專利名稱：糜子抗旱基因s－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及一個來源于糜子的抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其編碼蛋白及其在培育抗旱和水分高效利用植物中的用途。
背景技術(shù)：
分離抗旱相關(guān)基因，并獲得轉(zhuǎn)基因植物是植物抗旱性遺傳改良的一個重要途徑。通過多種分子生物學(xué)方法分離耐旱生物(如微生物、植物和動物)與生物水分缺失反應(yīng)及其調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白質(zhì)合成酶的相應(yīng)基因是一種較好的選擇。脯胺酸合成酶基因、海藻糖合成酶基因、傳遞信號和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子等基因已從微生物、昆蟲及植物(如山菠菜)等得到克隆，并導(dǎo)入部分植物(如甜菜、煙草、擬楠芥菜、小麥、玉米等)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性和耐寒性有所提高，展示了良好的應(yīng)用潛力。
利用獲得的抗旱基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，為植物育種提供新的抗旱和水分高效利用的新種質(zhì)，選育出抗旱和水分高效利用的新品種，是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和競爭力的一個重要方面。
糜子(Panicum miliaceum L.)，為禾本科黍?qū)?Panicum)，起源于我國，在華夏民族的發(fā)展中發(fā)揮過重要的作用。與其它禾本科作物如小麥、玉米相比，糜子具有耐旱、抗逆、水分利用效率高等特點(diǎn)，是植物抗旱性改良的優(yōu)異基因資源。經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)任何公開或報(bào)道糜子抗旱和水分高效利用相關(guān)的功能基因克隆的相關(guān)文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
研究表明，利用糜子抗旱和水分高效利用機(jī)制提高其它作物(如小麥、玉米等)的抗旱性和水分利用效率，將對提高作物產(chǎn)量、緩解水分供需矛盾具有十分重要的作用。糜子在干旱和復(fù)水條件下表達(dá)的調(diào)控基因是糜子抗旱機(jī)制中最重要的成分之一。
本發(fā)明的目的在于，提供糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途。
本發(fā)明通過抑制減法雜交(SSH)技術(shù)分別構(gòu)建了糜子抗旱種質(zhì)的復(fù)水與干旱、復(fù)水與正常灌水的cDNA文庫，對文庫中所獲克隆進(jìn)行了隨機(jī)測序，分離獲得的糜子復(fù)水EST中有一條(RS-162，GenBank收錄號DW177307)與水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有較高的同源性，氨基酸一致性為148/157(94％)，該EST包含有該基因的3’端序列。根據(jù)水稻及大麥的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸序列，設(shè)計(jì)了一條簡并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根據(jù)糜子的該EST序列設(shè)計(jì)了一條下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱種質(zhì)復(fù)水初期的葉片中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用這對引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一個741bp的片段，克隆測序后，該片段為糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，將該片段與其3’端序列進(jìn)行拼接，獲得了含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列。該cDNA序列含有5’端非翻譯區(qū)的兩個核苷酸，3’端非翻譯區(qū)的103個核苷酸，編碼區(qū)為1188個核苷酸，編碼396個氨基酸。通過軟件預(yù)測，該蛋白的等電點(diǎn)為5.50，分子量為43243.02，定位在細(xì)胞骨架里。
本發(fā)明的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達(dá)模式，經(jīng)RT-PCR分析表明，該基因在正常情況下表達(dá)，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達(dá)水平下降，復(fù)水后2h再次上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量最高，隨后下降到正常水平。表明該基因主要參與干旱脅迫初期信號傳導(dǎo)過程，調(diào)控相關(guān)干旱防御和復(fù)水生長的功能基因，是糜子抗旱的關(guān)鍵基因，利用它構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化小麥、玉米等作物或其它植物，提高其抗旱性和水分利用效率，具有很大的應(yīng)用潛力。


圖1是本發(fā)明的糜子抗旱S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列及推導(dǎo)的該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列；圖2是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的保守結(jié)構(gòu)域；圖3是幾種植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列的多重比較；圖4是幾種植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖5是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在不同水分處理和復(fù)水條件下表達(dá)的RT-PCR分析。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS)催化甲硫氨酸和ATP反應(yīng)生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，S-腺苷甲硫氨酸參與甲硫氨酸的生物合成，甲硫氨酸是乙烯及多胺的前體，同時SAM還具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫、轉(zhuǎn)氨丙基等作用，是一種重要的代謝中間物質(zhì)。
本發(fā)明通過抑制減法雜交(SSH)技術(shù)分別構(gòu)建了糜子抗旱種質(zhì)的復(fù)水與干旱、復(fù)水與正常灌水的cDNA文庫，對文庫中所獲克隆進(jìn)行了隨機(jī)測序，分離獲得的糜子復(fù)水EST中有一條(RS-162，GenBank收錄號DW177307)與水稻的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有較高的同源性，氨基酸一致性為148/157(94％)，該EST包含有該基因的3’端序列。根據(jù)水稻及大麥的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核酸序列，設(shè)計(jì)了一條簡并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根據(jù)糜子的該EST序列設(shè)計(jì)了下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱種質(zhì)復(fù)水初期的葉片中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用這對引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一個741bp的片段，克隆測序的序列分析表明該片段為糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，將該片段序列與3’端序列進(jìn)行拼接，獲得了一個含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列。
20μL PCR反應(yīng)體系中包括cDNA第一鏈模板1μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)1μL，反向引物(10mmol/L)1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，接著進(jìn)行95℃40s，55℃40s，72℃90s，共35個循環(huán)；最后于72℃延伸8min，反應(yīng)后于4℃保溫。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
獲得的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列為1293bp，含有5’端非翻譯區(qū)的兩個核苷酸，3’端非翻譯區(qū)的103個核苷酸，該基因編碼396個氨基酸(附圖1)。通過軟件預(yù)測，該蛋白的等電點(diǎn)為5.50，分子量為43243.02，定位在細(xì)胞骨架里。
2.糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因編碼的氨基酸序列的初步分析利用http//wolfpsort.seq.cbrc.jp/對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，該糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶定位在細(xì)胞骨架里。
利用NCBI的rpsblast對該糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域比對分析，結(jié)果表明該基因含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶的三個典型的結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域及C端結(jié)構(gòu)域(附圖2)。
對來源于馬鈴薯(Solanum tuberosum)、擬楠芥菜(Arabidopsisthaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、大麥(Hordeum vulgare)、荔枝(Litchichinensis)、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)及糜子(Panicum miliaceum)等8種植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因進(jìn)行了氨基酸序列的多重比較(見附圖3)，結(jié)果表明，不同植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似程度較高。
系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，這8種植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似性在92％-97％，該基因在植物的進(jìn)化中非常保守(見附圖4)。
3.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因表達(dá)的RT-PCR分析以珍珠粟(Pennisetum glaucum(L.)R.Br，pearl millet)組成型表達(dá)的肌動蛋白(actin)基因片段序列為依據(jù)，合成了一對擴(kuò)增糜子組成型表達(dá)的肌動蛋白(actin)基因片段的引物，對糜子的mRNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得了一個171bp的產(chǎn)物，測序比對表明，該片段與水稻肌動蛋白(actin)具有較高的同源性，為糜子actin基因片段，可以此作為內(nèi)參確定不同處理的模板量。
采用引物(5-GCTGCCAAGAGCATTGTT-3和5-TGATAAGCGTGACAGACCA-3)，分別對糜子抗旱種質(zhì)材料植株在土壤相對含水量為75％、36％、24％和復(fù)水后2h、6h、12h的葉片樣品提取的mRNA進(jìn)行RT-PCR分析。
20μL反應(yīng)體系中包括經(jīng)內(nèi)參調(diào)整的適宜體積的cDNA模板，10×PCRBuffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)0.5μL，反向引物(10mmol/L)0.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，接著進(jìn)行95℃40s，55℃45s，72℃40s，共35個循環(huán)；72℃延伸8min，反應(yīng)后于4℃保溫。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
RT-PCR分析表明(見附圖5)，該糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在正常情況下有一定量的表達(dá)，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導(dǎo)表達(dá)，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達(dá)受到抑制，復(fù)水后2h表達(dá)量最高，隨后下降到比正常生長還低的水平。說明該基因主要參與干旱脅迫初期信號傳導(dǎo)過程，從而調(diào)控相關(guān)干旱防御的功能基因。
本發(fā)明的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因來源于最抗旱的禾本科作物糜子，為改良禾本科作物的抗旱性和水分利用效率提供了更好的基因。
該基因?qū)儆谛盘杺鲗?dǎo)相關(guān)基因，可以啟動下游一系列與抗旱及水分高效利用基因的表達(dá)，更便于應(yīng)用到植物抗旱性和水分利用效率的改良，有效地提高植物的抗旱性和水分利用效率。
發(fā)明人給出了以下具體的實(shí)施例。
實(shí)施例1以該基因與含有相應(yīng)植物啟動子(如CaMV 35，actin啟動子等)的表達(dá)載體連接，構(gòu)建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌等獲得含有該基因的菌株；或者將該基因與含有相應(yīng)植物啟動子(如CaMV 35，actin啟動子等)的T-DNA雙元載體等連接，構(gòu)建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的T-DNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌等獲得含有該基因的菌株，與相應(yīng)的農(nóng)桿菌株系進(jìn)行融合，獲得含有該基因的農(nóng)桿菌菌株。
實(shí)施例2對實(shí)施例1中獲得的大腸桿菌菌株或農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行繁殖，提取含有糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達(dá)載體的DNA或直接利用繁殖獲得的菌液，采用本領(lǐng)域工作人員共知的方法(如花粉管通道法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等)轉(zhuǎn)化小麥、玉米等作物或其它植物；篩選獲得該基因恰當(dāng)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，改良現(xiàn)有作物或植物品種的抗旱性和水分利用效率。
糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA序列1 AG GCTGAAGTTGAAACCTTCCTCTTCACCTCGGAGTCTGTGAACGAGGGACACCCTGAC63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC1143 TTCACCTGGGAGGTGGTGAAGCCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTTCTGCC GGTGCCCTT1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT
權(quán)利要求
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其特征在于，編碼該基因的cDNA序列為1293bp，含有5’端非翻譯區(qū)的兩個核苷酸，3’端非翻譯區(qū)的103個核苷酸，編碼框?yàn)?188個核苷酸，編碼396個氨基酸；該基因的cDNA序列為 63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC 1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT。
2.權(quán)利要求1所述的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，用于與相應(yīng)的植物啟動子連接，構(gòu)建糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達(dá)載體或轉(zhuǎn)化獲得糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的宿主菌的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，通過基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或花粉管通道等方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化將糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入小麥、玉米等作物或其它植物，獲得抗旱性和水分利用效率得到改良的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了糜子抗旱基因S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途，該基因的cDNA序列為1293bp，包含5’端非翻譯區(qū)的兩個核苷酸，3’端非翻譯區(qū)的103個核苷酸，編碼396個氨基酸。該基因編碼蛋白的等電點(diǎn)為5.50，分子量為43243.02，定位在細(xì)胞骨架里。RT－PCR表達(dá)模式分析表明，該基因在正常情況下有一定量的表達(dá)，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導(dǎo)表達(dá)，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達(dá)受到抑制，復(fù)水后2h表達(dá)量最高，隨后下降到正常生長水平。表明該基因主要參與干旱脅迫和復(fù)水初期的信號傳導(dǎo)過程，調(diào)控與干旱防御和復(fù)水生長相關(guān)的功能基因，是糜子抗旱的關(guān)鍵基因，利用其轉(zhuǎn)化小麥、玉米等作物和其它作物，提高其水分利用效率，具有很大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N9/00GK1908173SQ20061010447
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月7日
發(fā)明者胡銀崗, 林凡云 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)