC AACCCCATGA 120025 ATGATAGTCC ACCAGGCTCT ACTGTCCATG AAATTTTCCA GTCAAGAATA 1250CTGGAGTGGA TTGCATTTCC TACTCCATTT GATTAATTTA GTGACTTTTA 1300AATTTCTTTT TCCATATTCG GGAGCCTATT CTTCCTTTTT AGTCTATACT 1350CTCTTCACTC TTCAGGTCTA AGGTATCATC GTGTGCTTGT TAGCTTGTTA 1400CTTTCTCCAT TATAGCTTAA GCACTAACAA CTGTTCAGGT TGGCATGAAA 145030 TTGTGTTCTT TGTGTGGCCT GTATATTTCT GTTGTGTATT AGAATTTACC 1500CCAAGATCTC AAAGACCCAC TGAATACTAA AGAGACCTCA TTGTGGTTAC 1550AATAATTTGG GGACTGGGCC AAAACTTCCG TGCATCCCAG CCAAGATCTG 1600TAGCTACTGG ACAATTTCAT TTCCTTTATC AGATTGTGAG TTATTCCTGT 1650TGAAATGCTC CCCAGAATTT CTGGGGACAG AAAAATAGGA AGAATTCATT 170035 TCCTAATCAT GCAGATTTCT AGGAATTCAA ATCCACTATT GGTTTTATTT 1750CAAACCACAA AATTAGCATG CCATTAAATA CTATATATAA ACAGCCACTA 1800AATCAGATCA TTATCCATTC AGCTTCTCCT TCACTTCTTC TCCTCTACTT 1850TGGAAAAAAG GTAAGAATCT CAGATATAAT TTCAGTGTAT CTGCTACTCA 1900TCTTTATTTT GGACTAGGTT AAAATGTAGA AAGAACATAA TTGCTTAAAA 195040 TAGATCTTAA AAATAAGGGT GTTTAAGATA AGGTTTACAC TATTTTCAGC 2000AGATATGTTA AAAAATAGAA GTGACTATAA AGACTTGATA AAAATTATAG 2050TGACTGCAAA TGTTTTAGGA ATATAATAAG ATATAATAAC AGTGGTTGCT 2100ATTTTCTTTA GCACAAGACT AGTCAACAGG CTGTATTAAA AGATCTTTTC 2150TTGAATTAAA TATTTTCAAT TTGATTAAAC CTACCTCAGC CATAAAGGCA 220045 AGCACATTTC ATTTATACTA TGGGGATTTG AATAATTATT ACTGAAGAAG 2250CTCTACCAAC AAAAAGTTTA TAGAGCTATC ATATTTAGTC AAGAGATAAA 2300GAGGGTTGTT AGGATATATA TGCTATTTGA AAGGTATTTA TAAAAGAAGA 2350GTATATTTAT CAAAATTTCT CAGAACATCC AAATTTCAAG TTTATCATTT 2400ATCTTACAAT ATTTCAAAAA TATTAAAATA GATACATGAA ATACAGAAGT 245050 AAATTAAAGA GAAAGTATTT TACTTGGTAA AAAAATTCTA GGTTGGACAG 2500AGAGTGCCAG GAAACAAAAA CAATGAAAAA TGTGACCTGA CTGGAATTAT 2550AGCTCAAAGT ATAGTAGTAA GTAATGAAAT GGCTTAAAAA TTGGTATATA 2600AAATGCTAGT TATAAAATAA ACAAAATGCA ATAATATCCT CCCTACATGT 2650AATGAATTCT AGGTATTATG CTCTTTTTTG AAGTCTTGAC AATAAAAATT 2700
55 TTTTTAGAAG TTTATAGGCA TCTTGAATAA AGTGAAACAA ATTAAGAATT 2750AGTATCCATG AGAAAAATAT AGAACAATTT TCCTAATTTA GTTTGAAAAT 2800CTGGGATTGA AGATGTGTGT CAAGAGATGT TGGTGGCAAG AACATTTTTT 2850TTTCAAGAAC TTATAAAAAT GCAACAAAAC AAACCATTTA ATACATTTTG 2900GTCAAAATCA ATAATGTATT TTATTTTATG CTCCAAGGAG CATAAAATTG 295060 GGGACTGGGC AAGAGAAACT GACACCCTGG TAAATTACCA AGAGATAAGT 3000ACACAGTTCT ATGTAGAGAA AATAAGCATA GTGTATGATC TCTAAAATTA 3050TGTGAGACAA AGGAGAGATG ACATTAGGCA TGTGGGGATG AAGACTGAGT 3100AGAGAAGAAA CAATCTAATC AGTCCAAGAA AACATCTCGA TCAGTGGAAC 3150AAATAGAAGA AATGCTAAAA TGAAACAGAA GTCTTACTGG AAATAAAAGA 320065 TATGCATAAG ACAAAAATTC ATGAAAATCA CTTAGTTTAG CAGAGAAAAG 3250ATAAAAATAA AGTATGACCT TCTTCATATA CATTGTTTGA TCATATGCAC 3300CTCAATAAAA CTGAGTCTCC AACAGAAATG AAACATTAAT ATTTTGTTCA 3350CTGCTCTAAT CCCAGAATCT AAGCGATATC TGGCAATAAA AATAATAAAT 3400ATATATTTTT TAATAAATGA ATCAACCACT TAATTTTTCT GTAAATATCT 345070 GTAACTTCTC TTCTGTCTTT CCAAAAACAC TCATAAGTAC TGTGAATGAG 3500ATGAAAAAGA GTGAAGTAGG ATATAGGCTG TTAGCAGAAA ACATCTGAAT 3550GGCTGGCAGT GAAACATTAA CTTGAAATGT AAGATTAATG AGTAATAGTA 3600AATTTTAACC TTGGCCATAT GATAAAATGT TCATTAATAT TTTTCTAGAA 3650TACAGGGCTT TTTGTTTTTG CCATGAGGTT TGCAGGATCT TGGTTCCCTG 370075 ACCAGGGATC AAACCTGCAC TCCCCTGGAA GCATGGAGTC TTGGACATCT 3750GTATTATACA CTATCTTTGG TTCCTTTTAA AGGGAAGTAA TTTTACTTAA 3800ATAAGAAAAT AGATTGACAA GTAATACGCT GTTTCCTCAT CTTCCCATTC 3850ACAGGAATCG AGAGCC 3866<210>2<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>Not1位點<400>21 GCGGCCGCC 9
<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>蛋白質分泌序列<400>31 ATGAAGGTCC TCATCCTTGC CTGTCTGGTG GCTCTGGCCA TTGCA 45<210>4<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Xho1位點<400>41 CTCGAG 6<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>Enterokinase蛋白酶切位點<400>5
1 GACGACGACG ACAAG15<210>6<211>1299<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1299)<223>人的抗凝血酶III(AT-III)基因序列(功能部分)<400>61 CACGGGAGCC CTGTGGACAT CTGCACAGCC AAGCCGCGGG ACATTCCCAT 50GAATCCCATG TGCATTTACC GCTCCCCGGA GAAGAAGGCA ACTGAGGATG 100AGGGCTCAGA ACAGAAGATC CCGGAGGCCA CCAACCGGCG TGTCTGGGAA 150CTGTCCAAGG CCAATTCCCG CTTTGCTACC ACTTTCTATC AGCACCTGGC 2005 AGATTCCAAG AATGACAATG ATAACATTTT CCTGTCACCC CTGAGTATCT 250CCACGGCTTT TGCTATGACC AAGCTTGGTG CCTGTAATGA CACCCTCCAG 300CAACTGATGG AGGTATTTAA GTTTGACACC ATATCTGAGA AAACATCTGA 350TCAGATCCAC TTCTTCTTTG CCAAACTGAA CTGCCGACTC TATCGAAAAG 400CCAACAAATC CTCCAAGTTA GTATCAGCCA ATCGCCTTTT TGGAGACAAA 45010 TCCCTTACCT TCAATGAGAC CTACCAGGAC ATCAGTGAGT TGGTATATGG 500AGCCAAGCTC CAGCCCCTGG ACTTCAAGGA AAATGCAGAG CAATCCAGAG 550CGGCCATCAA CAAATGGGTG TCCAATAAGA CCGAAGGCCG AATCACCGAT 600GTCATTCCCT CGGAAGCCAT CAATGAGCTC ACTGTTCTGG TGCTGGTTAA 650CACCATTTAC TTCAAGGGCC TGTGGAAGTC AAAGTTCAGC CCTGAGAACA 70015 CAAGGAAGGA ACTGTTCTAC AAGGCTGATG GAGAGTCGTG TTCAGCATCT 750ATGATGTACC AGGAAGGCAA GTTCCGTTAT CGGCGCGTGG CTGAAGGCAC 800CCAGGTGCTT GAGTTGCCCT TCAAAGGTGA TGACATCACC ATGGTCCTCA 850TCTTGCCCAA GCCTGAGAAG AGCCTGGCCA AGGTAGAGAA GGAACTCACC 900CCAGAGGTGC TGCAAGAGTG GCTGGATGAA TTGGAGGAGA TGATGCTGGT 95020 GGTCCACATG CCCCGCTTCC GCATTGAGGA CGGCTTCAGT TTGAAGGAGC 1000AGCTGCAAGA CATGGGCCTT GTCGATCTGT TCAGCCCTGA AAAGTCCAAA 1050CTCCCAGGTA TTGTTGCAGA AGGCCGAGAT GACCTCTATG TCTCAGATGC 1100ATTCCATAAG GCATTTCTTG AGGTAAATGA AGAAGGCAGT GAAGCAGCTG 1150
CAAGTACCGC TGTTGTGATT GCTGGCCGTT CGCTAAACCC CAACAGGGTG 120025 ACTTTCAAGG CCAACAGGCC TTTCCTGGTT TTTATAAGAG AAGTTCCTCT 1250GAACACTATT ATCTTCATGG GCAGAGTAGC CAACCCTTGT GTTAAGTAA 1299<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>連接序列<400>71 ACCCTAATAA AACCA15<210>8<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Taq1位點<400>81 CTCGAC 6<210>9<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)
<223>Xho1位點<400>91 CTCGAG 6<210>10<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>Not1位點<400>101 GCGGCCGCC 9<210>11<211>2233<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2233)<223>奶山羊β-酪蛋白的部分第7外顯子至第9外顯子基因序列。，基因打靶載體的3’同源臂<400>111 ATCCCTTCAC TGGGCCCATC CCTAACAGCC TCCCACAAAA CATCCTGCCT 50CTTACTCAAA CCCCTGTGGT GGTGCCGCCT TTCCTTCAGC CTGAAATAAT 100GGGAGTCCCC AAAGTGAAGG AGACTATGGT TCCTAAGCAC AAAGAAATGC 150CCTTCCCTAA ATATCCAGTT GAGCCCTTTA CTGAAAGCCA GAGCCTGACT 2005 CTCACTGATG TTGAAAAGCT GCACCTTCCT CTGCCTCTGG TCCAGTCTTG 250GATGCACCAG CCTCCCCAGC CTCTTTCTCC AACCGTCATG TTTCCTCCTC 300AGTCCGTGCT GTCCCTTTCT CAGCCCAAAG TTCTGCCTGT TCCCCAGAAA 350GTAGTGCCCC AGAGAGATAT GCCCATCCAG GCCTTTCTGC TGTACCAGGA 400
GCCTGTACTT GGTCCTGTCC GGGGACCCTT CCCTATTCTT GTAAGTCTAA 45010 ATTTACTAAC TGTGCTGTTT AACTTCTGAT GTTTGTATGA TATTTGAGTA 500ATTAAGAGCC CTACAAAAAA TCAATAATGA ATGGTTCCAA AATAAGCATA 550GCTGAGATTA ATGATTCTCA GCATTGGTTA TAAATAGAAT AAGCTGGAAA 600ACCTTCACCT CCCCTCCACC ACCAGATCTC AATGTCTAGG CTTACCCATG 650GAGATTCTGA TTAACTGTTC TTTCTATGTA GAAGAAACTT ATTGGGAAGA 70015 AATAATATAA TGGACTATGA TTTAATTGGT CTGTTGAGAA TTTAGATGAA 750GGGGATTAAG TTACAATAAA GCCAGAATTG AACTTGATAA TCTCACTTGG 800CTAAGAATAA CAAACCTAAG AAGGTTTGCT ATTTTCTACA ATTTTGAAGT 850TTTCCTTATG CACAATTATT TCACCACATG ACTCATTTCA CCTCTTGTTT 900TTGATATATG AGCATATGAG GGCAAAATAC TGAAGATGCT TATTTCAATA 95020 CTCAGGGAAA ATTTTCTTGC CAAAAGGCAA GAATTGTATA ATTCATTCAC 1000TTATTTTATT TTTTTAATTT TTAAGGTCTA AGAGGATTTC AAAGTGAATG 1050CCCCCTCCTC ACTTTTGGTA AGCTTTAGGA GATTGGAGGC AGACTGATCA 1100TTTTTATAGT TAATATCTTT TACATTTCAT CTTCCTGGAT AAGCCCCAAT 1150AGTAGCAATT TCTATCAGTA TACCAGCGTA AAGATTAGTT TTAAATATAT 120025 TTTCAGTGAT TGACTGTTAT TTACTGACCT GAAATTATGT ATCTGTTATA 1250TTTCAAATAA TGCAAAACTG TATATATATG GTGTTGACAG ATTTGATTGG 1300TTTTCTTTCA ATTGCCTATA TCCTTATTAT TGATTGTAAT CATTTATAGA 1350AAAAACAAAA TAATTTCTTA TACTTTTATG TAAACCTGTT AGAGCTTATT 1400TTAAAGATCA ACTGCATTCA CATTTCTAAT CTAGTCATTA TGAGCTTCAA 145030 TTGTTTTATC TCACTTAAAA TTTATATATT GTCTTTTAAT TCATGAGTCA 1500AAATACAATC TCACAGTCCA GATATGGGAC TTAAAAGGGG AATAGCATAT 1550AGTTTTGATA TTCTTAAAGA AATACATCTT TTTGTGATCA TGATTCAGCA 1600GACATTTTAA TAAAACAATT CCAAGTGAGC CGACACTTGG TCCTAGAGGA 1650ATTTTTATAA TCTTAAGGTA AGGCACAGCA TGGTGTTTTT GTAATAAGAT 170035 TTCTTTTATG AAAAAGTCAC ACCAAAATTG GAAATGGGGT GAGATGAAGA 1750GTTATAACAT ATAACTAAAT GGACATTTGT TCTCTATTCC ACAGAATTGA 1800CTGCGACTGG AAATATGGCA ACTTTTCAAT CCTTGCATCA TGCTACTAAG 1850ATAATTTTTA AATGAGTATA CATGGAACAA AAAATGAAAC TTTATTCCTT 1900TATTTATTTT ATGCTTTTTC ATCTTAATTT GAATTTGAGT CATAAACCAT 195040 ATACTTTCAA AATGTTAATT CAACATTAGC ATAAAAGTTC AATTTTAACT 2000TGGAAATATC ATGAACATAT CAAATTATGT ATAAAAATAA TTTCTGGAAT 2050TGTGATTATT ATTTCTTTAA GAATCTATTT CCTAACCAGT CATTTCAATA 2100AATTAACCCT TAGGCATATT TAAGTTTTCT TGTCTTTATT ATATTTTTAA 2150AAATGAAATT GGTCTCTTTA TTGTTAACTT AAATTTATCT TTGATGTTAA 2200AAATAGCTGT GGAAAATTAA AATTGGATAG AAT 2233
<210>12<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Sma1位點<400>121 CCCGGG 6<210>11<211>1104<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1104)<223>Neo基因序列<400>111 ATCCGAACAA ACGACCCAAC ACCCGTGCGT TTTATTCTGT CTTTTTATTG 50CCGATCCCCT CAGAAGAACT CGTCAAGAAG GCGATAGAAG GCGATGCGCT 100GCGAATCGGG AGCGGCGATA CCGTAAAGCA CGAGGAAGCG GTCAGCCCAT 150TCGCCGCCAA GCTCTTCAGC AATATCACGG GTAGCCAACG CTATGTCCTG 2005 ATAGCGGTCC GCCACACCCA GCCGGCCACA GTCGATGAAT CCAGAAAAGC 250GGCCATTTTC CACCATGATA TTCGGCAAGC AGGCATCGCC ATGGGTCACG 300ACGAGATCCT CGCCGTCGGG CATGCGCGCC TTGAGCCTGG CGAACAGTTC 350GGCTGGCGCG AGCCCCTGAT GCTCTTCGTC CAGATCATCC TGATCGACAA 400GACCGGCTTC CATCCGAGTA CGTGCTCGCT CGATGCGATG TTTCGCTTGG 45010 TGGTCGAATG GGCAGGTAGC CGGATCAAGC GTATGCAGCC GCCGCATTGC 500ATCAGCCATG ATGGATACTT TCTCGGCAGG AGCAAGGTGA GATGACAGGA 550GATCCTGCCC CGGCACTTCG CCCAATAGCA GCCAGTCCCT TCCCGCTTCA 600GTGACAACGT CGAGCACAGC TGCGCAAGGA ACGCCCGTCG TGGCCAGCCA 650
CGATAGCCGC GCTGCCTCGT CCTGCAGTTC ATTCAGGGCA CCGGACAGGT 70015 CGGTCTTGAC AAAAAGAACC GGGCGCCCCT GCGCTGACAG CCGGAACACG 750GCGGCATCAG AGCAGCCGAT TGTCTGTTGT GCCCAGTCAT AGCCGAATAG 800CCTCTCCACC CAAGCGGCCG GAGAACCTGC GTGCAATCCA TCTTGTTCAA 850TGGCCGATCC CATATTGGCT GCAGGGTCGC TCGGTGTTCG AGGCCACACG 900CGTCACCTTA ATATGCGAAG TGGACCTGGG ACCGCGCCGC CCCGACTGCA 95020 TCTGCGTGTT CGAATTCGCC AATGAAACCA CACTGCTCGA CATTGGGTGG 1000AAACATTCCA GGCCTGGGTG GAGAGGCTTT TTGCTTCCTC TTGCAAAACC 1050ACACTGCTCG AGGAATTCAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 1100ATGC 110權利要求
1.一種利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是該方法包括下述步驟(1)選用哺乳動物的乳蛋白基因為轉基因的調控區(qū)和表達框架，在乳蛋白基因的表達框架上建立唯一的酶切位點和乳蛋白分泌序列，然后將重組人的抗凝血酶III蛋白基因和腸激酶蛋白質酶切序列連接在乳蛋白基因的表達框架上，轉基因載體的末端再連接一個篩選基因；(2)所構建的載體經(jīng)DNA序列分析，確定人的抗凝血酶III蛋白基因與乳蛋白基因的DNA序列，并與乳蛋白基因本身的表達和功能基因的氨基酸組成一致；(3)用電穿孔或脂質體誘導的方法，將人的抗凝血酶III蛋白基因表達載體，轉入體外培養(yǎng)的動物的體細胞中；(4)在培養(yǎng)基中對細胞株進行篩選，獲得篩選后的陽性細胞株；一部分細胞冷凍保存，一部分細胞用于制備DNA；(5)陽性細胞株的DNA，經(jīng)PCR和Southern雜交分析，確定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的細胞株；(6)轉基因的細胞株的細胞移入山羊成熟的去核卵母細胞的卵周隙內(nèi)，然后使供核細胞和去核卵母細胞融合；(7)將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，經(jīng)妊娠獲得轉基因克隆羊；(8)檢測轉人的抗凝血酶III蛋白基因的轉基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白含量；(9)含有人的抗凝血酶III蛋白的轉基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白的提純；(10)純化的重組人的抗凝血酶III蛋白的動物試驗；(11)重組人的抗凝血酶III蛋白在人體上的應用。
2.按照權利要求1所述的利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳動物的乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳漿蛋白基因或乳鐵蛋白基因。
3.按照權利要求1所述的利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是將人的抗凝血酶III蛋白基因連接在乳蛋白基因的表達框架上，并轉入哺乳動物的基因組內(nèi)，然后在轉基因動物的乳汁中獲得特異高效表達。
4.按照權利要求1所述的利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的哺乳動物包括牛、綿羊和山羊、豬、兔、馬。
5.一種利用乳腺生物反應器制備重組人的的抗凝血酶III蛋白的方法，生產(chǎn)含有重組人的抗凝血酶III蛋白的轉基因動物，及其乳汁和制品。
6.按照權利要求5所述的轉基因動物的乳汁進行提純得到的重組人的抗凝血酶III蛋白，在治療抗凝血酶III缺乏癥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括選哺乳動物的乳蛋白基因為轉基因的調控區(qū)和表達框架，在框架上建立一個唯一的酶切位點，再將人AT－III蛋白基因功能部分，乳蛋白分泌序列和腸激酶蛋白質酶切序列基因，連接在表達框架上，載體的末端再連接一個篩選基因；將表達載體轉入體外培養(yǎng)的動物體細胞中；獲得含有人的AT－III蛋白基因的細胞株；轉基因細胞株移入山羊成熟的去核卵母細胞內(nèi)，使供核細胞和去核卵母細胞融合；克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，經(jīng)妊娠獲得轉基因克隆羊；檢測轉基因動物乳汁中的人AT－III蛋白的含量和活性、提純；經(jīng)動物試驗和人體試驗；重組人AT－III蛋白在人體上的應用。
文檔編號C12N15/06GK1944645SQ20061010204
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月17日 優(yōu)先權日2006年10月17日
發(fā)明者袁三平, 鄒賢剛, 鮮建 申請人:青島森淼生物技術研究所