專利名稱：：螺內酰胺類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用曲霉B-F-2(Aspe^Z^sp.B-F-2)(該菌株已于2005年12月16日保藏在武漢中國菌種保藏中心，保藏編號是:CCTCCM205148)制備新螺內酰胺類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
：螺內酰胺類化合物已有一些文獻報道，該類化合物顯示了多種生物活性，如細胞分化誘導齊U(Komagata,D.;Fujita,S.;Yamashita，N.;Saito,S.;Morino,T.1996,49(9),958.)，抗菌抗腫瘤活性(Hayashi，Y.;Shoji'M.;Mukaiyama,T.;Gotoh,H.;Yamaguchi，S.;Nakata，H.;Osada,H.Org.Lett.2005,70，5643.)，以及抑制血管生成活性(Asami,Y.;Kakeya，H.;Onose，R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada,H.Org.Left2002，4(17),2845)等。該類化合物是一類較常見的真菌代謝產(chǎn)物，其結構特征是都具有l(wèi)-0xa-7-azaSpir0[4,4]non-2-ene-4，6-dione的結構母核，pseurotinA，synerazolandazaspirene都是該類化合物的例子(Ando，O.;Satake，H.;Nakajima,M.;Sato,A.;Nakamura，T.;Ki腦hita，T.;Furuya,K,丄A打"砲.1991,44(4)，382.;Asami,Y.;Kakeya,H.;Onose,R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada，H.Org.Leff.2002,4(17)，2845)。母豐亥上連接的側鏈常見為臨二醇或共軛雙鍵，而我們的化合物與母核相連的側鏈為乙基呋喃環(huán)，這是非常少見的。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)曲霉B-F-2(A平ergfflwsp.B-F-2)液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細胞壞死活性，遂對其活性成分進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)了兩個新的螺內酰胺類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見對該化合物的化學結構及細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。
發(fā)明內容本發(fā)明旨在提供一種結構獨特的具有細胞增殖抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的新化合物。本發(fā)明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發(fā)明首次從曲霉B-F-2(A印"g"/"ssp.B-F-2)(該菌株已于2005年12月16閂保藏在武漢中國菌種保藏中心，保藏編號是:CCTCCM205148)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結構新穎的新螺內酰胺類化合物，如式I所示R2式I其結構特征是其中式IR,、R3,R4為氫、甲基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?。本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選其中化合物為化合物1，其中^為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2，其中R,為甲基，R2為氫，R3R4均為羥基。上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由海洋來源的曲霉B-F-2(A印wg"Ztwsp.B-F-2)的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇8:2的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60:40洗脫得式I化合物1，2。本發(fā)明采用MTT法測試了化合物1，2對P388，A-549,HL60和BEL-7402細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，這2個化合物對這四種腫瘤細胞均有增殖抑制作用。因此本發(fā)明的式I化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。式I化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學研究，作為探針應用時，式I化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。本發(fā)明的式I化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備式I化合物。本發(fā)明的實施例中列舉了利用曲霉B-F-2株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I化合物的實例。需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)新螺內酰胺類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物1-2的化學結構分別是(結構式中的阿拉伯數(shù)字是化學結構中碳原子的標位)式I式I中化合物1的R,為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2的R,為甲基，R2為氫，R3R4均為羥基。實施例1化合物1-2的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取曲霉B-F-2(A^岬!7tosp.B-F-2)適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。取斜面培養(yǎng)4天的曲霉B-F-2(A印wgZ/^sp.B-F-2)適量，接種到裝有120mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的500mL錐型瓶中，在28°C、120轉/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時，獲得曲霉B-F-2G4印erg"/wsp.B-F-2)的種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按10%接種量分別接種于裝有300毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的1000mL三角燒瓶中，進行為期25天24。C的靜置生產(chǎn)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共15.0克。3化合物的分離精制浸膏(22.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶劑溶解后，加70克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為16個流份。Fr-ll(2克，氯仿-甲醇8:2洗脫物)，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)HPLC，以甲醇-水6:4洗脫得化合物1(60mg)2(llmg)?；衔?黃色固體，分子式C22H21N07，HRESI-MSm/z:412.1380[M+H]+，計算值:412.1396.UVXmaxnminMeOH:337,284，253.IRvmaxcm-1(KBr):3479,3271,3137,2975，2936,1735'1684，1619，1568，1508，1412，1162,1108,803'754,691，667.'H及13CNMR數(shù)據(jù)見表1。化合物2無色固體，分子式C21H19N07,HRESI-MSm/z:428.2434[M+H]+，計算值428.2437。IRvmaxcm-1(KBr):3190,2980，1727,1691，1604，1554,1494,1244,1096，807'790'689。及'SCNMR數(shù)據(jù)見表2。表1600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof1inCDCl.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof2inCDC13<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2抗腫瘤活性的測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物1-2。準確稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用P388，A-549，HL-60和BEL-7402細胞系。各種細胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37°C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發(fā)明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性?；罴毎€粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的formazan,formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。活性測試時，取對數(shù)生長期的P388，A-549,HL-60和BEL-7402細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升5xl0"個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37。C下培養(yǎng)24小時后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。然后加入2C^L含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L),再培養(yǎng)4小時，移出15(HiL培養(yǎng)液后加入150nLDMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR%=(OD如對照-OD附,,)/OD如對照X1009fc式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR%)。2實驗結果化合物1-2的細胞增殖抑制活性表3.化合物1-2對P388，A-549,HL-60和BEL-7402細胞的抑制率12<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3結論化合物l-2對包括人在內的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的式I化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現(xiàn)象本質的生命科學實驗研究中。權利要求1.式I或式II化合物式I其中式IR1、R3、R4為氫、甲基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?.權利要求1所述的式I化合物，其中式I化合物為化合物1，其中R,為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2，其中R,為甲基，R2為氫，&114均為羥基。3.權利要求2所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)曲霉B-F-2C4，^ksp.B-F-2),獲取含有上述式I化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物1和化合物2。4.權利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇8:2的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60:40洗脫得式I化合物1，2。5.權利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。6.根據(jù)權利要求5所述的用途，其中所述抗腫瘤藥物是指所述的式I化合物在制備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。7.根據(jù)權利要求5所述的用途，其中所述抗腫瘤藥物是指所述的式I化合物在制備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的用途。1.式I或式II化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明涉及新螺內酰胺類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明用從海洋樣品中分離得到的曲霉B-F-2(Aspergillussp.B-F-2)生產(chǎn)出結構新穎的上述類型的化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。文檔編號C12R1/66GK101113151SQ20061010365公開日2008年1月30日申請日期2006年7月26日優(yōu)先權日2006年7月26日發(fā)明者睿劉,方玉春,朱偉明,朱天驕,顧謙群申請人:中國海洋大學;中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會