專利名稱：冰草p基因組特異序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及冰草P基因組特異序列。
背景技術：
小麥是人類的主要糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。目前，栽培小麥遺傳基礎狹窄對小麥改良造成嚴重障礙，小麥野生近緣植物是小麥遺傳改良的巨大基因庫。
小麥族有25個屬，近400個種，在禾本科植物中占有舉足輕重的地位。冰草屬(Agropyron)植物基本基因組為P組(董玉琛，鄭殿升。中國小麥遺傳資源。中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，174-177)，分布于歐亞大陸寒溫帶高原及沙地，不僅長期適應干旱、寒冷氣候和土壤貧瘠所造成的非生物逆境，而且對小麥的白粉病、黃矮病、銹病等主要病害具有很強的抗性，此外，冰草具有多小穗、多小花等豐產(chǎn)株型結構。因此，冰草P基因組可以作為多種優(yōu)異外源基因供體，對于小麥遺傳改良具有重要意義。
李立會等(李立會，李秀全，李培.小麥-冰草異源附加系的創(chuàng)建.遺傳學報，1997，24154-159)在國際上首次育成了一套穩(wěn)定遺傳的小麥-冰草異源二體附加系，并獲得了分子細胞遺傳學的證實。小麥-冰草附加系的建立為創(chuàng)造小麥ABD組與冰草P組間遺傳交換，將P染色體攜帶的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到小麥中提供了重要的前提。通過小麥與冰草附加系的雜交，已經(jīng)獲得了一批應用價值較高的小麥-冰草重組系，對重組系中P染色質(zhì)的遺傳鑒定十分必要。
小麥外源異染色質(zhì)的鑒定通常采用基因組原位雜交(Genomic in situhybridization，GISH)的方法，但這往往對于異染色體代換和較大片段易位的鑒定比較有效。由于染色體代換和大片段易位在導入優(yōu)異基因的同時可能造成連鎖累贅，因此人們更希望獲得異染色質(zhì)小片段易位。然而對于異染色質(zhì)小片段易位的鑒定困難一直是一個棘手的問題。隨著分子生物學技術的發(fā)展與應用，利用基因組高豐度特異序列為探針，進一步建立識別不同基因組和染色體的特異分子標記，為異染色質(zhì)的鑒定開辟了新的途徑。對小麥-冰草重組系異染色質(zhì)小片段易位進行快速準確的遺傳鑒定，迫切需要P基因組及P染色體的特異探針和分子標記。
小麥族植物不同基因組特異序列的研究一直倍受關注，由于小麥族不同基因組之間存在的遺傳演化關系，基因組特異序列是相對于其他基因組而言。理想的特異序列相對于其他多數(shù)基因組具有特異性。目前在小麥近緣植物中，已經(jīng)從黑麥克隆出R基因組的特異序列(Mao L，Zhai WX，Hu H.Cloning and characterization of arepetitive sequence in rye(Secale cereal).Plant Science，1994，10051-57；周建平，楊足君，馮娟.黑麥特異DNA重復序列的分離與鑒定.西南農(nóng)業(yè)學報.2005，18(5)598-602)；從大麥克隆出H基因組的特異序列(Hueros G，Loarce Y，F(xiàn)erreyE.A structure and evolutionary analysis of a dispersed repetitivesequence.Plant Mol Biol.1993，22635-643；Anamthawat-Jonsson K，Heslop-harrison JS.Isolation and characterization of genome specific DNAsequences in Trticease species. Mol Gen Genet，1993，240151-158)，建立了大麥染色體的特異分子標記(黃朝峰，張文俊，余波瀾.大麥6H染色體特異性標記的篩選和鑒定.遺傳學報.2000，27(8)713-718)；從長穗偃麥草克隆出E基因組的特異重復序列(李洪杰.長穗偃麥草(Thinopyrum elongatum)基因組特異重復序列的分離.中國科學院博士后研究工作報告，2000)；從中間偃麥草克隆出St基因組特異序列并建立2Ai-2染色體特異的PCR標記(張增艷，王麗麗，辛志勇.中間偃麥草染色體2Ai-2特異PCR新標記的建立和St基因組特異序列的克隆.遺傳學報.2002，29(7)565-570)；從粗山羊草克隆出D基因組的特異序列(Lagudahe S，Appels R，Mcneild.The Nor-D3 of Triticum tauschiiNatural variation andgenetic linicage to markers in chromosome 5.Genome，1991b，34387-395)；從簇毛麥克隆出V基因組的特異序列(DePace C，Deler V，Scarasciia MGT.Molecular and chromosomal characterization of repeated and single copy DNAsequences in the genome of Dasypyrum villosum.Hereditas，1992，11655-65；Li W L，Chen P D，Qi L L.Isolation，characterization and application of aspecies-specific repeated sequence from Haynaldia villosa.Theor Appl Genet，1995，90526-533)，建立了簇毛麥V基因組的特異PCR標記(劉守斌，唐朝暉，尤明山.簇毛麥基因組特異性PCR標記的建立和應用.遺傳學報.2003，30(4)350-356)；從尾狀山羊草克隆出C基因組的特異序列(Baldauf F，Schubert V，Metzlaff M.Repeated DNA sequences of Aefilops markgra-fii(Geuter)Hammervar，markgrafiicloning，sequencing and analysis of distribu-tion inPoaceaae species.Hereditas，1992，11671-78；孔秀英，周榮華，董玉琛。尾狀山羊草C基因組特異重復序列的克隆。科學通報，1999a，44(8)828-832)；從擬斯卑爾脫山羊草克隆出S基因組的特異序列(Daud H M，and Gustafson J P.Molecular evidence for Triticum speltoides as a B-genome progenitor of wheat(Triticum aestivum).Genome，1996，39543-548；Giorgi D，D’Ovidio R，Tanzarella O A.Isolation and characterization of S genome specific sequencesfrom Aegilops sect.sitopis species.Genome，2003，46478-489)；從賴草克隆出Ns基因組的特異序列(Sigridur K B，and Kesara A.Isolation，characterization，and analysis of Leymus-specific DNA sequences.Genome，2003，46673-682)。
基因組特異DNA序列和分子標記的研究不僅為闡明小麥族植物系統(tǒng)演化、基因組構成和基因組進化關系提供理論依據(jù)，而且為小麥外源染色質(zhì)的鑒定提供了可以直接利用的特異探針和分子標記(Orgaard M，Anamthawat-Jonsson K.Genomediscrimination by in situ hybridization in Icelandic species of Elymus andElytrigia(PoaceaeTriticeae).Genome.2001，44275-283；SchoenenbergerN，F(xiàn)elber F，Savova-Bianchi D.Introgression of wheat DNA markers from A，B and D genomes in early generation progeny of Aegilops cylindrical Host×Triticum aestivum L.hybrids.Theor Appl Genet.2005，1111338-1346)。
然而，對于冰草屬P基因組特異序列和識別P染色體的特異分子標記的研究尚未見專門的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種冰草P基因組特異序列。
本發(fā)明所提供的冰草P基因組特異序列，是以冰草的基因組DNA為模板，用RAPD引物進行PCR擴增得到的1036bp的核苷酸序列，或用SCAR引物進行PCR擴增得到的960bp的核苷酸序列；所述RAPD引物的核苷酸序列是序列1，所述SCAR引物是由序列3和序列4組成的一對寡核苷酸。
在實際應用中，所述PCR的模板可為冰草Z559的基因組DNA、冰草Z804的基因組DNA或冰草Z1750的基因組DNA。
所述冰草P基因組特異序列，是由序列表中序列2的自5′端第75位至第1034位脫氧核苷酸組成的序列或是序列表中的序列2。
由于冰草屬P染色體存在遺傳重排現(xiàn)象，給P基因組的演化關系的研究帶來困難，本發(fā)明獲得的P基因組特異序列將為闡明小麥族植物的系統(tǒng)發(fā)育和冰草屬植物P基因組的演化關系提供新的分子生物學依據(jù)。小麥外源P染色質(zhì)的檢測是鑒定小麥-冰草重組系的關鍵，雜交后代大量的單株鑒定工作十分繁雜，本發(fā)明篩選的P基因組特異序列和基于該序列獲得的P基因組SCAR標記，將為小麥-冰草重組系P染色質(zhì)的快速檢測與準確鑒定提供新的特異探針和分子標記。


圖1為引物Opx-7對冰草屬P基因組DNA和小麥族ABD基因組DNA的PCR擴增結果圖2為SCAROPX-7引物對冰草及小麥族其他不同基因組DNA的PCR擴增結果具體實施方式
下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的冰草、小麥及小麥族的其他植物均購自中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所種質(zhì)資源研究中心。
實施例1、P基因組特異序列的獲得利用RAPD引物Opx-75′-GAGCGAGGCT-3′(序列1)，對冰草屬P基因組DNA和小麥族ABD基因組DNA進行篩選，分離和克隆P基因組特異擴增片段。
其中，PCR擴增的20ul體系10×PCRbuffer(含20mMol/L Mg2+) 2uldNTP(10mM) 0.3ul引物(8uM) 0.7ulTaq酶(2u/ul) 0.5ul模板DNA(50ng/ul) 1ulddH2O 15.5ulPCR程序先94℃4min充分變性；再94℃30S變性，37℃45S復性，72℃1min延伸，45循環(huán)；最后72℃延伸10min。4℃保存。
1.2％瓊脂糖凝膠，100V恒壓電泳，紫外凝膠成像。
PCR擴增結果如圖1所示，在二倍體、四倍體和六倍體冰草P基因組中擴增出小麥族ABD基因組沒有的特異帶，該條帶大小為1036bp。圖1中，L為100bp DNA Ladder；P2，二倍體冰草Z804(PP)；P4，四倍體冰草Z559(PPPP)；P6，六倍體冰草Z1750(PPPPPP)；CS，普通小麥中國春(AABBDD)；Fu，普通小麥Fukuho(AABBDD)；A，栽培一粒小麥MO4(AA)；AB，硬粒小麥DR4(AABB)；-，空白對照(純水)；箭頭所示為P基因組特異擴增帶。
切取二倍體冰草Z804、四倍體冰草Z559和六倍體冰草Z1750的P基因組特異DNA條帶，并用DNA回收試劑盒Agarose Gel DNA Purification(寶生物工程大連有限公司)對目的DNA進行回收。特異片段經(jīng)回收后，使用T-載體試劑盒(寶生物工程大連有限公司)經(jīng)pMD-18 Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至受體菌株大腸桿菌JM109中，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色菌落提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定，確定插入片段大小與原回收片段一致的克隆進行測序(由北京鈞堯偉業(yè)生物技術公司測序)。測序結果表明從四倍體冰草Z559中擴增的特異片段長度為1036bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列；從二倍體冰草Z804中擴增的特異片段長度為1036bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列；從六倍體冰草Z1750中擴增的特異片段長度為1036bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列。
實施例2、冰草P基因組特異序列驗證根據(jù)P基因組特異擴增片段的測序結果，經(jīng)DNASTAR設計軟件優(yōu)化，設計出一對SCAROPX-7引物SCAROPX-7F5′-GCTACCATTCCAACTTCTACG-3′(序列3)，對應于序列2的75-95nt；SCAROPX-7R5′-GCGAGGCTATGTTGGTTTTGA-3′(序列4)，與序列2的1014-1034nt反向互補。
以SCAROPX-7引物對小麥族不同基因組DNA進行擴增(退火溫度62℃)，擴增及電泳條件同實施例1。結果表明，在二倍體冰草Z804、四倍體冰草Z559和六倍體冰草Z1750中均擴增到長度為960bp的特異片段(SCAR標記)，而在小麥ABD基因組和絕大多數(shù)小麥族其他基因組(C，D，E，AG，I，R.S.St，U，V，W，Y)中未得到該960bp的特異片段，說明用SCAROPX-7引物從冰草的基因組DNA中擴增到的序列對小麥ABD基因組和絕大多數(shù)小麥族其他基因組(C，D，E，AG，I，R.S.St，U，V，W，Y)表現(xiàn)特異性(圖2)，是冰草P基因組特異序列。圖2中，L為100bp DNA Ladder；P2為二倍體冰草Z804(PP)；P4為四倍體冰草Z559(PPPP)；P6為六倍體冰草Z1750(PPPPPP)；CS為普通小麥中國春(AABBDD)；Fu為普通小麥Fukuho(AABBDD)；A為栽培一粒小麥MO4(AA)；AB為硬粒小麥DR4(AABB)；C為尾狀山羊草Ae14(CC)；D為粗山羊草Y93(DD)；E為長穗偃麥草(EE)；AG為提莫菲維小麥TI1(AAGG)；H為紫大麥草Z2826(HH)；I為紫六棱栽培大麥(II)；M為頂芒山羊草Y258(MM)；Ns為新麥草R429(NsNs)；R為黑麥Z1383(RR)；S為擬斯卑爾脫山羊草Ae49(SS)；St為假鵝觀草(StSt)；U為小傘山羊草Y39(UU)；V為簇毛麥Z1731(VV)；W為澳麥草(WW)；Y為中間鵝觀草(StStYY)；-為空白對照(純水)。
對上述SCAR標記進行測序。測序結果表明從四倍體冰草Z559中擴增的特異片段長度為960bp，是由序列表中序列2的自5′端第75位至第1034位脫氧核苷酸組成的序列；從二倍體冰草Z804中擴增的特異片段長度為960bp，是由序列表中序列2的自5′端第75位至第1034位脫氧核苷酸組成的序列；從六倍體冰草Z1750中擴增的特異片段長度為960bp，是由序列表中序列2的自5′端第75位至第1034位脫氧核苷酸組成的序列。
序列表<160>4<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gagcgaggct 10<210>2<211>1036<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gagcgaggct cgtgagcaca acacggaggt tgaggctact catgcggagg cggctgcacc60aagggcctcc gtgagctacc attccaactt ctacgcagat cccggatggt gaattccaag120ctaggcaaaa gccaaagctt gggggagtac gtgtttctca ccgacattac attcatgttc180acacatttca tttcagttgt cggtgctcac acgtttccat tgcattatcc ttgctagaat240tattttcttg ctctcttttt gtgtgtttga aaaactttca gaaaactcaa aaatatttcc300ttgcttcttt ttggcttttt cttctaagtt tagttagtct caattaagag aaaacccaaa360aagatttcct tgttcttctt ttgctttttg ggagctttcc cgtgtaaata gttttcttgt420ttttgttttt cctttttttt aatttgcttt gcttttcaaa aaactaaaaa ctccaaaaat480atttccagtg tgtttctatg aatttctttt tcttttttgt tgagtcttag taatgagagg540accacgatga aatgatgagt ggcactgata tgcattgatg tttatctaat gagacaagtt600attatgtctt ctcttggtcg aataaaatgt tttgcagatt ccagcctagt ccacagtaca660cttgaactta tatctttata tcattcggtc gtgcaagtga aaggcaataa tgacgatgac720
ttgatgaagt gactgtgtca aagaaaagct ggtatgaact caacttgttt tttgtttttg780taaatatgtt tatcttagta gccatgactt agcatgatta tgatcaaaca tgtttatgat840gacaattaga gattatagtt gctcatgcca tgcttaatag ctaggagtgg ataatgattt900atcttgaatg ttaacatgca ttagaatgat tgtgatgtag tatgatgaca tggtatcttc960ctctgaatgt ttcaagtggc ttgacttggc acatgttcac gcatgtagtt gaatcaaaac1020caacatagcc tcgctc1036<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gctaccattc caacttctac g 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gcgaggctat gttggttttg a 2權利要求
1.一種冰草P基因組特異序列，是以冰草的基因組DNA為模板，用RAPD引物進行PCR擴增得到的1036bp的核苷酸序列，或用SCAR引物進行PCR擴增得到的960bp的核苷酸序列；所述RAPD引物的核苷酸序列是序列1，所述SCAR引物是由序列3和序列4組成的一對寡核苷酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的冰草P基因組特異序列，其特征在于所述PCR的模板為冰草Z559的基因組DNA。
3.根據(jù)權利要求1所述的冰草P基因組特異序列，其特征在于所述PCR的模板為冰草Z804的基因組DNA。
4.根據(jù)權利要求1所述的冰草P基因組特異序列，其特征在于所述PCR的模板為冰草Z1750的基因組DNA。
5.根據(jù)權利要求2至4中任一所述的冰草P基因組特異序列，其特征在于所述冰草P基因組特異序列，是由序列表中序列2的自5′端第75位至第1034位脫氧核苷酸組成的序列。
6.根據(jù)權利要求2至4中任一所述的冰草P基因組特異序列，其特征在于所述冰草P基因組特異序列是序列表中的序列2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冰草P基因組特異序列。該冰草P基因組特異序列，是以冰草的基因組DNA為模板，用RAPD引物進行PCR擴增得到的1036bp的核苷酸序列，或用SCAR引物進行PCR擴增得到的960bp的核苷酸序列；所述RAPD引物的核苷酸序列是序列1，所述SCAR引物是由序列3和序列4組成的一對寡核苷酸。本發(fā)明獲得的P基因組特異序列將為闡明小麥族植物的系統(tǒng)發(fā)育和冰草屬植物P基因組的演化關系提供新的分子生物學依據(jù)。小麥外源P染色質(zhì)的檢測是鑒定小麥－冰草重組系的關鍵，雜交后代大量的單株鑒定工作十分繁雜，本發(fā)明篩選的P基因組特異序列和基于該序列獲得的P基因組SCAR標記，將為小麥－冰草重組系P染色質(zhì)的快速檢測與準確鑒定提供新的特異探針和分子標記。
文檔編號C12N15/29GK1924017SQ20061011314
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權日2006年9月15日
發(fā)明者劉偉華, 吳嫚, 李立會, 楊欣明, 高愛農(nóng), 李秀全, 李洪杰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所