專利名稱：一種分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)事業(yè)的高速發(fā)展，地方品種的改良工作越發(fā)變得簡單化，使很多地方特色品種開始流失，不斷有新的品種產(chǎn)生，所以，品種基因庫的建立就顯得十分重要。牛骨髓間充質(zhì)干細胞是良種?；驇斓姆N子細胞之一，同時骨髓間充質(zhì)干細胞具有一定的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。骨髓間充干細胞(mesenchymal stemcell，MSC)，最初是由Friedenstein發(fā)現(xiàn)的一類易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細胞，后來的研究證實在不同的誘導(dǎo)條件下，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細胞分化的能力，如向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及支持造血的基質(zhì)細胞等分化的能力。Kopen等的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞注射到新生鼠的側(cè)腦室后可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并具有一定的遷移能力。這提示骨髓間充質(zhì)干細胞可能具有更加廣泛的分化潛能。如果能在體外定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，不僅有助于研究神經(jīng)細胞的發(fā)育機理，而且對于治療早老性癡呆和帕金森氏癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病都具有重要意義。
目前報道MSCs分離比較困難，經(jīng)常受到造血祖細胞的污染。常用的MSCs分離與培養(yǎng)方法有1、密度梯度離心法根據(jù)MSCs與其它細胞的密度不同而采用Percoll分層液將其分離出來，但MSCs的獲得率很低；2、貼壁篩選法根據(jù)MSC具有在塑料組織培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性對其進行分離，一般以4-12小時貼壁細胞為宜，雖然分離MSCs起初很均一，但克隆形成率低；3、流式細胞儀分選法根據(jù)MSCs細胞體積小，相對缺少顆粒的特性利用流式細胞儀對MSCs進行分選，但共聚焦激光對細胞的活性有毒害作用；4、免疫磁珠分選法可以根據(jù)MSCs表達的某些細胞表面標志進行富集或根據(jù)其表面負表達的抗原進行負分選，其效率和純度較高，但針對MSCs特異性表面抗原費用昂貴、操作復(fù)雜、分選難度大。
目前鑒定MSCs主要依賴在培養(yǎng)誘導(dǎo)分化過程中MSCs所表現(xiàn)出來的干細胞特性及其分化后的成熟細胞表型特征來鑒定。MSCs存在不同形態(tài)和大小的細胞，大的增殖慢為成熟的MSCs，而小的增殖快為RS細胞，也有學(xué)者分離的人MSCs形態(tài)為均一的長梭形的成纖維細胞樣細胞。Pittenger等(Pittenger M F，Mackay A M，Beck S C，et al.Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal StemCells[J].Science，1999，284143-147.)認為人MSCs是骨髓源性的成纖維樣細胞，在一定的條件下分化為三個主要的細胞系骨分化，脂肪分化，軟骨分化。鑒定MSCs不但要檢驗其干細胞特性同時要檢驗其是否可以分化為以上細胞系的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。
本發(fā)明所提供的分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，是將牛骨髓單細胞懸液加入密度為1.082的Percoll細胞分離液中進行離心，取液面交界處的云霧狀單個核細胞層，接種于塑料容器中進行培養(yǎng)，去掉非貼壁細胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細胞。
牛骨髓單細胞懸液與密度為1.082的Percoll細胞分離液的體積比可為1∶1。
所述牛骨髓單細胞懸液為不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液。
所述離心條件為80g離心30min。
所述接種密度為1×105個細胞～1×107個細胞/cm2，優(yōu)選為1×107個細胞/cm2。
本發(fā)明分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法簡單、經(jīng)濟實惠，可操作性強，可以有效提高牛骨髓間充質(zhì)干細胞分離純化效率(細胞純度高達98％)；相對于流式細胞儀分選法對細胞的損傷較小，相對于免疫磁珠分選法更經(jīng)濟實用，相對于全骨髓法純度更高；可降低牛骨髓間充質(zhì)干細胞的純化成本。本發(fā)明方法分離純化的骨髓間充質(zhì)干細胞，體外定向誘導(dǎo)分化為跨胚層的多種細胞，具有廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景；可以作為種子資源保護的重要途徑和手段，是建立良種基因庫的種子細胞之一。


圖1a為本發(fā)明方法分離篩選的高純度MSCs集落(×200)圖1b為形成集落的MSCs原代培養(yǎng)細胞的瑞士-姬姆薩復(fù)合染色照片(×200)圖2a為第2代牛MSCs(×100)照片圖2b為第10代的牛MSCs形成的集落融合形成水紋狀(200×)圖2c為第10代接近融合的牛MSCs生長旺盛期，胞漿飽滿，多個核仁(×400)照片圖2d為照片第15代的牛MSCs形成的集落染色照片(×200)
圖3為第12代牛骨髓間充質(zhì)干細胞的多細胞集落(100×)照片圖4為第12代牛骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)吉姆薩染色鑒定的MSCs為單核細胞(100×)照片圖5為牛骨髓MSCs的生長曲線圖6為P3、P7和P12代細胞貼壁率圖7a-圖7e為骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)4h定向誘導(dǎo)分化獲得的各類神經(jīng)細胞(×400)照片圖8為骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)24h定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞(×400)圖9為牛MSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細胞第5h(×400)照片圖10為脂肪細胞融合形成的小脂肪滴第48h(×400)照片圖11為脂肪細胞融合形成的大脂肪滴第60h(×400)照片具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、牛骨髓間充質(zhì)干細胞的分離1、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離及其原代(第一代)培養(yǎng)無菌條件下分離出牛(2～6月齡)股骨骨髓，使用帶有4號針頭的5ml注射器沖出骨髓，置于消毒的大培養(yǎng)皿中，將骨髓液依次經(jīng)7號和4號針頭輕輕吹打，過200目濾網(wǎng)，制成單細胞懸液。將單細胞懸液用不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS-)沖洗3次，重新懸浮后將細胞懸液以1∶1的體積比輕輕加入4℃預(yù)冷的密度為1.082的Percoll細胞分離液(購自美國Sigma公司，配方Percoll原液25.65mL+1.5moL/L NaCl溶液24.35mL)的試管中，80g離心30min取中間(液面交界處)的云霧狀單個核細胞層，以PBS清洗2次準備接種。
將細胞懸液以1×107個細胞/cm2的密度接種于裝有完全培養(yǎng)基的直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿。每個培養(yǎng)皿加1.5ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，體積分數(shù)為5％的CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。在接種后48小時和72小時分別連續(xù)2次全量更換培養(yǎng)基，去掉非貼壁細胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細胞。以后每2d～3d半量換液1次。在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)11至13天，獲得骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)物。其中，采用的完全培養(yǎng)基為L-DMEM+25％(體積百分含量)馬血清+10％(體積百分含量)條件培養(yǎng)液+1％(質(zhì)量百分含量)L-谷氨酰胺+1μmol/L的氫化可的松。其中，條件培養(yǎng)液按照如下方法配制無菌分離犢牛股骨骨髓5ml，加入10mL含有20％(體積百分含量)的胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺的L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2d～3d，收集培養(yǎng)液，離心取上清液制成條件培養(yǎng)液。
上述細胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，剛接種時，骨髓細胞懸液中的細胞呈圓形，大小不一，不能辨認細胞核，接種后第1天至第3天，可見形態(tài)相對均一的折光性較強紡錘形細胞，以及少量的成纖維細胞樣的細胞，以后細胞逐漸增多，接種后第4天至第5天細胞進入對數(shù)生長期，細胞生長較快；接種后第11天至第13天細胞生長進入平臺期，細胞數(shù)量擴增減慢，并開始出現(xiàn)融合，而且細胞逐漸出現(xiàn)多種形態(tài)，成纖維細胞樣的細胞開始增加，可見少量大而扁平的細胞。牛骨髓間充質(zhì)干細胞極易發(fā)生分化，接種密度低更不利于其生長，所以原代培養(yǎng)細胞密度適中(1×107個細胞/cm2)，接種后第3天至第4天形成典型集落，集落的細胞在50-100個左右(圖1a)，同時可見一些微克隆。對形成集落的原代培養(yǎng)細胞進行瑞士-姬姆薩復(fù)合染色，光鏡觀察，細胞形態(tài)呈梭形狀，胞核著粉紅色，胞漿不著色，未見纖維絲等結(jié)構(gòu)，各代之間形態(tài)較一致，細胞核有1-2個核仁，呈圓形(圖1b)。
2、牛骨髓間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)接種后第11天至第13天，原代(第一代)培養(yǎng)細胞生長融合后，用0.25％(質(zhì)量百分含量)胰蛋白酶和0.1mmol/L的EDTA消化(消化前預(yù)熱消化液，PBS沖洗細胞3次，以去除死細胞)，在倒置顯微鏡下觀察，大約1min，當(dāng)細胞突起回縮，細胞之間間隙增大，細胞接近圓形時，輕輕吹打平皿底壁，制成細胞懸液。80g離心6min棄上清液后，1∶2傳代(由一個35mm平皿牛骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)消化離心洗滌后，傳代接種到2個35mm塑料平皿)，置于體積分數(shù)為5％的CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)箱中進行第二代細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)5-7天后，再按照上述方法進行傳代、培養(yǎng)第三代細胞，第三代細胞培養(yǎng)3-4天后，再按照上述方法進行傳代、培養(yǎng)第四代細胞。第四代細胞培養(yǎng)3-4天后，再按照上述方法進行傳代、培養(yǎng)直至第十五代細胞。第十二代細胞以后，細胞形態(tài)逐漸變得不均一，細胞突起增多，大量多角形細胞出現(xiàn)，并且增殖能力逐漸減弱，4-6天才可達到完全融合。其中，所用的傳代培養(yǎng)基為L-DMEM培養(yǎng)液+120mL/L FBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素。
傳代細胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，牛MSCs原代細胞一經(jīng)傳代小圓形細胞均不見，第二代細胞主要為梭形、多角形(圖2a)，呈現(xiàn)很多集落樣細胞并融合成片，但是細胞間存在接觸抑制，傳代培養(yǎng)的細胞呈集落生長并融合成片，第二代牛MSCs形成的集落染色為單核，細胞呈梭形圓形和三角形，傳至第10代的牛MSCs細胞集落融合形成水紋狀(圖2b)。原代培養(yǎng)接種密度適宜，雖然只見少數(shù)50-100個細胞組合的小集落，傳代培養(yǎng)中可見大量集落形成并融合成片，第10代的細胞純度高達98％，第10代細胞培養(yǎng)17天后發(fā)生融合的牛MSCs細胞成長旺盛，胞漿飽滿，多個核仁(圖2c)，第15代的牛MSCs細胞形成的集落染色結(jié)果如圖2d。
細胞傳到第12代以后，培養(yǎng)4-6天后，形成多細胞集落(圖3)，第12代牛骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)吉姆薩染色鑒定為單核細胞(圖4)，純度達98％。
3、牛骨髓MSCs生長曲線的繪制取原代以及對數(shù)生長期的P2(第二代)、P5(第五代)和P9(第九代)代MSCs，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為4×103cells/cm2，接種于4個24孔板中，每孔400μL。置38.5℃、體積分數(shù)為5％的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。每72h換液一次，每過24h分別取4孔細胞消化，用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)量，每孔重復(fù)3次，取平均值，以細胞生長時間為橫坐標，以細胞數(shù)(×200cells/cm2)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。
根據(jù)細胞計數(shù)繪制出的生長曲線(圖5)表明，接種后的原代細胞，1-5天為生長靜止期，此期主要為細胞適應(yīng)體外環(huán)境，貼壁增長階段，增殖較慢；7-11天為對數(shù)增長期，此期細胞生長活躍，增殖較快；此后細胞由于接觸緊密，相互間存在抑制作用，增長逐漸減慢，進入平臺期，此時應(yīng)及時傳代。傳代后可見，細胞靜止期為1-2天、對數(shù)生長期為4-7天，之后進入平臺期，均明顯縮短。
4、牛骨髓MSCs貼壁率的測定制備P3(第三代)、P7(第七代)和P12代(第十二代)單細胞懸液，以4×103cells/cm2的濃度分別接種于3個24孔板中，每孔400μL，于38.5℃、體積分數(shù)為5％的CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每過1h分別取出每個培養(yǎng)板的三孔細胞，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗三次，以充分除去未貼壁細胞。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液室溫下消化(1-2min)貼壁細胞并計數(shù)，取平均值，按下式計算每個時間點的貼壁率。
分別取各代細胞貼壁率的平均值，以貼壁時間(h)為橫坐標，以貼壁率(％)為縱坐標，繪制各代細胞貼壁率曲線。
繪制的細胞貼壁率曲線(圖6)表明，在接種1h后各代MSCs均有少量貼壁，倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生變化，逐漸向梭形細胞形態(tài)改變，表現(xiàn)出貼壁跡象。12h后P3和P7代細胞接近全部貼壁，P12代也有80％的細胞貼壁，24h后P12代細胞全部貼壁。此時可以全量換液除去未貼壁的雜細胞以及在消化離心過程中死去的MSCs，保持培養(yǎng)皿細胞的干凈，利于整個MSCs的穩(wěn)定生長。
5、骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞取純化率達90％以上的接近融合的P3和P11代MSCs消化，調(diào)整細胞濃度，以4×103cells/cm2分別接種于預(yù)先置有蓋玻片的兩個六孔板中，分為兩組(預(yù)誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組)，待細胞生長至70-80％融合時棄去培養(yǎng)液，用PBS-沖洗三遍。預(yù)誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組中分別加入含3mmol/L的β-巰基乙醇(β-ME)的L-DMEM(含120mL/LFBS)預(yù)誘導(dǎo)24小時。預(yù)誘導(dǎo)24h后，試驗組再加入含5mmol/L的β-巰基乙醇的L-DMEM(無FBS)進行正式誘導(dǎo)。開始正式誘導(dǎo)后的第10h加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)基(L-DMEM培養(yǎng)液+120mL/LFBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素)。每隔0.5h在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。
結(jié)果表明牛MSCs在含β-ME的DMEM(含120mL/L FBS)預(yù)誘導(dǎo)液中處理24h后，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞開始有少量突起長出，細胞變長，細胞質(zhì)變得致密，正式誘導(dǎo)1h后細胞形態(tài)變化更加明顯，大多數(shù)細胞原來寬大扁平的胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)，細胞突起開始變長，正式誘導(dǎo)第4h梭形細胞回縮，變圓變亮；大而扁平的細胞胞質(zhì)也向核收縮，變?yōu)椴灰?guī)則形和圓形，小部分細胞開始脫壁死亡。整個誘導(dǎo)過程中細胞質(zhì)呈分葉狀，并有少數(shù)細胞開始大量分泌細胞基質(zhì)，逐漸變?yōu)樾菭钕蛑車l(fā)散(圖7a-7e)。正式誘導(dǎo)第6h后大多數(shù)細胞均轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谏窠?jīng)細胞的形態(tài)，突起伸出軸突，并在軸突末端出現(xiàn)一級和二級分支，類似樹突。倒置顯微鏡下可見簡單的雙極細胞，也有復(fù)雜的多極細胞拉網(wǎng)，有生長錐形成，還有膠質(zhì)樣細胞。正式誘導(dǎo)后的第10h加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)基(L-DMEM培養(yǎng)液+120mL/LFBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素)。隨著神經(jīng)元分化成熟，神經(jīng)元不再增殖，數(shù)量不再增加。正式誘導(dǎo)24h后，大部分細胞分化出具有典型神經(jīng)元表型的細胞(圖8)細胞胞體呈橢圓形、三角形或不規(guī)則形，折光性強，細胞長出較長的突起，呈雙極或多極形，可見核及核仁，且細胞數(shù)無明顯增加。在神經(jīng)分化過程中，細胞在形態(tài)上也發(fā)生類似于巨噬細胞自嗜現(xiàn)象的變化細胞核與胞質(zhì)的比例增大，胞質(zhì)收縮并部分丟棄，突起形成后又大部分瓦解變性；少部分突起保留并逐漸延長，有生長錐形成。少數(shù)分化細胞開始脫落，即停止誘導(dǎo)分化，在不換液的情況下細胞可繼續(xù)存活3-4d。
6、骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)分化為脂肪細胞Peister認為骨髓間充質(zhì)干細胞是骨髓源性的成纖維細胞樣細胞，并且在一定條件下可以分化為中胚層的脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞。
取第12代的牛骨髓MSCs按1.0×104/cm2密度做爬片，共做10個細胞爬片，細胞生長80-90％融合時直接做誘導(dǎo)。誘導(dǎo)液為L-DMEM+25％(體積百分含量)胎牛血清+1％(質(zhì)量百分含量)L-谷氨酰胺，在前三周的培養(yǎng)結(jié)束以后，繼續(xù)使用馬血清培養(yǎng)(是在L-DMEM+25％(體積百分含量)馬血清+1％(質(zhì)量百分含量)L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng))，由于馬血清中具有較高的脂質(zhì)和糖皮質(zhì)激素含量，而使骨髓間充質(zhì)干細胞中出現(xiàn)大量脂質(zhì)聚集，進一步形成脂滴，從而使骨髓間充質(zhì)干細胞分化為脂肪細胞(圖9-11)?？赡苁且驗镋rk活化程度與脂肪細胞分化呈反比，Erk磷酸化后，控制脂肪分化的轉(zhuǎn)錄因子-過氧化物酶激活受體γ(PPAR-γ)活性下降。ERK信號通路還調(diào)節(jié)骨髓MSCs向脂肪組織轉(zhuǎn)化、阻斷ERK信號通路、促進PPAR-γ表達增加，導(dǎo)致向脂肪細胞分化。雖然對ERK2的下游底物不清楚，但是可以肯定，其在調(diào)節(jié)MSCs分化為脂肪中起作用。
權(quán)利要求
1.一種分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，是將牛骨髓單細胞懸液加入密度為1.082的Percoll細胞分離液中進行離心，取液面交界處的云霧狀單個核細胞層，接種于塑料容器中進行培養(yǎng)，去掉非貼壁細胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述牛骨髓單細胞懸液與密度為1.082的Percoll細胞分離液的體積比為1∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述牛骨髓單細胞懸液為不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述離心條件為80g離心30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述接種密度為1×105個細胞～1×107個細胞/cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述接種密度為1×107個細胞/cm2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。該分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，是將牛骨髓單細胞懸液加入密度為1.082的Percoll細胞分離液中進行離心，取液面交界處的云霧狀單個核細胞層，接種于塑料容器中進行培養(yǎng)，去掉非貼壁細胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細胞。該分離牛骨髓間充質(zhì)干細胞的方法簡單、經(jīng)濟實惠，可操作性強，可以有效提高牛骨髓間充質(zhì)干細胞分離純化效率(細胞純度高達98％)。本發(fā)明方法分離純化的骨髓間充質(zhì)干細胞，體外定向誘導(dǎo)分化為跨胚層的多種細胞，具有廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景；可以作為種子資源保護的重要途徑和手段，是建立良種基因庫的種子細胞之一。
文檔編號C12N5/06GK1908161SQ20061011264
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月28日
發(fā)明者董雅娟, 封紀武, 董方圓, 趙興, 柏學(xué)進 申請人:萊陽農(nóng)學(xué)院