專(zhuān)利名稱(chēng)：動(dòng)物干擾素復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物干擾素復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該動(dòng)物干擾素復(fù)合物是經(jīng)干擾素α和γ的共表達(dá)而得到的干擾素產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
禽流感、口蹄疫等一系列畜禽病毒性傳染病的暴發(fā)流行給全球社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失，直接威脅著食品安全和人類(lèi)健康。為了控制和消滅這些動(dòng)物疾病，常規(guī)途徑是通過(guò)疫苗免疫預(yù)防和使用抗生素，但是由于飼養(yǎng)環(huán)境條件差，病毒不斷變異，與此同時(shí)，食品的生物安全已受到廣泛重視，提倡綠色食品，限制抗生素和抗病毒化學(xué)藥物的使用，加強(qiáng)食品中藥物殘留檢測(cè)等，使傳統(tǒng)的防治畜禽疾病的方法面臨新問(wèn)題和挑戰(zhàn)。
干擾素是由機(jī)體細(xì)胞在病毒等誘導(dǎo)劑的刺激下產(chǎn)生的，具有抑止病毒在被其激活的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的一類(lèi)細(xì)胞因子類(lèi)蛋白質(zhì)分子。干擾素分為I型和II型二類(lèi)，I型干擾素包括干擾素α和干擾素β，其主要活性是通過(guò)與靶細(xì)胞和其自身的受體相互作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒蛋白2-5A合成酶和蛋白激酶PKR等，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，即抗病毒活性。II型干擾素又稱(chēng)干擾素γ，它除具有I類(lèi)干擾素所具有的抗病毒活性外，還具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性①通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞IgGFc受體促進(jìn)ADCC作用；②活化NK細(xì)胞，提高其殺傷能力，被活化的NK細(xì)胞也分泌干擾素γ；③誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T、B等細(xì)胞MHCII類(lèi)分子的表達(dá)，從而提高抗原呈遞能力；④干擾素γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶的產(chǎn)生，促進(jìn)NO的合成，是干擾素γ殺傷胞內(nèi)病原體和抗腫瘤以及抑制病毒復(fù)制的分子機(jī)制之一。
但是由于干擾素mRNA不穩(wěn)定和其基因的迅速關(guān)閉，細(xì)胞通過(guò)病毒或聚肌胞誘導(dǎo)而產(chǎn)生的干擾素量少，持續(xù)時(shí)間也短。因此通過(guò)干擾素誘導(dǎo)劑刺激機(jī)體產(chǎn)生干擾素來(lái)預(yù)防和治療動(dòng)物病毒性傳染病，其效果會(huì)大打折扣。同時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞提取干擾素，其可行性也差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種動(dòng)物干擾素復(fù)合物。
本發(fā)明的另一目的是提供該動(dòng)物干擾素復(fù)合物的制備方法。
本發(fā)明的第三目的是提供該動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制病毒繁殖的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案該動(dòng)物干擾素復(fù)合物，通過(guò)以下步驟制得A、獲取動(dòng)物干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體；B、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建；C、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞；D、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和分解。
所述的動(dòng)物干擾素α和γ基因分別具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。
該動(dòng)物干擾素復(fù)合物的制備方法是由以下步驟組成A、獲取動(dòng)物干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體人工合成動(dòng)物干擾素α和γ核苷酸序列，或者設(shè)計(jì)特異性引物，兩端加入酶切位點(diǎn)，通過(guò)RT-PCR將動(dòng)物干擾素α和γ基因從經(jīng)誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增出來(lái)，分別連接到T載體；
B、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體，表達(dá)載體選用原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體，將同種屬動(dòng)物干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到同一表達(dá)載體，置于同一啟動(dòng)子控制之下，基因讀碼框正確并為3的整數(shù)倍，并且兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)；C、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)載體同源重組，篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，利用磷酸鈣沉淀法或脂質(zhì)體感染法或電轉(zhuǎn)化法等方法，將已構(gòu)建好的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核或真核宿主體內(nèi)，通過(guò)PCR或質(zhì)粒酶切1％瓊脂糖凝膠電泳或序列測(cè)定鑒定無(wú)誤后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選；D、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和分解表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將一個(gè)蛋白質(zhì)分子分解成二部分，即得干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制新城疫病毒、禽流感病毒或傳染性法氏囊炎病毒在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)雞干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒或豬圓環(huán)病毒在豬腎細(xì)胞或Merc-145細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。未經(jīng)豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制?？谔阋卟《?、牛流行性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛細(xì)小病毒在牛腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。未經(jīng)牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬皰疹病毒、犬冠狀病毒在犬腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。未經(jīng)犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，對(duì)動(dòng)物干擾素α和γ基因進(jìn)行克隆，將同種屬動(dòng)物干擾素α和γ基因進(jìn)行串聯(lián)，重組到表達(dá)載體，進(jìn)行體外誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)干擾素α和γ的共表達(dá)。使最終的干擾素產(chǎn)品既具有抗病毒活性，同時(shí)又具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，從而實(shí)現(xiàn)不同型干擾素的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。
具體實(shí)施例方式
下面是本發(fā)明的實(shí)施例，所述的實(shí)施例只是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)被視為是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1雞干擾素α與γ的制備方法通過(guò)由以下步驟進(jìn)行(1)、人工合成雞干擾素α和γ核苷酸序列，兩端加入BamH I、Hind III和Sph I酶切位點(diǎn)，分別連接到T載體。
雞干擾素α在原核表達(dá)載體中表達(dá)時(shí)的核苷酸序列請(qǐng)參見(jiàn)所附序列表中的序列1。
雞干擾素γ在原核表達(dá)載體中表達(dá)時(shí)的核苷酸序列請(qǐng)參見(jiàn)所附序列表中的序列2。
(2)、表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的原核表達(dá)載體，將雞干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體，置于同一啟動(dòng)子控制之下，并且兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)；(3)、轉(zhuǎn)化宿主菌將構(gòu)建好的表達(dá)載體利用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)化宿主菌，通過(guò)藍(lán)白斑和抗性篩選，PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，序列測(cè)定進(jìn)一步鑒定無(wú)誤后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選；(4)、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和制備收集菌體，經(jīng)超聲波裂解，變性，鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化表達(dá)產(chǎn)物，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將表達(dá)的蛋白質(zhì)分子從凝血酶或腸激酶酶切位點(diǎn)消化分解成二部分，即雞干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
實(shí)施例2豬干擾素α與γ的制備具體由以下步驟組成
(1)、獲取豬干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體設(shè)計(jì)特異性引物，兩端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)將豬干擾素α和γ基因從經(jīng)ConA或PHA誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增出來(lái)，分別連接到T載體。
(2)、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的轉(zhuǎn)移載體和表達(dá)載體，將豬干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體，串聯(lián)置于同一啟動(dòng)子控制之下，兩基因讀碼框正確并且是3的整數(shù)倍，兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR或質(zhì)粒酶切或序列測(cè)定鑒定。
(3)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)載體同源重組，表達(dá)載體可選用原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體，篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將已構(gòu)建好的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主體內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選。
(4)、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和制備SDS-PAGE電泳或熒光抗體染色鏡檢鑒定表達(dá)產(chǎn)物，鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將表達(dá)的蛋白質(zhì)分子經(jīng)凝血酶或腸激酶酶切位點(diǎn)消化分解成二部分，即豬干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
實(shí)施例3牛干擾素α與γ的制備具體由以下步驟組成(1)、獲取牛干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體設(shè)計(jì)特異性引物，兩端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)將牛干擾素α和γ基因從經(jīng)ConA或PHA誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增出來(lái)，分別連接到T載體。
(2)、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的轉(zhuǎn)移載體和表達(dá)載體，將牛干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體，串聯(lián)置于同一啟動(dòng)子控制之下，兩基因讀碼框正確并且是3的整數(shù)倍，兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR或質(zhì)粒酶切或序列測(cè)定鑒定。
(3)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)載體同源重組，表達(dá)載體可選用原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體，篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將已構(gòu)建好的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主體內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選。
(4)、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和制備SDS-PAGE電泳或熒光抗體染色鏡檢鑒定表達(dá)產(chǎn)物，鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將表達(dá)的蛋白質(zhì)分子經(jīng)凝血酶或腸激酶酶切位點(diǎn)消化分解成二部分，即牛干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
實(shí)施例4犬干擾素α與γ的制備具體由以下步驟組成(1)、獲取犬干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體設(shè)計(jì)特異性引物，兩端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)將犬干擾素α和γ基因從經(jīng)ConA或PHA誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增出來(lái)，分別連接到T載體。
(2)、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的轉(zhuǎn)移載體和表達(dá)載體，將犬干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體，串聯(lián)置于同一啟動(dòng)子控制之下，兩基因讀碼框正確并且是3的整數(shù)倍，兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR或質(zhì)粒酶切或序列測(cè)定鑒定。
(3)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)載體同源重組，表達(dá)載體可選用原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體，篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將已構(gòu)建好的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主體內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選。
(4)、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和制備SDS-PAGE電泳或熒光抗體染色鏡檢鑒定表達(dá)產(chǎn)物，鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將表達(dá)的蛋白質(zhì)分子經(jīng)凝血酶或腸激酶酶切位點(diǎn)消化分解成二部分，即犬干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
實(shí)施例5由實(shí)施例1得到的雞干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品在雞胚成纖維細(xì)胞上能夠抑制100個(gè)TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒的增殖。在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞，5％的CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，用不同劑量的雞干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品進(jìn)行處理，24小時(shí)后吸棄，再分別接種100個(gè)TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒。結(jié)果表明雞干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品對(duì)新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒感染所引起的細(xì)胞病變均具有抑制作用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)實(shí)施例1得到的雞干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
實(shí)施例6由實(shí)施例2得到的豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品在豬腎細(xì)胞(PK)和Merc145細(xì)胞上能夠抑制100個(gè)TCID50的偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒的增殖。在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)豬腎細(xì)胞(PK)和Merc145細(xì)胞，5％的CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用不同劑量的豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品進(jìn)行處理，24小時(shí)后吸棄，再分別接種100個(gè)TCID50的偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒。結(jié)果表明本品對(duì)偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒感染所引起的細(xì)胞病變均具有抑制作用。未經(jīng)實(shí)施例2得到的豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)實(shí)施例2得到的豬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
實(shí)施例7由實(shí)施例3得到的牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品在牛腎細(xì)胞(MDBK)上能夠抑制100個(gè)TCID50的牛口蹄疫病毒、牛流行性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛細(xì)小病毒的增殖。在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)牛腎細(xì)胞(MDBK)，5％的CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用不同劑量的牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品進(jìn)行處理，24小時(shí)后吸棄，再分別接種100個(gè)TCID50的?？谔阋卟《?、牛流行性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛細(xì)小病毒。結(jié)果表明本品對(duì)?？谔阋卟《尽⑴Ａ餍行愿篂a病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛細(xì)小病毒感染所引起的細(xì)胞病變均具有抑制作用。未經(jīng)實(shí)施例3得到的牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)實(shí)施例3得到的牛干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
實(shí)施例8由實(shí)施例4得到的犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品在犬腎細(xì)胞(MDCK)上能夠抑制100個(gè)TCID50的犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬皰疹病毒、犬冠狀病毒的增殖。在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)犬腎細(xì)胞(MDCK)，5％的CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用不同劑量的犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品進(jìn)行處理，24小時(shí)后吸棄，再分別接種100個(gè)TCID50的犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬皰疹病毒、犬冠狀病毒。結(jié)果表明本品對(duì)犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬皰疹病毒、犬冠狀病毒感染所引起的細(xì)胞病變均具有抑制作用。未經(jīng)實(shí)施例4得到的犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而經(jīng)實(shí)施例4得到的犬干擾素α和γ復(fù)合型基因工程產(chǎn)品處理的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察7天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
以上對(duì)本發(fā)明所提供的動(dòng)物干擾素復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式
及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
序列表<110>周繼臣<120>動(dòng)物干擾素復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用<160>2<210>1<211>582<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cggggctacg gcatcctgct gctcaccctc 60cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc acaggatgcc 120accttctctc acgacagcct ccagctcttc cgggacatgg ctccaacact gctccagctg 180tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240cagcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300ccaagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccgcatccac 360cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacccgctc ccggacccgc 420tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccatcctc 480caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acccgcactt aa 582<210>2<211>495
<212>DNA<213>人工序列<400>2atgacttgcc agacttacaa cttgtttgtt ctgtctgtca tcatgattta ttatggccat 60actgcaagta gtctgaatct tgttcaactt caagatgata ttgacaaact gaaagctgac 120tttaactcaa gtcattcaga tgtagctgac ggtggcccta ttattgtaga gaaactgaag 180aactggacag agcgcaatga gaaacgcatc attctgagcc agattgtttc gatgtacttg 240gaaatgcttg aaaacactga caagtcaaag ccgcacatca aacacatttc tgaggagctc 300tatactctga aaaacaacct tcctgatggc gtgaagaagg tgaaagatat catggacctg 360gccaagctcc cgatgaacga cttgcgcatc cagcgcaaag ccgcgaatga actcttcagc 420atcttacaga agctggtgga tcctccgagt ttcaaacgca aacgcagcca gtctcagcgc 480cgctgcaatt gctaa 49權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物干擾素復(fù)合物，其特征在于，通過(guò)以下步驟制得A、獲取動(dòng)物干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體；B、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建；C、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞；D、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和分解。
2.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物干擾素復(fù)合物，其特征在于，所述的動(dòng)物干擾素α和γ基因分別具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。
3.一種動(dòng)物干擾素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，由以下步驟組成A、獲取動(dòng)物干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體人工合成動(dòng)物干擾素α和γ核苷酸序列，或者設(shè)計(jì)特異性引物，兩端加入酶切位點(diǎn)，通過(guò)RT-PCR將動(dòng)物干擾素α和γ基因從經(jīng)誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增出來(lái)，分別連接到T載體；B、轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建選擇可通過(guò)Lac Z基因篩選的含有His×6標(biāo)簽的具有氨芐青霉素或卡那霉素或慶大霉素或四環(huán)霉素抗性的轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體，表達(dá)載體選用原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體，將同種屬動(dòng)物干擾素α和γ基因分別從已構(gòu)建的T載體中經(jīng)雙酶切后連接到同一表達(dá)載體，置于同一啟動(dòng)子控制之下，基因讀碼框正確并為3的整數(shù)倍，并且兩基因之間插入凝血酶或腸激酶切位點(diǎn)；C、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)載體同源重組，篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，利用磷酸鈣沉淀法或脂質(zhì)體感染法或電轉(zhuǎn)化法等方法，將已構(gòu)建好的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核或真核宿主體內(nèi)，通過(guò)PCR或質(zhì)粒酶切1％瓊脂糖凝膠電泳或序列測(cè)定鑒定無(wú)誤后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化篩選；D、表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和分解表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析或單克隆抗體偶聯(lián)載體顆粒層析純化，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定，純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)凝血酶或腸激酶消化，將一個(gè)蛋白質(zhì)分子分解成二部分，即得干擾素α分子和干擾素γ分子的復(fù)合物。
4.權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制新城疫病毒、禽流感病毒或傳染性法氏囊炎病毒在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒在豬腎細(xì)胞或Merc-145細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制牛流行性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛細(xì)小病毒在牛腎細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的動(dòng)物干擾素復(fù)合物在抑制犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬皰疹病毒、犬冠狀病毒在犬腎細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種動(dòng)物干擾素復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。該動(dòng)物干擾素復(fù)合物通過(guò)獲取動(dòng)物干擾素α和γ基因，構(gòu)建重組克隆載體；轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建；轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌或細(xì)胞；表達(dá)產(chǎn)物鑒定、純化和分解制得。本發(fā)明還公開(kāi)了該動(dòng)物干擾素復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的動(dòng)物干擾素復(fù)合物產(chǎn)品既具有抗病毒活性，同時(shí)又具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，從而實(shí)現(xiàn)了不同干擾素的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1887344SQ20061010382
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者王彥彬, 周繼臣, 魏云強(qiáng), 張翠義 申請(qǐng)人:周繼臣