專利名稱：利用金磁微粒進行細胞分選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用金磁微粒從含不同細胞的混合樣本中分離所需目 的細胞的方法。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，細胞生物學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床疾病 的診斷與治療都需要從含有不同細胞的混合樣本中分離出純化細胞，現(xiàn)有的 細胞分離技術(shù)主要有FiC011密度梯度離心，離心洗提，雙水相分離，這些 方法都是利用細胞大小，密度，表面電荷等物理性質(zhì)的特征加以分離，難以 獲得理想純度及回收率，而流式細胞儀分選雖然能獲得很高的純度和回收率
卻需要昂貴儀器，且操作過程復(fù)雜費時，CN1376779公開了一種染色后介電 電泳從母體血液樣本中分離胎兒細胞和分離紅細胞和白細胞的方法，該方法 不但需要較復(fù)雜儀器，而且不具備分離其他細胞樣本的通用性。 ZL00256373.8公布開了一種免疫親和分離柱，將親和素交聯(lián)的凝膠充填在親 和層析柱中，用生物素化單抗和細胞懸液通過層析柱，此方法成本較高； CN1357620公開了一種利用不同種類細胞吸附性質(zhì)的不同分離造血干細胞， 其方法同樣不具備通用性。
磁性微粒用于細胞分選是近些年來迅速發(fā)展起來的一項細胞分離的技 術(shù)，其通過在磁性微粒上標(biāo)記抗體分子使其和細胞發(fā)生特異性結(jié)合，借助于 外磁場的作用，使和磁性顆粒結(jié)合的細胞發(fā)生定向移動而實現(xiàn)目的細胞的分 離，此方法操作簡便迅速，不需要大規(guī)模儀器，且能獲較高的純度和回收率。 Molday最早將含羧基的磁性高分子微粒用于細胞分離的研究(Application of magnetic microspheres in labeling and separation of cells[J]. Nature,1977，268:437 438)，美國專利4230685公開了利用蛋白A結(jié)合的磁粒 -分離細胞的方法，美國專利6190870公開了磁性微粒從外周血中分離腫瘤細 胞的方法，美國專利5635363公了磁性微粒分離純化抗原特異性T縛胞的方
法。市場上己有用于細胞分選的商品化的磁粒出售如Dynalbiotech公司的粒 徑4.5Kim的苯乙烯磁粒Milteny公司的50nm的葡聚糖包覆磁粒，BD公司 的粒徑200nm的二氧化硅磁粒。但這些用于細胞分選的磁性微粒大都為有機 /無機磁性復(fù)合顆粒，即以磁性材料為核心，有機小分子，天然高分子，有機 合成高分子等為殼層，這些磁粒用于細胞分選仍存在一些缺陷如表面通 過共價修飾固定抗體分子，固定方法復(fù)雜且易造成抗體活性損失；單位質(zhì)量 磁性微粒固定抗體分子數(shù)量少，細胞分選后續(xù)步驟磁粒與細胞的解離復(fù)雜且 成本較高，價格昂貴。
組裝型磁性復(fù)合微粒和核/殼型超順磁性復(fù)合微粒的制備方法以及結(jié)構(gòu) 組成已經(jīng)在中國專利ZL 03153486. 4和ZL 03124061. 5分別進行了公開，但 其應(yīng)用中主要包括分子或細胞標(biāo)記以及相關(guān)檢測的內(nèi)容，未涉及到細胞分選 的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，而提供一種制作簡單迅 '速，低成本，對所結(jié)合細胞毒性小，不影響細胞活力，能夠用于后續(xù)培養(yǎng)的 金磁微粒進行細胞分選的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明為一種金磁微粒用于細胞分選的方 法，其特殊之處在于該方法包括以下步驟-
1 )在金磁微粒表面直接固定或通過其他親核配基間接固定單克隆抗體 分子其可包括以下四種方式方式一可以通過直接固定單克隆抗體分子; 方式二可以通過先固定二抗分子再和單抗分子結(jié)合間接固定；方式三可 以通過鏈親和素和生物素化的單抗結(jié)合間接固定；方式四可以通過先固定
蛋白A或蛋白G再結(jié)合單抗分子間接固定。
'2)細胞和金磁微粒的結(jié)合將固定好單克隆抗體分子的金磁微粒和待
分離樣本孵育15-60min，使細胞表面抗原和單克隆抗體充分結(jié)合而將細胞固 定在金磁微粒表面；
3)磁分離孵育完畢之后，使用磁性分離裝置進行磁分離2-5min,將 目的細胞和其它細胞分開；4)清洗磁分離結(jié)束后對金磁微粒進行清洗洗去非特異性結(jié)合的細胞， 用清洗緩沖液在不撤去外磁場的條件下緩慢沖洗金磁微粒，棄上清，重復(fù)此 步驟直至洗去非特異性結(jié)合的細胞。
以下以lmg金磁微粒說明表面固定單克隆抗體分子的步驟，具體應(yīng)用 時可根據(jù)比例放大或縮小相應(yīng)倍數(shù)。
方式一中直接固定單克隆分子的具體步驟如下
1.1 )金磁微粒的預(yù)處理:取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入200-800|id 偶聯(lián)緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；
1.2) 抗體溶液的配制將單克隆抗體溶解于200-80(^1偶聯(lián)緩沖液中， 然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；
1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和單克隆抗體搖勻，在20-40。C '的條件下，充分反應(yīng)5-30min，完成單克隆分子在金磁微粒表面的固定；
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入200-800fil清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合的抗體分子；
1.5) 封閉取200-80(Hil封閉劑加入金磁微粒中，搖勻，在20-40。C的 條件下充分反應(yīng)30min-2h，然后用200-800|nl清洗緩沖液清洗去除多余的封 閉劑。
方式二中通過二抗分子間接固定單克隆抗體分子的具體步驟如下 1.1 )金磁微粒的預(yù)處理取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入200-800nl 偶聯(lián)緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；
1.2) 抗體溶液的配制將3-300ng 二抗分子溶液溶解于200-80(Hil的偶 聯(lián)緩沖液中，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；；
1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和二抗分子搖勻，在20-40。C 的條件下，充分反應(yīng)5-30min，完成二抗分子在金磁微粒表面的固定；
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入200-800W清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合的二抗分子；
1.5) 封閉取200-80(Hil封閉劑加入金磁微粒中搖勻，在20-4(PC的條 件下，充分反應(yīng)30min-2h,加清洗緩沖液洗去多余的封閉劑；
1.6) 結(jié)合單抗分子取固定好二抗分子且封閉清洗后的金磁微粒和 3-300|ig的單克隆抗體分子在2-8。C的條件下孵育15-30min，使單克隆抗體 分子和二抗分子充分結(jié)合；
1.7) 清洗加入200-800nl清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清， 重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合的單抗分子。
, 方式三中通過鏈親和素和生物素化單抗固定單抗分子的具體步驟如下 1.1 )金磁微粒的預(yù)處理:取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入200-800^1 偶聯(lián)緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；
1.2) 金磁微粒結(jié)合連親和素將3-300iig鏈親和素溶于100-800nl偶聯(lián)緩 沖液配成鏈親和素溶液，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中， 搖勻，充分反應(yīng)5-30min;
1.3) 固定生物素化單抗將3-30(Hig單克隆抗體分子溶于100-800(il偶聯(lián) 緩沖液中，加入結(jié)合有鏈親和素的金磁微粒，搖勻，在20-40。C的條件下， 充分反應(yīng)5-30min;
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入200-800inl清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合單抗分子；
1.5) 封閉取200-800nl封閉劑加入金磁微粒中搖勻，在20-40。C的條 件下，充分反應(yīng)30min-2h，加200-800^1清洗緩沖液洗去多余的封閉劑。
方式四中利用蛋白A或蛋白G間接固定單克隆抗體分子具體步驟如下: 1.1 )金磁微粒的預(yù)處理:取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入200-800pl 偶聯(lián)緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；
1.2) 蛋白A或蛋白G溶液的配制將蛋白A或蛋白G溶液溶解于 200-80(Hi1偶聯(lián)緩沖液，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；
1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和蛋白A或蛋白G溶液搖勻， 在20-40。C的條件下，充分反應(yīng)5-30min;
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入200-80(^1清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合的蛋白A或蛋白G;
1.5) 封閉取200-800nl封閉劑加入金磁微粒溶液中搖勻，在20-40。C 的條件下，充分反應(yīng)30min-2h，加清洗緩沖液洗去多余的封閉劑；
1.6) 結(jié)合單抗分子將3-300嗎單克隆抗體分子溶于200-80(HiL偶聯(lián)緩 沖液中，加入固定好蛋白A或蛋白G且封閉清洗過的金磁微粒，搖勻，在 20-40。C的條件下，充分反應(yīng)5-30min;
1.7) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入200-800pl清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合的單抗分子。
上述金磁微粒為核殼型超順磁性復(fù)合微?；蚪M裝型磁性復(fù)合微粒。 上述偶聯(lián)緩沖液為Tris-HCl緩沖液(pH7.0-9.0， 5mM-lM)或磷酸鹽緩 沖液PBS(pH5.0-8.0，0.5x-10x)或碳酸鹽緩沖液CBS(pH9.0-11.0， 5mM-lM) 或醋酸鹽緩沖液(pH3.6-5.6, 5mM-lM)或檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0-7.0 ， 5mM-lM)或TE緩沖液(pH7.0-9.0， 5mM-lM)或TBS緩沖液(pH7.0-9.0， 5mM-lM)。
上述清洗緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或含0.02-0.2%吐溫的偶聯(lián)緩沖液。
上述封閉劑為含有1-10%的牛血清白蛋白(BSA)、賴氨酸(Lys)、脫 脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一種或多種成分的偶聯(lián)緩沖液。
本專利發(fā)明人在專利ZUB14061.5公開了核殼型磁性復(fù)合微粒的制備方 ,法，ZL03153486.4公開了組裝性磁性復(fù)合微粒的制備方法，并將這兩種磁性 復(fù)合顆粒稱為金磁微粒，和現(xiàn)有技術(shù)相比，金磁微粒在細胞分選方面有以下 優(yōu)點標(biāo)記抗體分子具有比現(xiàn)有產(chǎn)品固定容量大，操作簡單迅速，低成本等 特點，且對所結(jié)合細胞毒性小，不影響細胞活力，能夠用于后續(xù)培養(yǎng)，細胞 從磁粒上的解離條件不苛刻，只需要用移液器反復(fù)吹打磁?；?qū)⒓毎^續(xù)培 養(yǎng)就可實現(xiàn)細胞從磁粒上的解離。
根據(jù)金磁微粒分離細胞的原理，要想從混合細胞樣本中分離目的細胞，
只要能得到針對抗特定細胞表面抗原分子的單克隆抗體，并將其固定在金磁 微粒表面，便可實現(xiàn)對特定細胞的分離，目前，大多抗特定細胞表面抗原的 單克隆抗體已經(jīng)能在市場上購得。本發(fā)明的方法尤其適用于分離外周血，骨 髓，臍帶血和淋巴組織液中感興趣的細胞，并將它們用于細胞、免疫學(xué)基礎(chǔ)
研究和臨床診斷與治療。例如，細胞免疫主要是由T淋巴細胞來實現(xiàn)的，因 此分離出高純度的T淋巴細胞對研究T細胞功能的實現(xiàn)和免疫機理研究有重 要意義，CD3是T細胞表面特異抗原，因此用CD3單抗可實現(xiàn)T細胞的分 離。CD4陽性T細胞是HIV感染的主要靶分子，臨床上對潛在的感染威脅 而進行的抗病毒或預(yù)防治療決定，是依據(jù)對CD4+T細胞的計數(shù)而做出的； 因此金磁微粒用于細胞分離可以用于檢測HIV感染。造血干細胞表達特異的 表面標(biāo)志，從外周血或臍帶血中分離高純度造血干細胞可以用于干細胞移 植。腫瘤細胞表達特異性表面標(biāo)志，金磁微粒作為載體可以用于從病人血液 中清除腫瘤細胞。本發(fā)明對陰性分選和陽性分選兩種方法均適用.


圖1為本發(fā)明實施例一固定前和固定后抗體溶液的紫外吸收峰；
圖2為本發(fā)明實施例三的流式細胞儀結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明的具體方法優(yōu)選的步驟如下 '1、在金磁微粒表面直接固定或通過其他親核配基間接固定單克隆抗體 分子具體有以下四種方法
1)在金磁微粒表面直接固定抗細胞表面抗原的單克隆抗體，此種固定 方法采用一步固定步驟少操作簡單，采用較少的試劑和反應(yīng)步驟，避免了抗 體間的交叉反應(yīng)帶來的非特異吸附，但要求固定相對較多數(shù)目的單克隆抗體 分子，其具體步驟如下
1.1)金磁微粒的預(yù)處理取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入50(Hd 的0.01MTris-HClpH7.4中搖勻，磁性分離2min，棄上清； ,1.2)抗體溶液的配制將75pg單克隆抗體溶于500^1的O.OlMTris-HCl pH7.4中，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中； 1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和單克隆抗體搖勻，置于搖床
中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)30min;
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離2min，棄上清，加 入50(^1的含0.05°/。吐溫20的lxPBS中，搖勻，磁性分離2min，棄上清， 重復(fù)三次；
1.5) 封閉取400^1的含5%脫脂奶粉的0.01M Tris-HCl pH7.4加入金
'磁微粒中，搖勻置于搖床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)2h，用 500W的含0.05%吐溫20的lxPBS清洗三次。
2)在金磁微粒表面固定抗單克隆抗體的二抗分子，通過二抗和單克隆 抗體的結(jié)合，將單克隆抗體間接固定在金磁微粒表面，此種方法首先固定二 抗分子，此二抗分子可以是抗單克隆抗體來源的任何多克隆抗體分子，由于 二抗的放大作用使可以固定相對數(shù)量較少的單克隆抗體，且二抗分子的引入 使單克隆抗體的Fc端和二抗分子結(jié)合，結(jié)合細胞表面抗原的Fab端充分伸 展而保持良好的活性，因此在成本和使用的通用性方面有一定的優(yōu)勢，其具 '體步驟如下
1.1) 金磁微粒的預(yù)處理取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入600pl 的0.01MTris-HClpH7.4中搖勻，磁性分離2min，棄上清；
1.2) 抗體溶液的配制將75嗎二抗分子溶于500^1的0.01M Tris-HCl pH7.4中，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；
1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和二抗分子搖勻，置于恒溫搖 床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)30min;
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離2min，棄上清，加 入500|11的含0.05%吐溫20的lxPBS，搖勻，磁性分離2min，棄上清；
' 1.5)封閉取40(^1的含5%脫脂奶粉的0.01MTris-HClpH7.4加入金磁 微粒中，搖勻置于搖床中，在37°C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)2h， ， 500|il 的含0.05%吐溫20的lxPBS清洗三次；
1.6) 結(jié)合單抗分子取固定好二抗分子封閉清洗后的金磁微粒和10pg 單克隆抗體分子在4°C的條件下孵育30min;
1.7)清洗加入500^1的含0.05%吐溫20的lxPBS搖勻，磁性分離2min， 棄上清，重復(fù)三次。
3) 在金磁微粒表面固定鏈親和素，通過生物素化抗體和鏈親和素的強 結(jié)合力將單克隆抗體固定在金磁微粒表面，鏈親和素是非糖基化蛋白，非特 異性很低，和生物素化蛋白的結(jié)合能力是抗原抗體親和力的100萬倍，此種 方法需要生物素化的單克隆抗體分子，其具體步驟如下
1.1) 金磁微粒的預(yù)處理取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入400^1 的0.1MTris-HClpH7.4搖勻，磁性分離2min，棄上清；
1.2) 金磁微粒結(jié)合鏈親和素將300嗎鏈親和素溶于500^il的0.1M Tris-HClpH7.4配成鏈親和素溶液，加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管 中，將離心管置于搖床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)10min;
-1.3)清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離2min，棄上清，加 入400W的0.01MTris-HClpH7.4，輕搖重懸磁粒，磁分離2min，考上清；
1.4) 固定生物素化單抗將10pg單克隆抗體分子溶于200^1的0.01M Tris-HCl pH7.4中，加入結(jié)合有鏈親和素的金磁微粒搖勻，置于搖床中，在 37。C、 120r/min的條件下充分反應(yīng)15min;
1.5) 封閉取400^1的含5。/。脫脂奶粉的0.1MTris-HClpH7.4加入金磁 微粒中，搖勻置于搖床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)30min，用 500W的0.1MTris-HClpH7.4清洗三次；
4) 在金磁微粒表面固定蛋白G，利用蛋白G和IgG分子的強結(jié)合力將單 '克隆抗體固定在金磁微粒表面，其具體步驟如下
1.1) 金磁微粒的預(yù)處理取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入500W 的0.02MTris-HCl PH7.4搖勻，磁性分離2min，棄上清；
1.2) 蛋白G溶液的配制將160mg蛋白G溶液溶解于500nl的0.02M Tris-HC1PH7.4中，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；
1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和蛋白G溶液搖勻，置于搖 床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)30min;
1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離2min，棄上清，加
入500W的含0.05%吐溫20的lxPBS，搖勻，磁性分離2min，棄上清，重 復(fù)此步驟三次；
1.5) 封閉取400pl的含5%脫脂奶粉的0.02M Tris-HCl加入金磁微粒 中搖勻，在37。C的條件下充分反應(yīng)30min，加入50(^1的含0.05%吐溫20 的lxPBS清洗三次；
1.6) 結(jié)合單抗分子將10mg單克隆抗體分子溶于lOO)il的O.IM檸檬 酸鹽緩沖液pH5.0中，加入固定好蛋白G封閉清洗過的金磁微粒，搖勻， 在37°C的條件下充分反應(yīng)10 min;
1.7) 清洗離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清，加入 500pl的0.1M pH5.0檸檬酸鹽緩沖液清洗三次。
2、 細胞和金磁微粒的結(jié)合固定有單克隆抗體分子的金磁微粒經(jīng)過簡 單的孵育過程就可以完成細胞核金磁微粒的結(jié)合，將固定好的金磁微粒和待 分離樣本孵育3 0min，其間間隔5min輕搖一次避免細胞沉底，使細胞表面
抗原和單克隆抗體充分結(jié)合而將細胞固定在金磁微粒表面；
3、 磁分離孵育完畢之后，使用磁性分離裝置進行磁分離5min，將固
定在金磁微粒表面的細胞和其它細胞分開；
,4、清洗磁分離結(jié)束后對磁粒進行清洗洗去非特異性結(jié)合的細胞，用 含l%BSA+2mM EDTA的lxPBS不撤去外磁場緩慢沖洗磁粒，棄上清，重 復(fù)三次，可依據(jù)分選策略保留上清溶液(陰性分選)和磁粒(陽性分選)繼 續(xù)后續(xù)試驗；
5、細胞從金磁微粒上的解離微米級金磁微粒直徑和細胞相當(dāng)，不需 要強磁場就能迅速實現(xiàn)細胞分離，分離得到的細胞需要從磁粒上解離下來， 細胞從磁粒上的解離可以通過將磁性微粒-細胞復(fù)合物進行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 后在機械壓力如移液管的反復(fù)吹打可使細胞與磁性微粒解離。
下面以具體的實施例進一步闡明本發(fā)明
' 實施例1
在金磁微粒表面直接固定抗細胞表面抗原的單克隆抗體(CD3單抗)。 取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入500W的0.02M Tris-HCl pH7.4用手搖勻，磁性分離2min左右，棄上清，將75mg的CD3單抗溶解于500^1 的0.02M Tris-HCl pH7.4中，取400W加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離 心管中另留100nl作紫外檢測；將裝有金磁微粒和抗體的離心管搖勻，置于
搖床中，在37。C、 180r/min的條件下充分反應(yīng)30min反應(yīng)完畢，磁性分離， ，取100]Lll上清作紫外檢測其余棄去。對金磁微粒進行清洗以洗去多余的抗體 分子，加入500nl的含5。/。吐溫的1XPBS搖勻，磁分離棄上清，重復(fù)此步驟 二次,以400^1的含5%脫脂奶粉的1 X PBS加入金磁微粒中，在37。C、 180r/min 的條件下充分反應(yīng)30min,然后用400|il的含5%吐溫的1XPBS清洗三次。
參見圖l，圖為固定前后抗體溶液的紫外吸收峰，在此實施例一中抗體 分子在280nm處吸收峰的顯著降低說明抗體分子已固定于金磁微粒表面且 不易洗脫。
實施例2
金磁微粒通過二抗分子(羊抗小鼠IgG)間接固定單克隆抗體(抗CD3
*單抗)。
取lmg金磁微粒，置于離心管中，加入500W的0.02M Tris-HCl PH7.4 搖勻,磁性分離2min，棄上清，將75pg的羊抗小鼠IgG抗體溶液溶解于500pl 的0.02M Tris-HCl pH7.4中，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管 中；將裝有金磁微粒和抗體的離心管置于搖床中，在37。C、 180r/min的條件 下充分反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后磁性分離，棄上清；加入500^1的含0.05% 吐溫20的1 XPBS對金磁微粒進行清洗一次，然后以400|_il的含5%脫脂奶 粉的O.OlMTris-HCl加入到金磁微粒中，然后置于搖床中，在37°C、 180r/min ，的條件下充分反應(yīng)30min，用40(Hil的含0.05%吐溫20的1 XPBS清洗三次 去除多余的脫脂奶粉。
實施例3 , 通過二抗間接固定單克隆抗體分子的金磁微粒分選CD3+細胞 細胞樣本的準(zhǔn)備將Raji(CD3-)， Juricat (CD3+)細胞分別計數(shù)，按4: 1的比例混合，于4。C 1200r/min離心5min，棄上清，收集沉淀，以分選緩沖 液lxPBS含l%BSA+2mMEDTA重懸至一定體積。
細胞和金磁微粒的結(jié)合細胞樣本和金磁微粒按照每1 乂106個目的細 '胞加入2 0 Opg通過二抗間接固定有單抗分子的金磁微粒的比例充分混勻， 室溫孵育3 0min，其間每5min輕搖一次避免細胞沉至管底，使繼胞表面 抗原和單克隆抗體充分結(jié)合而將細胞固定在金磁微粒表面；
磁分離反應(yīng)完畢后，將磁粒一細胞懸液磁性分離5min;
清洗和檢測取上清留作染色以檢測得率。磁粒上細胞用"PBS含 l%BSA+2mMEDTA在不撤去外磁場的條件下清洗三次，以去除非特異性結(jié) 合的細胞，金磁微粒-細胞加入lml的lxPBS含l%BSA+2mMEDTA重懸， 搖勻，留作染色以檢測純度。
, 參見圖2，結(jié)果經(jīng)流式細胞儀檢測分選前細胞混合液中CD3+的含量 23%,分選后細胞混合液上清CD3+的含量6.2%，分選后細胞混合液中磁粒 上CD3+含量9P/。，所以，分選得率為73%，純度為91%。 '
金磁微粒是指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面 包覆單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復(fù)合微粒，也指以磁性納米粒子或 磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的 磁性復(fù)合微粒。所述磁性納米粒子包括Fe304、 Y-FeA等鐵的氧化物粒子， 單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子；磁性 納米粒子的聚集體是指經(jīng)修飾后形成的FeA、 Y- Fe必i等鐵的氧化物粒子 衆(zhòng)集體，經(jīng)修飾后形成的單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子聚集體，或經(jīng)修飾后形成的 Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
權(quán)利要求
1、一種金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)抗體分子固定化在金磁微粒表面固定單克隆抗體分子；2)細胞和金磁微粒的結(jié)合將固定好單克隆抗體分子的金磁微粒和待分離樣本孵育15-60min，使細胞表面抗原和單克隆抗體充分結(jié)合而使細胞結(jié)合在金磁微粒表面；3)磁分離孵育完畢之后，使用磁性分離裝置進行磁分離，將目的細胞和其它細胞分開；4)清洗磁分離結(jié)束后對金磁微粒進行清洗洗去非特異性結(jié)合的細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于 所述步驟l)中的固定的具體步驟如下U)金磁微粒預(yù)處理取金磁微粒，置于離心管中，加入偶聯(lián)緩沖液用手搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；1.2) 抗體溶液的配制將單克隆抗體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，然后加入到 含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和單克隆抗體搖勻，在20-40。C 的條件下，充分反應(yīng)5-30min，完成單克隆分子在金磁微粒表面的固定；1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合的 抗體分子；1.5) 封閉取封閉劑加入金磁微粒中，搖勻，在20-40°C的條件下充分 反應(yīng)30min-2h，然后用清洗緩沖液清洗去除多余的封閉液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于: 所述步驟l)中的固定的具體步驟如下.1.1)金磁微粒預(yù)處理取金磁微粒，置于離心管中，加入偶聯(lián)緩沖液搖 勻，磁性分離l-3min，棄上清；1.2)抗體溶液的配制將二抗分子溶液溶解于的偶聯(lián)緩沖液中，然后加 入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；；1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和二抗分子搖勻，在20-40。C 的條件下、充分反應(yīng)5-30min，完成二抗分子在金磁微粒表面的固定；1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合的 二抗分子；1.5) 封閉取封閉劑加入金磁微粒中搖勻，在20-40。C的條件下、充分 反應(yīng)30min-2h，加清洗緩沖液洗去多余的封閉劑-,1.6) 結(jié)合單抗分子取固定好二抗分子且封閉清洗后的金磁微粒和的單 克隆抗體分子在2-8。C的條件下孵育15-30min，使單克隆抗體分子和二抗分 子充分結(jié)合；1.7) 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗 去未結(jié)合的單抗分子。,
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于: 所述步驟l)中的固定的具體步驟如下1.1) 金磁微粒的預(yù)處理取金磁微粒，置于離心管中，加入偶聯(lián)緩沖液 搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；1.2) 金磁微粒結(jié)合連親和素將鏈親和素溶于偶聯(lián)緩沖液配成鏈親和素溶液，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中，搖勻，充分反應(yīng)5-30min;1.3) 固定生物素化單抗將單克隆抗體分子溶于偶聯(lián)緩沖液中，加入結(jié)合有鏈親和素的金磁微粒，搖勻，在20-40。C的條件下，充分反應(yīng)5-30mi^1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合單 抗分子；1.5 )封閉取封閉劑加入金磁微粒中搖勻，在20-40°C的條件下，充 分反應(yīng)30min-2h，加清洗緩沖液洗去多余的封閉劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于: 所述步驟1中的固定的具體步驟如下1.1) 金磁微粒預(yù)處理取金磁微粒，置于離心管中，加入偶聯(lián)緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清；1.2) 蛋白A或蛋白G溶液的配制將蛋白A或蛋白G溶液溶解于偶聯(lián) 緩沖液，然后加入到含有預(yù)處理過的金磁微粒的離心管中；1.3) 固定化反應(yīng)將離心管中的金磁微粒和蛋白A或蛋白G溶液搖勻， 在20-40。C的條件下，充分反應(yīng)5-30min;1.4) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合的 蛋白A或蛋白G;1.5) 封閉取封閉劑加入金磁微粒溶液中搖勻，在20-40。C的條件下， 充分反應(yīng)30min-2h，加清洗緩沖液洗去多余的封閉劑；1.6) 結(jié)合單抗分子將單克隆抗體分子溶于偶聯(lián)緩沖液中，加入固定好 蛋白A或蛋白G且封閉清洗過的金磁微粒，搖勻，在20-40°C的條件下， 充分反應(yīng)5-30 min;1.7) 清洗將離心管置于磁性分離器上，磁性分離l-3min，棄上清， 加入清洗緩沖液搖勻，磁性分離l-3min，棄上清，重復(fù)此步驟洗去未結(jié)合的 單抗分子。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的金磁微粒用于細胞分選的 方法，其特征在于所述步驟4)后還包括有步驟5)細胞從磁粒上的解離 通過將磁性微粒-細胞復(fù)合物繼續(xù)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后在機械壓力下可使細胞 與磁性微粒解離。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的金磁微粒用于細胞分選的 方法，其特征在于所述金磁微粒為核殼型超順磁性復(fù)合微?；蚪M裝型磁性復(fù)合微粒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于:上述偶聯(lián)緩沖液為Tris-HCl緩沖液(pH7.0-9.0， 5mM-lM)或磷酸鹽緩沖液 .PBS (pH5.0-8.0, 0.5x-10x)或碳酸鹽緩沖液CBS (pH9.0-11.0， 5mM-lM) 或醋酸鹽緩沖液(pH3.6-5.6， 5rftM-lM)或檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0-7.0 ， 5mM-lM)或TE緩沖液(pH7.0-9.0， 5mM-lM)或TBS緩沖液(pH7.0-9.0, 5mM陽lM)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于: 所述清洗緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或含0.02-0.2%吐溫的偶聯(lián)緩沖液。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的金磁微粒用于細胞分選的方法，其特征在于: 所述封閉劑為含有1-10%的牛血清白蛋白(BSA)、賴氨酸(Lys)、脫脂奶 粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一種或多種成分的偶聯(lián)緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用金磁微粒從含不同細胞的混合樣本中分離所需目的細胞的方法。其技術(shù)解決方案為該方法包括以下步驟1)抗體分子固定化在金磁微粒表面固定單克隆抗體分子；2)細胞和金磁微粒的結(jié)合將固定好單克隆抗體分子的金磁微粒和待分離樣本孵育15-60min，使細胞表面抗原和單克隆抗體充分結(jié)合而使細胞結(jié)合在金磁微粒表面；3)磁分離孵育完畢之后，使用磁性分離裝置進行磁分離，將目的細胞和其它細胞分開；4)清洗磁分離結(jié)束后對金磁微粒進行清洗洗去非特異性結(jié)合的細胞。本發(fā)明具有制作簡單迅速，低成本，對所結(jié)合細胞毒性小，不影響細胞活力，還能夠用于后續(xù)培養(yǎng)等優(yōu)點。
文檔編號C12N5/00GK101165173SQ200610104760
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者蓓 劉, 崔亞麗, 超 陳, 婧 高 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司