專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的dna疫苗及其用途的制作方法
一種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗及其用途 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1 ( + )有效連接的CC0L2A1基因(SEQ ID冊(cè)1)。本發(fā)明還 涉及含有與真核表達(dá)栽體pcDNA3. l( + )有效連接的CC0L2A1基因(SEQ ID NO : l)組成的重組表達(dá)栽體。本發(fā)明還涉及所述重組核酸構(gòu)建體用 于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DM疫苗的用途，以及包含上述重組核酸 構(gòu)建體的治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步的還涉及治療 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的所述DNA疫 苗。發(fā)明背景類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以'艮性侵蝕 關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病。近年來(lái)國(guó)外趨向于將對(duì)免疫調(diào)節(jié) 作用的藥物作為治療RA的第一線(xiàn)藥，并對(duì)RA新的免疫治療策略進(jìn)行 了廣泛的探索。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，II型膠原(CII)可誘發(fā)膠原性 關(guān)節(jié)炎(CIA),出現(xiàn)與RA類(lèi)似的病理表現(xiàn)。這些研究提示，CII是 誘導(dǎo)RA發(fā)病的主要自身抗原之一。通過(guò)給予CII抗原誘導(dǎo)免疫耐受， 是國(guó)際上興起的治療自身免疫病RA的特異性免疫療法之一，這些免疫 耐受的機(jī)制包括主動(dòng)抑制、克隆無(wú)能、克隆清除以及旁觀者抑制等， 這還有可能不是其全部的機(jī)制。其中有通過(guò)口服膠原，靜脈、肌肉、 皮下注射膠原等方法治療CIA模型鼠取得很大成功，但在臨床實(shí)驗(yàn)中 治療效果遠(yuǎn)不如動(dòng)物模型中的治療效果，其中的限制因素主要是抗原 的用量、種類(lèi)來(lái)源、性質(zhì)、抗原呈遞處理過(guò)程、宿主的遺傳背景等。目前國(guó)際上探索免疫耐受治療RA所采用的CII均是天然提取制備 的，很難保證產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，也缺乏正確的空間 構(gòu)象和適當(dāng)?shù)男揎?。因此，這樣的免疫原缺少在構(gòu)象上相關(guān)的表位，難以誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于天然抗原的免疫耐受。而且，cn作為蛋白質(zhì)在體內(nèi)存在半衰期短，病人需要重復(fù)給藥的缺點(diǎn)，這也限制了cn的大規(guī)模 使用。采用DNA疫苗可以成功克服上述缺陷。DNA疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)的免 疫策略具有的優(yōu)勢(shì)包括(l)免疫效果好。DNA疫苗不需要提取CII，也 不需要在體外原核或真核表達(dá)CII，也不需要對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化、 加工。CII基因直接在宿主體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和后加工，能更完整地得到 產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)和抗原性，也就是在宿主內(nèi)有正確的空間結(jié)構(gòu)和適當(dāng) 的修飾；U)易操作性和穩(wěn)定性。DM序列清楚，純化技術(shù)簡(jiǎn)便，質(zhì)量 易于控制。(3)外源基因在體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，不斷表達(dá)外源蛋白，因 此它可以持續(xù)給免疫系統(tǒng)提供刺激，無(wú)需重復(fù)施用蛋白質(zhì)抗原；(4)能 用各種投遞疫苗的方法。如直接或脂質(zhì)包裹后肌肉內(nèi)注射，基因皮下 槍接種，氣槍肌肉接種，以氣溶膠方式吸入或鼻內(nèi)滴入，利用細(xì)胞內(nèi) 細(xì)菌傳送DM疫苗，利用病毒鼻內(nèi)傳遞DM疫苗以及經(jīng)包裝后口服等。 (5)具有熱穩(wěn)定性，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)，它不需特別的冷藏 系統(tǒng)，可以加工成干燥的小顆粒，便于貯藏和運(yùn)輸。(6)規(guī)模化生產(chǎn)， 成本低廉。由于其易操作性和穩(wěn)定性，也決定了 D1U疫苗生產(chǎn)成本相 對(duì)低廉，這就為DNA疫苗在發(fā)展中國(guó)家的大規(guī)模使用鋪平了道路。本發(fā)明人在大量研究基礎(chǔ)上采用雞的II型膠原(CCII )基因制備 所述DNA疫苗，其表達(dá)產(chǎn)物CCII與其它物種來(lái)源的CII相比在很多方 面具有優(yōu)勢(shì)(1)富含大量的硫酸軟骨素A和粘蛋白，而粘蛋白中的 硫酸葡糖胺含量最高，它們有著強(qiáng)有力的抗炎作用和軟骨修復(fù)作用； (2)CCII能有效防止蛋白酶對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的消化破壞，重新編程已被 破壞的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞因子，從而減少炎癥的發(fā)生；(3)CII能促進(jìn) 軟骨細(xì)胞及粘蛋白的合成，增加關(guān)節(jié)滑液及透明質(zhì)酸的分泌；(4)CII是強(qiáng)有力的抗炎劑和疼痛緩解劑；(5) cn治療十分安全無(wú)明顯毒副作用，這也是目前任何其它治療RA藥物所不能比擬的.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人在成功獲得雞全長(zhǎng)CII基因cDNA的基礎(chǔ)上，選擇真核表 達(dá)載體，例如pcDM3. 1或者腺病毒作為載體，成功構(gòu)建治療性疫苗用 于治療RA。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與 表達(dá)調(diào)控序列有效連接的CC0L2A1基因(SEQIDN0: 1)。在本發(fā)明中， 所述表達(dá)調(diào)控序列用于在真核宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)CC0L2A1基因的有效表 達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以雞II型膠原(CCII)誘導(dǎo)的 Wistar大鼠為RA模型即CIA， 一次性尾部靜脈注射20pg/kg、 200|ig/kg 、 400ng/kg三個(gè)不同劑量pcDNA-CC0L2Al基因疫苗對(duì)CIA 關(guān)節(jié)炎的治療作用，結(jié)果表明在注射后笫5天200ng/kg組就可觀察 到大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕，與空載體組比較有顯著性差異(p<0.05)，而20pg /kg、 400網(wǎng)/kg兩劑量組與空栽體組比較則未 觀察到治療效果(p>0. 05)。放射影象學(xué)和組織病理學(xué)檢查顯示，上 述實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)200ng/kg治療后，使關(guān)節(jié)軟骨及其下面的骨小 梁結(jié)構(gòu)與正常組接近，關(guān)節(jié)軟骨及其下面的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)得到保護(hù)，可使 炎癥分?jǐn)?shù)下降為對(duì)照組的50%,僅關(guān)節(jié)滑膜略有增生，與空載體組比 較具有顯著性差異(代O. 05);而20pg /kg和400ng /kg兩劑量組 與空栽體組比較則未觀察到任何治療效果(》0.05)。 注射后6周 CIA大鼠血清中抗CII抗體濃度水平、TNF-a濃度在200jig/kg治療組 較空栽體組明顯降低(p<0.05),而400pg /kg組則顯著的升高， 20jag/kg組則無(wú)明顯變化。此外，細(xì)胞因子TGF-P、 IL-10濃度水平 在200ng/kg組較空栽體組明顯升高(p<0. 05 )，而20^g/kg與400pg/kg 兩組則無(wú)顯著性差異。脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，200ng/kg劑量 pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治療組大鼠脾細(xì)胞對(duì)CII的反應(yīng)能力較空栽 體組明顯下降(p<0. 05 ),此結(jié)果表明，200ng/kg劑量pcDNA-CC0L2Al 基因疫苗能明顯抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，降低抗CII抗體、TNF-ot水平，提高細(xì)胞因子TGF-P、 IL-10水平，降低脾細(xì)胞增殖反應(yīng)能 力，對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎有顯著的治療作用，有望在RA的基因免疫耐受 治療中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。在本發(fā)明的另 一方面，涉及一種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗， 其包含前述本發(fā)明所構(gòu)建的含有與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的CC0L2A1 基因(SEQ ID NO : l)的重組核酸構(gòu)建體。具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將克隆的CC0L2A1基因 4837bp全長(zhǎng)cDNA連接于真核表達(dá)載體pcDM3. 1 ( + )上，獲得重組 真核表達(dá)栽體pcDM-CC0L2Al，即CC0L2A1基因疫苗。用于本發(fā)明的"基因疫苗"指用于治療或預(yù)防人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的基因治療藥物，這是基于雞II型膠原的藥理學(xué)活性。宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的重組表達(dá)栽體進(jìn)行遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn) 化或轉(zhuǎn)染)的，載體可以是一個(gè)克隆栽體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì) 粒、病毒粒子、噬菌體等等。工程化的宿主細(xì)胞能在為適于活化啟動(dòng) 子、篩選轉(zhuǎn)化子或表達(dá)CC0L2A1基因而改變的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件諸如溫度、PH等與被選擇的細(xì)胞原來(lái)所用的表達(dá)條件一致， 對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很明顯的。本發(fā)明所述CC0L2A1全長(zhǎng)cDNA可以存在于一系列表達(dá)載體上，這 些栽體包括染色體的、非染色體的和合成的DM序列，例如，SV40的 衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA 結(jié)合的載體、病毒DM、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及 偽狂犬病毒。不過(guò)，只要能在宿主中復(fù)制和表達(dá)目標(biāo)基因，其它栽體 也可以利用。通常，為實(shí)現(xiàn)表達(dá)栽體中的目標(biāo)序列的高效表達(dá)，其被有效地與 一個(gè)合適的表達(dá)調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，終止子等)連在 一起，從而指導(dǎo)mRM的合成。下面提到的是這種啟動(dòng)子的代表LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌 的Lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體的PL啟動(dòng)子以及已知控制真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。此外，表達(dá)栽體優(yōu)選包含能提供表 型特征的一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選，例 如真核細(xì)胞的培養(yǎng)可用二氫葉酸還原酶或新霉素抗性。包含上述合適的目標(biāo)基因序列、合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體 可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，讓宿主表達(dá)該蛋白。特別值得提及的是，本發(fā)明也包括含上面概括性描述的一個(gè)或多 個(gè)序列的重組核酸構(gòu)建體。該重組核酸構(gòu)建體包括栽體，如質(zhì)?；虿?毒載體，其中正向或反向插入了本發(fā)明的一個(gè)序列。在此實(shí)施方案的 一個(gè)優(yōu)選方面，該重組核酸構(gòu)建體還包含調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子，它 被有效地連接到該序列上。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，許多栽體和啟動(dòng)子都是已知的，并可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。下面列舉幾種栽體。pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG (Stratagene)、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL (Pharmacia)。不過(guò)，只要是能在宿主中復(fù)制和存活，其它質(zhì)粒 或載體也可應(yīng)用。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶、早期和晚 期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。合適載體和啟動(dòng)子 的選擇應(yīng)在本領(lǐng)域普通的技術(shù)水平之內(nèi)。在合適的啟動(dòng)子控制下可以在哺乳類(lèi)細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì) 胞中表達(dá)成熟蛋白。利用由本發(fā)明的DM構(gòu)建體衍生的RNA，也可以 用無(wú)細(xì)胞翻譯體系產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。適合于原核和真核宿主的克隆和 表達(dá)載體Sambrook等人已在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版，冷泉港 出版社，紐約，1989 )中進(jìn)行了描述.在高等真核生物中，編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)在載 體中插入一增強(qiáng)子序列而被提高.增強(qiáng)子是DM的順式作用因子，通 常有大約10-300bp，作用于啟動(dòng)子，提高它的轉(zhuǎn)錄。例如，SV40的位 于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)100-270bp處的增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng) 子、位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子及腺病毒增強(qiáng)子。哺乳類(lèi)表達(dá)栽體包括復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子及任何必 需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺普化位點(diǎn)、拼接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終 止序列和5，側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。衍生于SV40拼接序列的DM序列和多 腺苷化位點(diǎn)可用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件.
按本發(fā)明所述，將雞II型膠原編碼基因?qū)爰?xì)胞，所述基因在這 些細(xì)胞表達(dá)后表現(xiàn)出藥理學(xué)活性。因此，本發(fā)明的藥物可有效地用于 例如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。為了將本發(fā)明所述雞II型膠原編碼基因?qū)爰?xì)胞，也可以使用病 毒載體的方法。具體的，所述方法由例如下列步驟組成，將雞II型膠 原編碼基因?qū)肜缒孓D(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、新培斯病毒或其它RM病毒。這些病毒 中，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒優(yōu)選用于本發(fā)明雞II型膠原編 碼基因的導(dǎo)入。其他用于導(dǎo)入雞II型膠原編碼基因方法的例子包括脂質(zhì)體法、脂 轉(zhuǎn)染法、微注射法、磷酸鈣方法、電穿孔法。這些方法中，優(yōu)選使用 月旨質(zhì)體法。在雞II型膠原編碼基因作為基因疫苗的實(shí)際應(yīng)用中，將所述雞 II型膠原編碼基因直接導(dǎo)入機(jī)體(體內(nèi)方法)是非常有利的方法。另 外，也可以從人類(lèi)中收集某種細(xì)胞，將雞II型膠原編碼基因?qū)塍w外 細(xì)胞，再將導(dǎo)入雞II型膠原編碼基因的細(xì)胞重新導(dǎo)入人體(離體方 法)。這些方法在下列文獻(xiàn)中有所描述NIKKEI Science ， 1994年4 月，20 - 45頁(yè)；GEKKAN YAKUJI ， 36 (1) ， 23-48 ( 1994 )和其中所 引的參考文獻(xiàn)?？梢罁?jù)待治療的疾病、靶器官等適當(dāng)?shù)剡x擇這些方法， 并應(yīng)用本發(fā)明的基因疫苗。當(dāng)本發(fā)明所述基因疫苗采用fi^方法給藥時(shí)，藥物可根據(jù)待治療 的疾病、靶器官等通過(guò)任何合適的途徑給藥。藥物可通過(guò)靜脈、動(dòng)脈、 皮下、肌肉等給藥或直接給藥至疾病的靶器官，如腎、肝、肺、腦、 神經(jīng)等。通常，直接給藥至靶點(diǎn)可以有選擇地治療靶器官。上面描述的M方法可用于雞II型膠原編碼基因的導(dǎo)入，例如， 人類(lèi)細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或造血干細(xì)胞)用常規(guī)方法收集后再用本發(fā)明 藥物致敏以導(dǎo)入基因。然后將雞II型膠原編碼基因生產(chǎn)細(xì)胞返回人 體.當(dāng)用體內(nèi)方法施用藥物時(shí)，該藥物可采用多種制劑方式，包括液8
體制劑形式。 一般而言，藥物優(yōu)選制成一含有雞n型膠原編碼基因作 為活性組份的注射液。如果必要，常規(guī)載體可加入到藥物組合物中。 可通過(guò)常規(guī)方法制備注射液，如將雞n型膠原編碼基因溶解在適當(dāng)?shù)?溶劑里(如無(wú)菌水，緩沖溶液，生理鹽水等)，通過(guò)濾器過(guò)濾等方法 進(jìn)行滅菌，將溶液裝入滅菌容器中。該藥物的制備中可用含雞n型膠 原編碼基因的病毒載體代替雞ii型膠原編碼基因本身。當(dāng)使用含有包埋雞II型膠原酶編碼基因(或HVJ-脂質(zhì)體)的脂質(zhì)體時(shí)，藥物可以是脂質(zhì)體制劑的形式，如懸浮液、冷凍制劑、離心濃縮冷凍制劑等。 基因疫苗中雞n型膠原編碼基因的含量可隨待治療疾病、靶器 官、病人的年齡和體重等的變化而改變。然而，在以雞n型膠原編碼基因計(jì)算時(shí)，適宜劑量為0. OOOlmg到100mg，優(yōu)選0. OOlmg到10mg。 該劑量可分為幾天或幾個(gè)月服用。


圖1. pcDNA-CC0L2Al真核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。 圖2.顯示pcDNA-CC0L2A1真核表達(dá)載體的酶切分析結(jié)果。其中 泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道2為HindIII + EcoR酶切 pcDNA-CC0L2A1;泳道3為DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道4為Hind III酶切 pcDNA-CC0L2Al。圖3A.為15 %的SDA-PAGE電泳分析CC0L2A1基因表達(dá)的結(jié)果， 其中泳道l為20pg pcDNA3. 1;泳道2為20pg pcDNA- CC0L2A1;泳 道3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照；圖3B. Western-blot分析CC0L2Al基因表達(dá)的 結(jié)果，其中泳道l為20ngpcDNA3. l;泳道2為20pg pcDNA-CC0L2A1; 泳道3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照。圖4.顯示真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治療后 CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化。圖5顯示pcDM-CC0L2Al用作基因疫苗治療后，各組間CIA大鼠 后足踝關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)改變(HE染色，40X)，箭頭所示關(guān)節(jié)腔破 壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管錄形成、軟骨破壞情況。圖6顯示pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治療后，對(duì)CIA大鼠后足 組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)的影響，其中6A顯示各組后足踝關(guān)節(jié)炎癥的組織分?jǐn)?shù) 情況；6B顯示各組后足血管翳形成和軟骨破壞分?jǐn)?shù) 圖7顯示pcDM-CC0L2Al用作基因疫苗治療后，對(duì)CIA大鼠后足 X光放射影象學(xué)的影響。其中箭頭所示為軟組織腫脹，骨關(guān)節(jié)、軟骨 破壞情況以及關(guān)節(jié)間隙的清晰度。圖8顯示pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治療后，對(duì)CIA大鼠后足 放射學(xué)分?jǐn)?shù)的影響。圖9. nCCII對(duì)CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。以下結(jié)合具體實(shí)施方式
說(shuō)明本發(fā)明。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果數(shù)據(jù)以；土s 表示，應(yīng)用SPSS11. 0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)兩兩比較采用Student t 檢驗(yàn)，而多組之間比較則用ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)施例實(shí)施例1重組真核表達(dá)栽體pcDNA-CC0L2Al的構(gòu)建公開(kāi)于GenBank-accession numbers AY046949的雞II型膠原全 長(zhǎng)cDNA，通過(guò)PCR方法從質(zhì)粒pPIC9K-CCOL2Al (本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存) 獲得。將所得編碼雞II型膠原全長(zhǎng)cDNA，連接到測(cè)序栽體 pGEM-T-easy，測(cè)序正確后再連接到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen， USA)即pcDNA-CC0L2Al。為了4吏CC0L2A1獲得高表達(dá)， 在起始密碼ATG 前加入了信號(hào)肽序列N0:4)和Kozak序列(GTTATGG， SEQ ID NO: 5)，并在設(shè)計(jì)引物時(shí)加入 EcoR I 與Hind III 兩個(gè)酶切位點(diǎn)。引物 1 : 5 ， AAGCTTGTTATGGATATGCATGGA CGTCGTCCACCACGTTCCGCCGC T C -TCCTCCTC3，(SEQ ID NO: 2 );引物2: 5， GAATTCTTACAAGAA GCAGACTGGGCC3， (SEQ ID NO: 3)。具體的，所得真核表達(dá)栽體pcDNA-CC0L2Al由CMV啟動(dòng)子和雞 II型膠原基因CC0L2A1組成，構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。將真核表達(dá)栽體 pcDM-CC0L2Al經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切可見(jiàn)4. 3kb的CC0L2A1
及5. 4kb的pcDM3. 1兩條電泳帶，與插入的目的基因片斷和載體大 小相一致，而用HindlII單酶切，則可見(jiàn)9. 7kb —條電泳帶(見(jiàn)圖2)， 由此表明，pcDNA-CC0L2Al真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。實(shí)施例2真核表達(dá)栽體pcDNA-CC0L2Al在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)重組真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2Al的瞬時(shí)表達(dá)分析方法按照 LipofecUMINETM 2000試劑盒(購(gòu)于GIBCOBRLR)說(shuō)明，將30ngDNA 轉(zhuǎn)染到C0S-7細(xì)胞(106)中，在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，換 成含G418 ( 500ng/ml)的培養(yǎng)液篩選獲得陽(yáng)性克隆。擴(kuò)增培養(yǎng)陽(yáng)性克 隆收集其培養(yǎng)液(每天一次，連續(xù)兩天)。真空干燥后，將其溶解入 0. lmol/L的冰醋酸中。取100ng蛋白上樣，經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含10% 小牛血清封閉液封閉，加入1: 1000稀釋的抗CCII單抗41C醉育過(guò)夜， 爾后再用1: 2000稀釋的酶標(biāo)二抗IgG孵育37iCl~2h。洗膜后，將 膜浸入10ml堿性磷酸酶底物緩沖液與33pl四唑氮藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氟-3-吲味砩酸(BCIP)制成的顯色液，室溫閉光顯色20min， 蒸餾水終止反應(yīng)，Cold-Spring凝膠成像系統(tǒng)掃描顯像。根據(jù)上述方法，將真核表達(dá)載體pcDNA-CCOL2Al轉(zhuǎn)染到COS-7 細(xì)胞(106)中。經(jīng)G418篩選后，培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，收獲、濃縮、真空干 燥培養(yǎng)液，然后再溶解在0.1 mol/L的乙酸中。產(chǎn)物經(jīng)15%SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，在大約143kD左右處有一電泳條帶，與 質(zhì)粒pcDM-CC0L2Al基因表達(dá)的CCII蛋白相對(duì)應(yīng)，而僅轉(zhuǎn)染pcDM3. 1 空栽體的細(xì)胞培養(yǎng)液中則沒(méi)有特異性條帶出現(xiàn)。Western-Blot分析證 明，在約143kD左右亦可見(jiàn)到特異性反應(yīng)條帶。由此證明重組真核表 達(dá)栽體pcDNA-CC0L2Al在C0S-7細(xì)胞中能夠有效表達(dá)CCII多肽鏈a亞 單位，而且是分泌型表達(dá)。實(shí)施例3真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗對(duì)CIA大 鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的影響選擇雌性Wistar大鼠(190+ 15g)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其購(gòu)于北京軍 事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中， 1。 CIA大鼠的誘發(fā)17]: 雌性Wistar大鼠70只，隨機(jī)取8只作正常 對(duì)照，其余大鼠均用于建立CIA模型。具體建模方法是將雞II型 膠原(SIGMA公司)用0. Olmmol/L的冰醋酸溶解后，配成4mg/ml的 溶液，加等體積完全福氏佐劑(CFA)，使終濃度為2mg/ml。以0. lml /只在尾根部和背部多點(diǎn)注射， 一周后從腹部注射0. lml /只加強(qiáng)免疫 一次。加強(qiáng)免疫后一周，CIA發(fā)病率為73% ( 45/62 )。2。核酸免疫隨機(jī)抽取40只CIA關(guān)節(jié)炎大鼠分成5組(每組 8只)，各組之間的關(guān)節(jié)指數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無(wú)顯著性.5組分別為 ①空栽體注射組；②20ng/kg基因疫苗治療組；(D200|ig/kg基因疫苗 治療組；④400^ig/kg基因疫苗治療組；⑤關(guān)節(jié)炎組(空白對(duì)照)?？?載體和治療栽體都分別溶解在200nl PBS緩沖液中，關(guān)節(jié)炎組也注射 同樣量的PBS，均采取尾靜脈注射方法。分別從CIA大鼠尾靜脈注射20pg/kg、 200|ng/kg 、 400ng/kg真 核表達(dá)栽體pcDM-CCOL2Al作為基因疫苗，同時(shí)設(shè)200ng/kg的 pcDNA3. 1空栽體組和不給藥的關(guān)節(jié)炎組作對(duì)照。四肢關(guān)節(jié)腫脹評(píng)估""四肢關(guān)節(jié)腫脹程度按0~4級(jí)評(píng)分0.無(wú) 腫脹；1.趾關(guān)節(jié)稍腫；2.小趾關(guān)節(jié)和足趾胂脹；3.踝關(guān)節(jié)以下足 爪腫脹；4.包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。每一CIA關(guān)節(jié)炎大鼠的 關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)為四肢關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)之和，最大可達(dá)16分。給藥后連續(xù)一個(gè)月觀察大鼠關(guān)節(jié)變化并打分即可獲得關(guān)節(jié)炎指 數(shù)，結(jié)果詳見(jiàn)圖4。由此可見(jiàn)，空載體組和20pg/kg基因疫苗組間治 療效果無(wú)區(qū)別，而200^g/kg基因疫苗組與空栽體組間療效則有顯著 性差異"P〈0.05)，相反400jLig/kg的高劑量組中關(guān)節(jié)炎指數(shù)卻有升 高。實(shí)施例4真核表達(dá)栽體pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗對(duì)CIA大鼠 后足組織病理學(xué)的作用
組織病理學(xué)檢查按規(guī)定處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取后足炎性踝關(guān)節(jié)作標(biāo) 本，以10%曱醛溶液固定、脫釣、脫水、切片、HE染色，觀察炎性關(guān) 節(jié)組織的病理改變。根據(jù)炎癥程度對(duì)滑膜炎癥、血管翳和軟骨破壞進(jìn) 行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下滑膜下炎癥，0分正常、l分局灶性炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)、2分彌漫性炎癥細(xì)胞增生；血管翳和軟骨破壞，0分正 常、l分血管發(fā)覆蓋軟骨，但無(wú)軟骨破壞、2分有血管錄和軟骨破 壞。pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治療各組間CIA大鼠后足踝關(guān)節(jié)的 組織病理學(xué)改變及其評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6,由圖5可見(jiàn)，注射 200ng/kg pcDNA3. l對(duì)照組，大鼠后足有明顯的血管發(fā)形成，滑膜增 生和大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨變薄且失去完整性，幾乎觀察不到 完整的骨小梁，骨髄腔部為分布有大量破骨細(xì)胞。20ng /kg、 400ng /kg 治療組與關(guān)節(jié)炎對(duì)照組表現(xiàn)類(lèi)似。而200ng /kg治療組關(guān)節(jié)軟骨及其 下的骨小梁結(jié)構(gòu)與正常組接近，但關(guān)節(jié)滑膜有一定程度的增生。由此 表明在所選擇的20網(wǎng)/kg、 200網(wǎng)/kg 、 400ng /kg 3種基因疫苗治 療劑量中，200網(wǎng)/kg劑量組對(duì)CIA大鼠后足踝關(guān)節(jié)的炎癥以及軟骨 和骨的破壞的抑制作用最為明顯，可使炎癥分?jǐn)?shù)下降為對(duì)照組的50% (*P<0. 05)。實(shí)施例5真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗對(duì)CIA大鼠 后足作用的放射影象學(xué)結(jié)果影象學(xué)檢查腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，對(duì)大鼠后肢行側(cè)位X 線(xiàn)檢查，由一位不了解此項(xiàng)目研究具體內(nèi)容的放射科人員對(duì)全部關(guān)節(jié) 炎后足X線(xiàn)進(jìn)行放射學(xué)評(píng)分。具體標(biāo)準(zhǔn)0分無(wú)損害表現(xiàn)、l分輕 度的骨質(zhì)疏松和骨膨脹表現(xiàn)、2分關(guān)節(jié)間隙減小、3分明顯的骨與 關(guān)節(jié)軟骨損害并伴隨關(guān)節(jié)間隙減小、4分關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)消失、骨贅形成 和釣化。pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治療各組間CIA大鼠后足踝關(guān)節(jié)X 光放射學(xué)表現(xiàn)及評(píng)分結(jié)果詳見(jiàn)圖7和圖8.在關(guān)節(jié)炎組可見(jiàn)，軟組織
腫脹，骨關(guān)節(jié)邊緣模糊，軟骨破壞。而在所選擇的三種治療劑量組中，只有200pg/kg治療組治療效果最明顯(*代0.05)，可使軟組織腫脹 減輕，關(guān)節(jié)間隙清晰。而20pg/kg和400pg/kg治療組的關(guān)節(jié)軟骨表 面和骨密度與關(guān)節(jié)炎組比較變化不明顯。此外，20pg/kg治療組的放 射學(xué)分?jǐn)?shù)與空載體組類(lèi)似，而400pg/kg治療組的放射學(xué)分?jǐn)?shù)卻稍有升高。實(shí)施例6真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗對(duì)CIA大鼠 脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響制備脾淋巴細(xì)胞懸液按規(guī)程處死受試大鼠，無(wú)菌條件下取其脾 臟，置于RPMI1640培養(yǎng)液中，100目不銹鋼網(wǎng)研磨過(guò)濾，洗滌2次 后配成2 x io7ml懸液加入96孔板。用100jig/ml的nCCII剌激72小 時(shí)后收集培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子水平濃度 的變化。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)常規(guī)制備的大鼠脾細(xì)胞經(jīng)0. 83。/。NH4CL處理 石皮壞紅細(xì)胞，洗滌配成2 x 106/ml懸液，按每孔lOOjil加入96孔板。 淋巴細(xì)胞分成兩組(1)加PHA作試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照，濃度為0、 1、 10、 50、 100、 25(Hig/ml; ( 2 )加nCCII作試驗(yàn)組，濃度為25、 50、 100、 250、 50(Hig/ml，刺激培養(yǎng)72h，采用MTT比色法測(cè)定ABS570nm值。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組CIA大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分別用不同濃度的nCCII 和PHA進(jìn)行刺激，采用上述MTT法測(cè)定其各自的增殖反應(yīng)，結(jié)果如圖 9所示，200ng/kg基因疫苗組的脾淋巴細(xì)胞增殖能力明顯下降，與空 栽體組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05) ; 400ng/kg基因疫苗組脾淋巴細(xì) 胞增殖能力較空栽體組卻有升高現(xiàn)象；其余3組差別不明顯(P>0. 05 )。 而各實(shí)驗(yàn)組在僅加入PHA刺激時(shí)其淋巴細(xì)胞都發(fā)生增殖，但各組之間 差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)，結(jié)果見(jiàn)圖10。實(shí)施例7真核表達(dá)載體pcDM-CC0L2A1用作基因疫苗施用后CIA
大鼠血清中抗CII抗體水平的變化血清中抗n型膠原抗體的檢測(cè)質(zhì)粒注射兩周后，從尾部靜脈 取血，離心后儲(chǔ)藏-20iC備用。本實(shí)驗(yàn)采用商用的ELISA試劑盒(Rats IgG Anti-Type II Collage"ntibody Assay Kit, Chondrex， USA)。結(jié)果CIA大鼠注射pcDNA-CC0L2A1作為基因疫苗后6周，尾部 取血分離血清，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)血清中抗CII抗體濃度的變化， 結(jié)果詳見(jiàn)表1.由此可見(jiàn)200ng/kg基因疫苗組的抗CII抗體水平明顯 低于空載體組(P<0. 05)，而20ng/kg基因疫苗組與空載體組相比變 化不大(P〉0. 05)，但400ng/kg基因疫苗組卻顯著升高(P<0. 05).表1. pcDNA-CC0L2A1作為基因疫苗免疫6周后CIA大鼠血清中 抗CII濃度(n-8， ；土s)______基因質(zhì)粒劑量D(490nm)吸收光密度關(guān)節(jié)炎組1. 365 ± 0. 133空栽體對(duì)照組(100ug )1. 367 ± 0, 21820pg/kg pc瓶-CC0L2Al1.492 ±0.134200叫/kg pcDNA-CC0L2Al0. 674 ± 0. 046*400叫/kg pcDM-CC0L2Al2. 744 ± 0. 600注血清1:1000稀釋?zhuān)c空栽體組比較，*P<0. 05實(shí)施例8真核表達(dá)載體pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗施用后CIA 大鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的變化血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-P 1、 ，-oc、 IL-IO、 IL-4的檢測(cè): 均采用雙抗夾心ELISA試劑盒(R&D Systems, Inc)。為了探討pcDNA-CCOL2A1作為基因疫苗治療CIA大鼠的相關(guān)機(jī)制， 我們采用ELISA檢測(cè)了 pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治療前后CIA大鼠血 清和脾細(xì)胞培養(yǎng)液中幾種相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化.結(jié)果表明，在注 射pcDNA-CC0L2Al基因疫苗后6周，200pg/kg基因疫苗組CIA大鼠 血清中的TGF-p水平明顯增高(P<0.05) ， TNF-ot濃度則顯著降低
(P<0. 05)，而20pg/kg和400ng/kg基因疫苗組以及空載體組間則 無(wú)顯著變化(P>0. 05);此外在各實(shí)驗(yàn)組CIA大鼠血清中我們均沒(méi)能 檢測(cè)到IL-10和IL-4，結(jié)果詳見(jiàn)表2。表3顯示pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治療6周后CIA大鼠脾臟2 x 106/ml經(jīng)100pg/ml的nCCII刺激72小時(shí)后培養(yǎng)液中這幾種細(xì)胞因 子濃度的變化。結(jié)果表明，200網(wǎng)/kg基因疫苗組CU脾細(xì)胞培養(yǎng)液 中的TGF-p和IL-10水平明顯增高(P<0. 05) ， TNF-ct濃度顯著降低(P<0. 05)，而IL-4的濃度在各組之間無(wú)明顯變化(P>0. 05);而上 述細(xì)胞因子在20ng/kg和400ng/kg基因疫苗組以及空栽體組間則無(wú) 顯著變化(P>0. 05)。表2. pcDNA-CC0L2Al基因^苗免疫6周后CIA大鼠血清中細(xì)胞因子濃度的變化(n=8，基因質(zhì)粒劑量TNF-oc,pg/ml TGF-p，pg/ml IL-10，pg/邁l IL-4, pg/ml關(guān)節(jié)炎組66.0± 23.020.6 ±1.700空栽體對(duì)照組(100ug )66. 5 ± 18. 9 20. 4 ±1.60020pg/kg pcDNA-CC0L2Al61. 8 ± 15. 2 22. 2 ±1.500200ng/kg pcDNA- CC0L2A115.1±11.1* 49.3±2.2*00400pg/kg pcDM- CC0L2A171. 5 ±33. 2 24. 8 ±1.700注血清1: 500稀釋?zhuān)c空栽體組比較，*P<0. 05表3. pcDNA-CCOL2Al基因疫苗免疫6周后CIA大鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液 中細(xì)胞因子濃度的變化(n=8， ^s)基因質(zhì)粒刑量TNF-<x，pg/ml TGF-P，pg/邁1 IL-10，pg/mlIL-4， pg/ml關(guān)節(jié)炎組58. 7 ±22.119.6±2. 6140. 7 ±38. 511. 0±2. 5空栽體對(duì)照組(100ug )56. 3 ±19. 820. 3±1.9138. 6 ±20. 610. 8 ±3.120叫/kg pcDM-CCOL2Al50. 8 ±12. 221.6±1.8130. 8 ±33. 210. 6 ±2.12(%g/kg pcDNA- CC0L2A114. 0±9.1*40. 3±5.1*210. 6 ±31.1*12. 2 ±3. 3400pg/kg pcDNA- CC0L2A162. 5 ±27, 223.7±1.6120. 9 ±25. 511. 7 ±3. 3
注脾細(xì)胞通過(guò)lOt^g/ml的nCCII刺激72小時(shí)后收集培養(yǎng)液 與空載體組比較，*P<0. 05 序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 <120> —種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗及其用途 <130> IDC060059 <勝5<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211〉 4844〈212〉 DNA<213〉 artificial<220〉<223〉 cDNA <400〉 1gttatggata tgcatggacg tcgtccacca cgccgcccgc cccgctccgc cgctctcctc accgcgcagg accgcgacct ccgacaacct gatattaaag atgttgtagg accccgaggg cagggacagc g鄉(xiāng)ggaccg tggcgagaag agggatggag犯cccggcac ccctggaaac ggcccccccg gacttggtgg aaactttgcg gcgggtggag CgC卿tggg tgtC3tgC3gccccctggcc ccactggcgc acctggtcccggcgaacccg gcgctgctgg tccgatgggtcccggtgacg atggtgagac aggcaaacccccccagggcg ctcgtggctt ccctgggeictcgttccgccg ctctcctcct catgcacggc 60ctcctcctcc tccttctcac ggccgccgca 120ggcccca,agg gacagaaggg agaacccgga 180cctccaggac cacagggccc agc鄉(xiāng)agag 240gggg卿鄉(xiāng)gtgctcctgg cccccgtggg 300ccaggccccc ccggtccccc cggacctcct 360gcgc卿tgg cgggcggctt cgeitg柳eig 420ggacccatgg gccctatggg accccgcggc 480cagggatttc卿gcaaccc cggtgagccc 540ccccggggac ctccgggacc acctgggaaa 600ggca組ctg gtgaacgtgg cccccccggc 660cctggtctcc ccggagtgaa gggccaccga 720 ggctaccccg gtttggatgg tgccaaagga gaggcggggg ctcctggagc ca柳gtgaa 780tctggttcac cgggtgagaa cggctccccc ggccccatgg gaccccgtgg gctgcccgga 840gagcgaggac gtcccggccc ctccggcgcc gccggtgctc gtggcaatga cggtctccct 900ggccctgctg gaccccctgg acccgtcggc cctgccggag cccccggctt ccccggagcc 960cccggttcaa鄉(xiāng)gtg卿c cggccccact ggtgcacggg gtcccgaggg tgccc卿ga 1020ccccgcggcg犯tccggcac ccccggctct cccggccccg ctggcgcacc cggtaaccca 1080gggactgatg gcatccccgg tgccaagggc tcggcgggtg ccccgggcat tgcaggcgct 1140ccaggattcc ccggcccacg cggccccccc ggaccccaag gtgccaccgg accactggga 1200cccaaaggac agacgggcga acccggcatc gcaggcttca agggcgagca aggaccgaag 1260ggcg卿cgg gccccgcagg acccca鄉(xiāng)t gcccccgggc cggctggtga gg"ggc犯g 1320agaggagctc gtggtgaacc tggtgccgcc ggccctgtgg gcccccccgg agaaaggggc 1380gctcctggca accgtggatt ccccgggcag gacgggctgg ccggacccaa gggtgctcca 1440ggtgaacgcg gccccgctgg tctcgccggt cccaaaggtg ccaccggtga ccccggacgt 1500cccggagagc ccgggctgcc cggagcgagg ggtctcaccg gccgccccgg cgatgcggga 1560cctc犯ggca aagtcggccc犯ctggtgct cctggcgeigg atggccgccc cggccccccc 1620ggacctcagg gtgctcgtgg gcagcctggt gtgatgggtt tccccggtcc caaaggcgct 1680aatggtgagc ctggaaaagc tggagagaaa ggactgcccg gcgccccagg gctgcggggt 1740ctgcctggca aggatgggga gacgggagct gccggccccc ctggacccgc tggtcctgtg 1800ggtgagagag g卿gcaagg agcccccggt ccttccggct tccagggact gcccggacca 1,ccaggtcccc ctgggg卿g cggcaaaccc gg柳ccagg gtgttcctgg ag犯gccggt 1920gcccccggtc UgUggtxc cagaggtgaa cgtggattcc ccggtgaacg cggctctccc 1980ggtgcccaag ggctgcaggg tccccgtggg ctccccggaa cgcccggcac tgacggaccc 2040
犯gggtgcaa ccggtccagc cggccccaac ggtgcccagg gtcccccagg gctgcaggga 2100atgcccggtg柳gaggagc agctggcatc gctggcctca agggtgaccg gggagatgtt 2160ggtgaga卿gacctgaggg agctccaggc aaggatggcg cacgtggtct gacgggtccc 2220attggtcccc ctggccctgc tggccccaac ggtg柳agg gtgaatccgg ccctcctggt 2280ccatctggtg ctgccggtgc ccgtggtgcc cccggtgagc gtggcgagcc cggtgccccc 2340ggtcctgctg gatttgctgg ccccccgggc gccgatggac犯cccggtgc caaaggcgag 2400caggg柳gc ccgggc卿a gggtgacgcg ggcgctcctg gtccccaagg tccctccggc 2460gctcctggcc cccagggccc aaccggtgtc actggtccca aaggagctcg tggggctcag 2520ggtccccctg gagccacggg attccccgga gctgccggcc gtgtgggacc gcccggccct 2580幼tggtaacc caggcccccc cggaccccct ggctctgctg gcaaggacgg ccccaagggt 2640gttcgtggcg acgccggccc ccccggccgt gcaggtgacc ccggcctcca aggccccgcc 2700ggcccccccg gcgagaaggg cgaacccggc gaggacggcc ccgcgggtcc cgacggcccc 2760cccggccctc aaggcttggc aggacagcgt ggtattgtgg gtctcccagg acagcgtggt 2820gagagaggct tccccggact gccggggcca tcgggagaac ctggaaagca aggagcgcct 2880ggctctgcgg gtgaccgagg tccccccggc cccgtggggc cccctgggct gacgggtcct 2940gctggagaac ccgggcgcga gggc犯ccct ggtgctgacg gtctcccagg cagggatggc 3000gcagctggcg tgaagggtga tcgtggtgag accggccctg tgggtgcccc cggtgctcct 3060ggagcccctg gcgcccccgg ccctgttggt cccactggaa aacaaggaga cagaggcgag 3120acgggtgcac犯gggcccat gggtccctct ggtcccgctg gagctcgagg aatgccgggt 3180cccca鄉(xiāng)ac ctcgtggtga caaaggtgag acgggagagg ctgg柳gag agggctgaag 3240ggccaccgtg gcttcaccgg tctgcagggt ctgcccggac cacccggccc gtctggagac 3300caaggtgctg ccggtcccgc tggtccctcc ggtcccagag gtccccctgg tcccgtcggc 3360ccctctggca犯gatggctc taacggcatg cccggcccca tcggtcctcc cggtccccgt 3420ggacggagtg gtgaacccgg ccctgcgggt cctcctggaa accccggtcc tcccggtcct 3480cctggccccc ccggcaccgg catcgacatg tctgcttttg ctggactggg tcagacggag 3540卿ggccccg accccatccg ctacatgagg gcagacgagg cggccggagg gctgcggcag 3600cacgacgtgg aggtggatgc caccctcaaa tccctcaaca atcagattga gagcatccgc 3660agccccgagg gctccaagaa gaaccctgcc aggacctgcc gcgacatcaa actctgccat 3720cccgagtgga agagcgg柳ttactggatt gacccg犯cc agggctgcac cttggacgcc 3780atcaaagtat tctgcaacat ggagacgggc gagacctgcg tctacccgac ccccagcagc 3840atcccceigga agaactggtg gaccagcaag acgaaagaca ag卿cacgt ctggtttgca 3900gagaccatca acggcggttt ccacttcagc tacggcgatg agaacctgtc ccccaacacc 3960gccagcatcc agatgacctt cctgcgcctc ctgtccaccg agggctccca gaacgtcacc 4020taccactgca agaacagcat cgcctacatg gacgaggaga cgggcaacct gaagaaagcc 4080atcctcatcc agggatccaa cgacgtggag atcagagccg agggcaacag caggttcacc 4140tacagcgtct tggaggacgg ctgcacgaaa cacactggca aatggggc犯gacggtgatc 4200gagtaccggt tgcagaagac ctcgcgcctg tccattgtag atactgcacc tatggacatt 4260ggcggagccg atcaggagtt tggcgtggat attggcccag tctgcttctt gtaaaaaggg 4320ttgttgttat ttgtgtgttt gtttgttgtt tggUgttgt tttttgtttc tttttttttt 4380ttttttagaa aagaaaggaa tccagcccaa tcccataaaa gcaaaccagt cccaccccca 4440ggacccgcac gttcccagca caacttctgc actgaacgga tggcacgacc ccgcgcccct 4500tcgggaccct ccggcgccgt caccgggcag actgcgaaat acaaccacgg gcttatattt 4560atttattgcc ttxctggaag gcctggUtc gtagggcggg tggaggtggg aatcaatctg 啦Ogc鄉(xiāng)tgtga cggcccccct ccccacaaag ggeitctggca aacgcaggta tcgcgaatcc 4680200610111396.2 說(shuō)明書(shū)第20/21頁(yè)cctcccctcc ccgtgtatca ccagcaggag tgctaatgta tcatacaaca gaaatggtgc 4740tattcttgta aaacaagtct gtatttttta acatcagttg atataaaaac aacaaaaaaa 4800aaaacttttg gtgg333gta幼333a3c犯333333Eia3a a肪3 4844<210> 2<211〉 57 <212>腿<213〉 artificial<220><223> primer<400〉 2aagcttgtta tggatatgca tggacgtcgt ccaccacgtt ccgccgctct cctcctc 57<210> 3<211> 27<212> DNA<213> artificial<220><223> primer<400〉 3gaattcttac aagaagcaga ctgggcc 27<210> 4<211〉 48<212〉 DNA<213〉 artificial<220><223〉 signal 〈400〉 4atggatatgc atggacgtcg tccaccacgt tccgccgctc tcctcctc 48<210> 5<211> 7<212> DNA<213〉 artificial<220〉<223〉 KOZAK sequence■> 5gttatgg 權(quán)利要求
1.一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO1)。
2. 權(quán)利要求1的重組核酸構(gòu)建體，其中所述表達(dá)調(diào)控序列選自CMV 立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR 和小鼠金屬硫蛋白I。
3. —種重組表達(dá)栽體，其含有與選自pcDM3.1 ( + ) 、 pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL和腺病毒的 真核表達(dá)載體有效連接的CC0L2A1基因(SEQ ID NO : 1 )。
4. 一種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗，其包含權(quán)利要求l所述 的重組核酸構(gòu)建體。
5. 權(quán)利要求1所述的重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的DNA疫苗的用途。
6. —種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效 量的權(quán)利要求1所述的重組核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求4所述的DNA疫苗，
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)有效連接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO1)。本發(fā)明還涉及含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)有效連接的CCOL2A1基因組成的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗的用途，以及包含上述重組核酸構(gòu)建體的治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步的還涉及治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的所述DNA疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101130091SQ20061011139
公開(kāi)日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者奚永志, 宋新強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院