專利名稱：可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法，利用該細(xì)胞可臨床應(yīng)用于糖尿病患者的胰島移植。
背景技術(shù)：
糖尿病是危害人類健康的全球性疾病。發(fā)病率為3-5％；死亡率僅次于心血管病和腫瘤。預(yù)測(cè)到2025年全世界糖尿病患者將達(dá)到3億人。其中I型糖尿病患者(IDDM)將占到5-10％；這些人群將終生依賴外源性胰島素。長(zhǎng)期注射胰島素可使局部皮膚紅腫、發(fā)癢、硬結(jié)、感染、皮下脂肪萎縮或纖維化增生。每天注射胰島素不僅給患者帶來不便及痛苦，更重要的是胰島素的應(yīng)用僅能控制高血糖，無法預(yù)防其慢性并發(fā)癥的發(fā)生。多年來大量實(shí)驗(yàn)證明異種胰島素細(xì)胞移植，不僅能逆轉(zhuǎn)(IDDM)I型糖尿病患者的高血糖癥狀，而且還能防止慢性并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展。但，胰島細(xì)胞的移植應(yīng)用到臨床需解決幾個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)問題。一是胰島細(xì)胞供體的來源。二是胰島細(xì)胞的分離及純化。三是胰島細(xì)胞培養(yǎng)、訓(xùn)化、誘導(dǎo)。四是移植部位的選擇。這些環(huán)節(jié)關(guān)鍵技術(shù)必須應(yīng)用現(xiàn)代生物高新技術(shù)給予解決，否則缺少那一部分，都會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞移植治療I型糖尿病的失敗，造成糖尿病復(fù)發(fā)。
胰島細(xì)胞移植治療I型糖尿病的現(xiàn)況二十世紀(jì)九十年代胰島移植的臨床應(yīng)用研究已成為移植界研究的熱點(diǎn)。據(jù)有關(guān)資料報(bào)導(dǎo)，1989年至2003年已有三個(gè)國(guó)家七十多例I型糖尿病患者接受了豬胰島移植。初期，國(guó)內(nèi)外研究者采用人胚胎胰島進(jìn)行移植，而I型糖尿病發(fā)病的機(jī)理是自身免疫損傷造成的，雖然同種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，但自身免疫性對(duì)移植的胰島的破壞是避免不了的。再加上人胚胎供體缺乏、倫理道德等因素限制了此項(xiàng)工作的推廣及開展。后來人們發(fā)現(xiàn)豬的胰島素在臨床上應(yīng)用十多年，安全性、有效性得到充分證明，從分子生物學(xué)及組織學(xué)分析人與豬的胰島素結(jié)構(gòu)極為相似，都有A鏈、B鏈、51個(gè)氨基酸組成；A鏈都含21個(gè)氨基酸、B鏈30個(gè)氨基酸。不同的是人B鏈第30位氨基酸是蘇氨酸；豬B鏈第30位丙氨酸。氨基酸的差異未影響特定立體結(jié)構(gòu)，所以生物功能活性沒有發(fā)生改變。這樣豬胰島作為供體引起研究者極大興趣。為了得到純化胰島，在對(duì)胰腺分離時(shí)采用了膠原酶消化法，此方法在實(shí)驗(yàn)室可得到純化胰島，但忽略了胰島和膠原酶接觸后產(chǎn)生不可修復(fù)的副作用。膠原酶在消化過程中易產(chǎn)生膠狀物。此物不易洗脫，易粘附在生物膜上影響胰島細(xì)胞在生長(zhǎng)、更新過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)也影響著細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物的排出。另外膠原酶是一種較強(qiáng)的趨化劑、黏附到胰島細(xì)胞膜上對(duì)巨噬細(xì)胞有較強(qiáng)趨化性，這樣不僅沒有減少排斥作用，而又加大了免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)。膠原酶的消化易產(chǎn)生大量的凝血因子，會(huì)增加移植后血管內(nèi)凝血的危險(xiǎn)性，不利于胰島移植后在血液內(nèi)長(zhǎng)期生存。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，各實(shí)驗(yàn)室都采用RPMI1640培養(yǎng)液，另加入小牛血清或胎牛血清。但血清的成分復(fù)雜，易造成不良的培養(yǎng)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題而研制的一種可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的是通過以下方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法包括以下工藝步驟(1)、胰島細(xì)胞供體的選擇供體選擇剛出生、未哺乳健康仔豬，無菌下開腹取胰腺，去除包膜、血管、結(jié)締組織并置4℃Hank｀s液中；(2)、胰島細(xì)胞的分離及純化通過機(jī)械研磨使胰島與外分泌組織分離。再通過Dextran(葡聚糖-上海試劑二廠產(chǎn)品)不連續(xù)密度梯度離心，得到胰島細(xì)胞，取樣鏡檢形態(tài)、活性純度、數(shù)量、收集，從分離到純化結(jié)束應(yīng)控制在4-6小時(shí)；(3)、胰島細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用無血清微球載體進(jìn)行CO2培養(yǎng)，采用RPMI-1640培養(yǎng)液，并加入纖維連接蛋白，在培養(yǎng)過程中，將胰島細(xì)胞包于A-P-A生物膜內(nèi)形成微球，適時(shí)檢測(cè)微囊形態(tài)、活性、計(jì)數(shù)，在恒溫37℃含CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)換一次培養(yǎng)液，定期取培養(yǎng)液測(cè)定胰島素含量。觀察記錄胰島細(xì)胞在微囊內(nèi)分化、生長(zhǎng)、分泌胰島素功能來判定終止培養(yǎng)時(shí)間，最終可獲得大量具有活性和純度較大的微囊新生仔豬胰島細(xì)胞。
在本發(fā)明中，所述仔豬為剛出生24小時(shí)內(nèi)且系雜交后代。
胰島細(xì)胞的分離及純化的具體步驟為
①分離胰島a、采用VI6型振動(dòng)式細(xì)胞球珠研磨儀使胰島與其它胰腺部分脫離(研磨10min)；b、將研磨漿放入4℃Hank｀s液中，過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)；c、未過網(wǎng)組織再研磨，過網(wǎng)反復(fù)多次，使研磨漿通過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)；d、將收集的過濾物在4℃環(huán)境中，用1500r/min離心5分鐘，收集沉淀物R，棄去上清液；②純化用葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心，操作如下a、用15ml、27％的Dextrna(葡聚糖-上海試劑二廠產(chǎn)品)與沉淀物充分混勻，在此基礎(chǔ)上緩慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank｀s；b、用4℃、600r/min離心4min；c、然后加速到2500r/min離心10min；d、收集11％-23％兩層的胰島細(xì)胞；e、用RPMI-1640液洗兩次，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀Sf、將細(xì)胞沉淀S與10mlRPMI-1640混勻，取樣鏡檢，觀察胰島形態(tài)、活性、純度、數(shù)量、成活率；g、從分離到純化結(jié)束應(yīng)控制在4-6小時(shí)。
本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)如下<一>供體的選擇1.剛出生不超過一天(未哺乳)仔豬。因剛離開母體，未與外界接觸。只要對(duì)仔豬的父系母系認(rèn)真檢查，就能杜絕傳染病的發(fā)生，就能保證人移植后的安全性。
2.利用雜交優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，細(xì)胞易誘變，易適應(yīng)新環(huán)境。
3.豬胰島細(xì)胞在胚胎后期基本成熟。而胰腺外分泌部分，發(fā)育落后于胰島。這樣易于辨別胰島和外分泌組織。便于胰島的純化。
4.剛生一天仔豬(未哺乳)和胎豬比較不用任何手術(shù)；和幼豬比較沒接觸外界安全性大；與成豬比較胰島剛剛成熟，免疫抗原性低；通過培養(yǎng)訓(xùn)化、誘導(dǎo)可發(fā)揮雜交、不成熟胰島的可塑性，向人類希望的方面發(fā)展而且成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
<二>胰島細(xì)胞的分離純化。
由于豬胰島分化、發(fā)育成熟到胚胎后期，胰腺的分泌組織在分娩時(shí)還不成熟。故不宜用常規(guī)膠原酶消化分離。酶對(duì)胰島細(xì)胞的不可修復(fù)的副作用，是導(dǎo)致胰島移植后生長(zhǎng)、更新能力低、活性、功能差、不能長(zhǎng)期存留于人體的主要原因。因此采用VI6型振動(dòng)式細(xì)胞球珠研磨機(jī)。(Johanna Otto公司產(chǎn)品)通過機(jī)械研磨使胰島與外分泌組織分離。再通過Dextran(葡聚糖-上海試劑二廠產(chǎn)品)不連續(xù)密度梯度離心，得到胰島細(xì)胞。
<三>應(yīng)用無血清微球載體進(jìn)行培養(yǎng)。
1.在培養(yǎng)基中加入纖維連結(jié)蛋白(FN)，按體積每升培養(yǎng)基加入FN 5-30mg，它促進(jìn)了細(xì)胞的貼壁粘連生長(zhǎng)。粘連是動(dòng)物細(xì)胞完成生長(zhǎng)的必要條件。
2.在培養(yǎng)過程中，將胰島細(xì)胞包于A-P-A生物膜內(nèi)形成微球，這樣不僅保護(hù)了胰島細(xì)胞免受排斥反應(yīng)的攻擊，同時(shí)也為胰島細(xì)胞的融合、貼壁創(chuàng)造了條件。
A-P-A為海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊技術(shù)的縮寫。(參考文獻(xiàn)《國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊(cè)》，2000年第27卷第2期。P75-77)本發(fā)明所采用的細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于由于胰島移植物在通常的純化過程中直接丟失胰島數(shù)量較多，且往往由于用力振蕩、高速離心、制備時(shí)間延長(zhǎng)等容易死亡?，F(xiàn)在證實(shí)細(xì)胞支架通過跨膜粘合素分子與細(xì)胞外基質(zhì)緊密相連，形成具有結(jié)構(gòu)和功能的大量網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)細(xì)胞分離或細(xì)胞移植時(shí)，細(xì)胞支架，細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合體破裂，粘合素分子傳遞細(xì)胞死亡信號(hào)。實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞與其細(xì)胞外基質(zhì)斷離將通過一種粘合素分子介導(dǎo)的死亡信號(hào)引起凋亡。專家在實(shí)驗(yàn)室中觀察到分離過程中不完全消化時(shí)，胰島包埋在一圈細(xì)胞外基質(zhì)中，其凋亡率很低(＜10％)而高度純化后的胰島有極高的凋亡率(90％)，且前者持續(xù)有良好的胰島素分泌功能。這表明分離的胰島移植物高度無活性和功能缺失，如果在分離過程中加入了纖維連接蛋白，可減少游離胰島的凋亡，胰島存活率可達(dá)到90％以上，數(shù)量較多，體積較大。這些大塊的胰島細(xì)胞團(tuán)植入時(shí)不易因門靜脈血流或壓力而丟失。
本發(fā)明的工藝線路圖為
具體實(shí)施方案本發(fā)明以下結(jié)合具體步驟過程進(jìn)一步描述如下一、異種胰島的選擇1.新生仔豬胰島的特性(1)人和豬的胰島素分子都具有A鏈和B鏈，都是由51個(gè)氨基酸組成。A鏈含21個(gè)氨基酸，B鏈含30個(gè)氨基酸。并且A、B鏈之間都有雙硫鏈連接。結(jié)構(gòu)極為相似，不同的只有一個(gè)氨基酸之差。人胰島素B鏈第30位氨基酸為蘇氨酸。豬胰島素B鏈第30位氨基酸為丙氨酸。(2)豬胰島素用于臨床治療I型糖尿病患者已有十多年歷史，充分證明了豬胰島素用于人后的安全性和有效性。(3)新生豬胰島免疫原性弱，產(chǎn)生排斥反應(yīng)小。(4)豬胰島細(xì)胞在含有人新鮮血清培養(yǎng)基里能很好地存活及增值。表明人的血清對(duì)豬胰島無細(xì)胞毒作用，有利于移植后的訓(xùn)化、誘導(dǎo)及生長(zhǎng)。(5)剛出生小豬特別是胰腺細(xì)胞還未分化完成。在異境環(huán)境培養(yǎng)，發(fā)揮新生豬的可塑性。(6)新生豬與外界接觸少，只要母系、父系沒有人、畜共患傳染病，新生豬就不會(huì)有傳染病，但新生仔豬的母、父系要有系譜、病歷、體檢、防疫檔案。有法定有關(guān)部門認(rèn)可后，方可應(yīng)用。
2.生物安全性措施(1)動(dòng)物細(xì)胞從離體到培養(yǎng)必須在短時(shí)間內(nèi)完成，但為了人類安全，新生仔豬在取胰、處死前還要作病毒抗體檢查(肝炎病毒、免疫缺陷病毒、巨細(xì)胞病毒)。(2)胰島細(xì)胞在培養(yǎng)過程中要跟蹤檢測(cè)、注意異常情況發(fā)生。(3)在胰島移植前對(duì)微囊的機(jī)械性能，生物膜對(duì)大分子的控制性；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、胰島細(xì)胞本身代謝產(chǎn)物的通透性；細(xì)胞的形態(tài)、純度、數(shù)量、胰島素的釋放量等都要認(rèn)真檢測(cè)，作出記錄。
二、新生仔豬解剖前處理1.體檢、編號(hào)、稱重、來源、性別、身體狀況、器官、四肢是否異常、體溫、病毒抗體檢查。
2.用自來水洗去體表污染物。
3.用酒精在體表消毒。
4.用滅菌的紗布包裹。
5.通過傳遞窗進(jìn)入無菌解剖室。
三、新生仔豬解剖取胰腺1.在無菌狀態(tài)下，用氯胺酮將仔豬麻醉，腹腔內(nèi)注射(每公斤體重用量17mg)。
2.將新生仔豬固定在解剖臺(tái)上(寬*深*高)1200×750×860mm。
3.剖腹首先檢查仔豬麻醉程度，體溫、心跳、呼吸是否正常，然后按手術(shù)常規(guī)進(jìn)行消毒、剖腹。沿十二指腸系膜，找出胰腺。<1>稱重作記錄。<2>去掉胰頭(粗大端)收集胰體和胰尾(狹窄部分)，稱重，用4℃Hank｀s液洗兩次。
4.在無菌托盤中，用手術(shù)剪除去肉眼可看到的胰島膜、血管、結(jié)締組織。
四、分離胰島1.采用VI6型振動(dòng)式細(xì)胞球珠研磨儀使胰島與其它胰腺部分脫離(研磨10min)。
2.將研磨漿放入Hank｀s液中，過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)。
3.未過網(wǎng)組織再研磨，過網(wǎng)反復(fù)多次，使研磨漿通過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)。
4.將收集的過濾物再4℃，用1500r/min離心5分鐘，收集沉淀物R，棄去上清液。
五、純化用葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心，操作如下1、用15ml、27％的Dextrna與沉淀物R充分混勻，在此基礎(chǔ)上緩慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank｀s；2、用4℃、600r/min離心4min；3、然后加速到2500r/min離心10min；4、收集11％-23％兩層的胰島細(xì)胞；5、用RPMI-1640液洗兩次，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀S6、將細(xì)胞沉淀S與10mlRPMI-1640混勻，取樣鏡檢，觀察胰島形態(tài)、活性、純度、數(shù)量、成活率；7、從分離到純化結(jié)束應(yīng)控制在4-6小時(shí)。
六、胰島計(jì)數(shù)1.將梯度離心收集的胰島細(xì)胞沉淀用雙硫腙(DTZ)溶液雙硫腙10mg；99.5％二甲基亞楓3ml；25％氨水50μl進(jìn)行染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)(鏡下胰島細(xì)胞呈紅色或腥紅色，形狀呈圓形，胞漿豐滿桔黃色，半透明，邊緣清晰，其它組織和細(xì)胞不著色，對(duì)比非常鮮明)胰島細(xì)胞直徑50-300μm，大小不等，重復(fù)取樣三次計(jì)數(shù)，求平均值。
2.用臺(tái)盼蘭染色判別胰島死活，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞呈蘭色。(鏡下觀察)。
3.一個(gè)患者一次移植需要36-40萬個(gè)胰島。(約有20-25頭新生仔豬胰腺提供)。
七、胰島微囊技術(shù)
將36-40萬個(gè)活胰島細(xì)胞用靜電高壓微囊發(fā)生儀采用A-P-A微囊技術(shù)制成微囊胰島細(xì)胞(參考文獻(xiàn)《(國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊(cè)》，2000年第27卷第2期P75-77)。
微囊胰島形態(tài)學(xué)鑒定(1)光鏡檢查，微囊直徑應(yīng)為0.25-0.35mm(2)在37℃恒溫水浴振蕩儀中以150次/min經(jīng)振蕩24小時(shí)觀察微囊破損率(3)熒光染色用等滲磷酸鹽緩沖液配制啶橙(AO)670μmol/L和碘丙啶(PI)750μmol/L儲(chǔ)存液置4℃儲(chǔ)存，臨用前配成(AO)濃度為0.67μmol/L和(PI)濃度為57μmol/的混合液進(jìn)行染色，活細(xì)胞呈綠色且看到熒光，死細(xì)胞呈紅色，之間區(qū)別很明顯。
(4)胰島計(jì)數(shù)的公式N＝用微量加樣器定量吸取懸液的微升數(shù)(5)純化后胰島回收公式回收率＝純化后鏡檢胰島數(shù)/純化前鏡檢胰島數(shù)×100％(6)胰島純度估計(jì)以倒置顯微鏡下胰島數(shù)與外分泌組織細(xì)胞數(shù)量之比來估算純度。
八、微囊胰島細(xì)胞培養(yǎng)1.在恒溫37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)換一次培養(yǎng)液，定期取培養(yǎng)液測(cè)定胰島素含量。觀察胰島細(xì)胞在微囊內(nèi)分化、生長(zhǎng)、分泌胰島素功能來判定終止培養(yǎng)時(shí)間。
2.RPMI-1640培養(yǎng)液，加入纖維連接蛋白進(jìn)行無血清培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁結(jié)團(tuán)生長(zhǎng)、分化。
九、培養(yǎng)好的胰島，最好要當(dāng)天移植，冷藏對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、移植有一定影響。
權(quán)利要求
1.一種可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下工藝步驟(1)、胰島細(xì)胞供體的選擇供體選擇剛出生、未哺乳健康仔豬，無菌下開腹取胰腺，去除包膜、血管、結(jié)締組織并置4℃ Hank`s液中；(2)、胰島細(xì)胞的分離及純化通過機(jī)械研磨使胰島與外分泌組織分離。再通過Dextran不連續(xù)密度梯度離心，得到胰島細(xì)胞，取樣鏡檢形態(tài)、活性純度、數(shù)量、成活率，從分離到純化結(jié)束時(shí)間控制在4-6小時(shí)；(3)、胰島細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用無血清微球載體進(jìn)行培養(yǎng)，采用RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中不含牛血清，并加入纖維連接蛋白(FN)，加入量按培養(yǎng)基體積每升加FN 5---30mg，在培養(yǎng)過程中，將胰島細(xì)胞包于A-P-A生物膜內(nèi)形成微球，適時(shí)檢測(cè)微囊形態(tài)、活性、計(jì)數(shù)，在恒溫37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)換一次培養(yǎng)液，定期取培養(yǎng)液測(cè)定胰島素含量；觀察記錄胰島細(xì)胞在微囊內(nèi)分化、生長(zhǎng)、分泌胰島素功能來判定終止培養(yǎng)時(shí)間，最終得到活性好、純度高的微囊新生仔豬胰島細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于所述仔豬為剛出生24小時(shí)內(nèi)且系雜交后代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于胰島細(xì)胞的分離及純化的具體步驟為①分離胰島a、采用VI6型振動(dòng)式細(xì)胞球珠研磨儀使胰島與其它胰腺部分脫離，研磨10min；b、將研磨漿放入4℃Hank`s液中，過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)；c、未過網(wǎng)組織再研磨，過網(wǎng)反復(fù)多次，使研磨漿通過500μm金屬不繡鋼網(wǎng)；d、將收集的過濾物在4℃環(huán)境中，用1500r/min離心5分鐘，收集沉淀物R，棄去上清液；②純化用葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心，操作如下a、用15ml、27％的Dextrna與沉淀物R充分混勻，在此基礎(chǔ)上緩慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank`s；b、用4℃600r/min離心4min；c、然后加速到2500r/min離心10min；d、收集11％-23％兩層的胰島細(xì)胞；e、用RPMI1640液洗兩次，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀S；f、將細(xì)胞沉淀S與10mlRPMI1640混勻，取樣鏡檢，觀察胰島形態(tài)、活性、純度、數(shù)量、成活率；g、從分離到純化結(jié)束時(shí)間控制在4-6小時(shí)。
全文摘要
一種可修復(fù)仔豬胰島細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下工藝步驟(1).供體的選擇供體選擇剛出生、未哺乳健康仔豬，無菌下開腹取胰腺，去除包膜、血管、結(jié)締組織并置4℃ Hank`s液中；(2).胰島細(xì)胞分離及純化通過機(jī)械研磨使胰島與外分泌組織分離。再通過Dextran不連續(xù)密度梯度離心，得到胰島細(xì)胞；(3).胰島細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無血清微球載體進(jìn)行CO
文檔編號(hào)C12N5/071GK1920009SQ200610107058
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日
發(fā)明者張俊英, 王斌, 王章存, 范清堂 申請(qǐng)人:鄭州福恩生物工程技術(shù)有限公司