專利名稱：：一個種子特異性啟動子及其核心功能片段與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因啟動子及其應(yīng)用，特別是涉及一個來源于馬檳榔的種子特異性啟動子及其在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：不同基因在不同發(fā)育階段和不同組織中特異表達是植物本身生長發(fā)育的需要。生物體內(nèi)不同基因能夠有條不紊地特異表達，關(guān)鍵在于其啟動子中特異順式作用元件及特異轉(zhuǎn)錄因子各不相同所致。研究表明，組織特異性啟動子中一般同時存在多種控制組織特異性表達的元件，其表達特異性由這些元件的種類、數(shù)量和相對位置等共同決定。在植物的基因工程改良中有目的地應(yīng)用高效組織特異性啟動子，可以克服組成型啟動子啟動外源基因在受體植物中非特異性、持續(xù)和高效表達所造成的浪費，甚至大量表達的異源蛋白會打破植物原有的代謝平衡，妨礙植物的正常生長發(fā)育，而且有時在需要大量表達的特定組織中又因表達量過低而達不到預(yù)期效果，因此，深入研究這些組織特異性啟動子不僅有助于闡明植物形態(tài)、發(fā)育、生理和代謝等基礎(chǔ)理論，而且也具有廣泛的應(yīng)用前景，長期以來一直是植物基因工程研究中的重點和難點。種子發(fā)育包含一系列基因的相繼協(xié)調(diào)表達，原因在于這些基因的啟動子相繼被激活，因此研究這些基因及其啟動子的表達調(diào)控機理具有重要的理論和現(xiàn)實意義。目前，研究較多的種子特異性啟動子主要是單子葉植物中的胚乳特異性啟動子和雙子葉植物中的胚及子葉特異性啟動子。目前，雙子葉植物的種子特異性啟動子研究主要集中在油菜(Brassica)的napin基因啟動子和豆類的11S、7S蛋白基因啟動子。napin蛋白是廣泛存在于蕓薹屬植物中的種子貯藏蛋白，又被稱為1.7S蛋白。迄今為止，許多植物的napin蛋白基因，如napA、napB、BcNA1和pGNA等都相繼得到克隆和測序(熊興華等，油菜種子特異表達napin基因啟動子的克隆及序列分析，生物技術(shù)，13(3)4-5，2003)，分析它們的調(diào)控序列發(fā)現(xiàn)某些特定的核苷酸序列與種子特異性表達密切相關(guān)(Ellerstrom等，F(xiàn)unctionaldissectionofanapingenepromoteridentificationofpromoterelementsrequiredforembryoandendosperm-specifictranscription，PlantMolecularBiology，321019-1027，1996)。Zhang等從油菜H165的基因組DNA中分離到了napinB啟動子的部分序列nap300(Zhang等，Identificationofseed-specificpromoternap300anditscomparisonwith7Spromoter，Pro.Nat.Acad.Sci，12(10)737-741，2002)，把它與7S蛋白基因的啟動子進行序列比對發(fā)現(xiàn)，napinB啟動子中包含了一些在進化過程中高度保守的序列，如富AT序列、napin-motif保守序列、RY重復(fù)序列和G-box等，這些順式作用元件也是核蛋白的結(jié)合位點(Wu等，Analysisof5’regionofglutelingenesfromwildricespecies，BotBullAcadSin，3741，1996)，可能對種子特異性表達起到重要的調(diào)控作用。財音青格樂等克隆了大豆β-伴大豆球蛋白基因α亞基啟動子片段BCSP666，把它與α’亞基基因的啟動子進行比較，發(fā)現(xiàn)這些啟動子之間的序列同源性雖然很低(30-40％)，但所含的啟動子序列元件的數(shù)量和距離上卻很相似，均具有多拷貝的RY重復(fù)序列元件，AGCCCA序列元件，napin-motif序列元件和富AT序列(財音青格樂等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，38(3)454-461，2005)。Beachy等證明α’亞基基因的啟動子具有較強的種子特異性，且上述這些啟動子序列元件與種子特異性功能密切相關(guān)(Beachy等，Accumulationandassemblyofsoy-beanβ-conglycinininseadsoftransfomedpetuniaplants，TheEMBO，4(12)3047-3053，1985)。Cahoon等利用α’亞基基因的啟動子在大豆體細(xì)胞胚中成功地表達了脂肪酸脫氫酶基因，進一步證實了它的種子特異活性并展示了其廣泛的應(yīng)用前景(Cahoon等，Productionoffattyacidcomponcntsofmeadowfoamoilinsomaticsoybeanembryos，PlantPhysiol.，124243-251，2000)。醇溶蛋白基因啟動子和谷蛋白基因啟動子是單子葉植物種子特異性啟動子研究的重點和熱點。研究較多的醇溶蛋白基因和谷蛋白基因包括玉米(ZeamaysL.)19KD、22KDzein基因(Heideckerr等，Structuralanalysisofplantgenes，Annual.Rev.Plantphysiol，37439-446，1986)、小麥glutenin、a/β-gliadin(ReevesandOkita，Analysisofa/β-gliadingenesfromdipliodandhexaploidwheats，Gene，52257-266，1987)、γ-gliadin基因，大麥B1-hordein基因(Forde等，NucleotidesequenceofB，hordeingeneandtheidentificationofpossibleupstreamregulatoryelementsinendospermstorageproteingenesfrombarley，wheatandmaize，NucleicAcidsRes.，137327-7339，1985)和水稻的4a基因(趙軍等，水稻種子醇溶蛋白4a基因的表達受串聯(lián)復(fù)合啟動子調(diào)控，中國科學(xué)C輯，26(2)156-163，1996)等。在所有谷蛋白基因的啟動子中都含有GCN4基序、AACA基序和GCAA基序，而且它們的位置基本相同；在醇溶蛋白基因的啟動子中除含有上述元件外，還含有Prolamin-box(醇溶谷蛋白框)。Wu等的研究認(rèn)為GCN4基序是決定胚乳特異表達的重要元件，GCN4基序、AACA基序和ACCT基序的組合對于胚乳特異表達特性是充足的(Wu等，Analysisof5’regionofglutelingenesfromwildricespecies，ThePlantJ.，23(3)415-421，2000)。馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)，又名馬金囊、馬金南、太極子(云南中藥別名)、山檳榔(云南西疇)、紫檳榔或水檳榔(廣西百色)，山柑科(Capparidaceae)山柑屬(Capparis)植物，主要分布于我國熱帶、亞熱帶地區(qū)，是產(chǎn)于我國廣西、云南東南部和貴州南部等省區(qū)的高海拔(800-1600m)地區(qū)一種多年生常綠木質(zhì)藤本、攀援灌木，高達數(shù)米至十?dāng)?shù)米，也是一種珍稀的瀕危野生果樹。馬檳榔的種子去皮后可入藥，是“上清丸”的重要藥源。種仁性苦、甘、寒，具有催產(chǎn)、避孕、清熱解毒、治咽喉腫痛、惡瘡腫毒，生津潤肺、助消化、去斑痧和醒酒等多種功效。其種仁食之還有經(jīng)久甜味，是因富含甜蛋白mabinlin所致(Liu等，Purification，completeaminoacidsequenceandstructuralcharacterizationoftheheat-stablesweetprotein.mabinlinII，Eur.JBiochem.，211281-287，1993)。馬檳榔的種子呈扁螺旋形，胚位于種仁中央，胚軸呈肥大的條狀盤于子葉周圍，胚軸是貯藏蛋白質(zhì)和油脂的主要場所。馬檳榔種子中的甜味成分為mabinlin(MBL)蛋白(稱馬賓靈或馬檳榔甜蛋白)，它是馬檳榔種子的主要貯藏蛋白，約占種仁干重的4％(胡忠等，馬檳榔甜味蛋白的研究I，云南植物研究，5(2)207-212，1983)，占全種子干重的1.4％(Liu等，Purification，completeaminoacidsequenceandstructuralcharacterizationoftheheat-stablesweetprotein，mabinlinII，Eur.JBiochem.，211281-287，1993)，該蛋白是一種具有強堿性的清蛋白(albumin)，存在于胚軸細(xì)胞的蛋白體中，占蛋白體總蛋白含量的90％，其甜度約是蔗糖的375倍(以重量比較為基礎(chǔ))，甜味閾值約為0.1％。馬檳榔是全世界6種產(chǎn)甜味蛋白的植物之一，且是我國獨有、唯一的植物甜蛋白資源植物。馬檳榔甜蛋白mabinlin有4種同工蛋白，分別為MBLI-1、II、III、IV，這些蛋白基因的cDNA序列都已被克隆和測序，其中MBLII的分子量為10.4KD，等電點為11.3，在酸性條件下比較穩(wěn)定，且在100℃保溫48h仍可保持其甜味活性(Liu等，Purification，completeaminoacidsequenceandstructuralcharacterizationoftheheat-stablesweetprotein，mabinlinII，Eur.JBiochem.，211281-287，1993)。與其它甜蛋白相比，mabinlin蛋白的甜度雖不是很高(如甜蛋白thaumatin的甜度約為蔗糖的3000倍)，但其耐酸性好，熱穩(wěn)定性高，且是所有甜蛋白中熱穩(wěn)定性最高的(Faus等，Recentdevelopmentsinthecharacterizationandbiotechnologicalproductionofsweet-tastingproteins，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53(2)145-51，2000)，因此最有希望成為新型的食品添加劑，甚至成為甜味劑蔗糖的部分替代品，因此對馬檳榔及其甜蛋白mabinlin進行深入研究具有重要意義。作為占胚軸蛋白體總蛋白含量90％的馬檳榔甜蛋白mabinlin，其基因的啟動子可能是種子特異性表達的強啟動子，而且作為一種清蛋白，其基因的啟動子可能具有與已知種子特異性啟動子(如legA、napA、napB和Zein等基因的啟動子)不同的應(yīng)用價值，因此mabinlin基因(MBL)啟動子的克隆具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個具有繁殖器官，特別是種子特異性的mabinlin基因的啟動子。本發(fā)明所提供的繁殖器官特異性啟動子，名稱為MBL-P695，來源于山柑屬植物馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)，其核心功能片段是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO2的DNA序列；2)序列表中SEQIDNO3的DNA序列；3)序列表中SEQIDNO4的DNA序列；4)與序列表中SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。序列表中的SEQIDNO2由300個堿基組成；序列表中的SEQIDNO3由424個堿基組成；序列表中的SEQIDNO4由510個堿基組成。所述具有上述核心功能片段的種子特異性啟動子MBL-P695，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO5的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動基因轉(zhuǎn)錄功能及種子特異性的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下洗膜。序列表中的SEQIDNO5由695個堿基組成。含有本發(fā)明啟動子及其核心功能片段的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增MBL-P695及其核心功能片段中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供了種子特異性啟動子MBL-P695及其核心功能片段，該啟動子是采用GenomeWalking法從山柑屬馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)中克隆的種仁甜蛋白mabinlin基因的啟動子。擬南芥轉(zhuǎn)基因試驗證明MBL-P695及其核心功能片段能賦予GUS報告基因在植物植物繁殖器官(特別是種子)中高水平表達，具有較強的組織特異性。本發(fā)明一方面有助于深入闡明MBL基因在馬檳榔中的表達調(diào)控機理，并為MBL基因遺傳轉(zhuǎn)化常規(guī)作物，如大豆、玉米、水稻、咖啡和各種瓜果蔬菜等奠定了理論基礎(chǔ)，將在植物(包括單子葉和雙子葉植物，尤其是種子植物)的品質(zhì)改良中發(fā)揮重要作用；另一方面，由于MBL是一種清蛋白，而許多功能蛋白(如酶)和生理活性成分等都是清蛋白，因此本發(fā)明MBL基因的啟動子MBL-P695及其核心功能片段對多肽藥物類功能蛋白基因的表達也顯示出獨特優(yōu)勢和潛在的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。圖1A為第一輪巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖1B為第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為含有啟動子MBL-P695序列的DNA片段的序列分析結(jié)果圖3為植物表達載體pVKH-35S-GUS-pA的物理圖譜圖4為PCR擴增的MBL-P779系列缺失片段及對照LegA-P的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果及融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表達載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖5A為MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd轉(zhuǎn)基因擬南芥根、莖、葉的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果圖5B為MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd轉(zhuǎn)基因擬南芥花的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果圖6為MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果圖7為MBL-Pb轉(zhuǎn)基因擬南芥開花后第6、10、12、14、16、18、20天種子的GUS原位組織化學(xué)染色結(jié)果圖8為MBL-Pb轉(zhuǎn)基因擬南芥種子不同部位的GUS原位組織化學(xué)染色結(jié)果具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，所用馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)采自廣西百色地區(qū)靖西縣舊州境內(nèi)海拔1500m左右的山坡灌木叢，當(dāng)?shù)厝私兴畽壚啤嵤├?、含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695的DNA片段的克隆一、含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695序列的DNA片段的克隆用ClontechLaboratoryInc公司的UniversalGenomeWalker試劑盒克隆含有馬檳榔MBL基因啟動子(命名為MBL-P695)序列的DNA片段，具體過程如下1、引物設(shè)計根據(jù)馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)MBL基因的cDNA序列(GI1817545)及上述試劑盒說明書的要求設(shè)計2條MBL基因的特異嵌套引物，引物序列如下pM15’-acctcgataacggtggtctggatgga-3’pM25’-ggtctggatggaggcgttcgctagga-3’，再將pM1和pM2分別與試劑盒自帶的接頭引物AP1、AP2組成2對引物pM1/AP1和pM2/AP2。2、巢式PCR擴增含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695序列的DNA片段1)GenomeWalker文庫的構(gòu)建用常規(guī)方法提取馬檳榔葉片的基因組DNA，并參照上述試劑盒說明書用DraI、EcoRV、PvuII和StuI四種平末端內(nèi)切酶對提取的馬檳榔葉片基因組DNA進行酶切消化，連接接頭得到四種GenomeWalker文庫。2)巢式PCR擴增以步驟1)構(gòu)建的GenomeWalker文庫為模板，分別在pM1/AP1和pM2/AP2兩對引物的引導(dǎo)下進行2輪巢式PCR，第一輪PCR反應(yīng)條件為先94℃2s，72℃3min，7個循環(huán)；然后94℃2s，67℃3min，37個循環(huán)；最后67℃4min；第二輪PCR反應(yīng)條件為先94℃2s，70℃3min，5個循環(huán)；然后94℃2s，65℃3min，30個循環(huán)；最后65℃4min。每輪反應(yīng)結(jié)束后，均對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，第一輪巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1A所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道S以StuIGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道P以PvuIIGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道E以EcoRVGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道D以DraIGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物)，第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1B所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道P以PvuIIGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道E以EcoRVGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道D以DraIGenomeWalker文庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物)，回收并純化DraI文庫泳道上的四條帶和PvuII文庫泳道上的一條帶，將回收DNA片段連接至載體pMD18-T購自(Takara公司)中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序，結(jié)果由DraI文庫中擴增的其中3個DNA片段的長度分別為337bp、672bp和885bp，這3個DNA片段都是MBL基因上游的特異目的片段，且前2個片段都被包含在最長的第3個片段中，將最長片段去掉接頭引物后的長度為851bp，其3’端長72bp的序列與MBL基因cDNA5’端序列的同源性達到100％，表明已成功克隆到含有MBL基因5’上游區(qū)啟動子的序列，即序列表中SEQID№1的核苷酸序列，由779個堿基組成，將該片段命名MBL-P779。用BiologyWorkBench3.2軟件對該序列進行酶切位點分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段中具有7個DraI酶切位點，這便是由DraI文庫擴增出多條帶的原因。二、含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695序列的DNA片段的序列分析用NCBI網(wǎng)站的Blastn程序?qū)Σ襟E一獲得的含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695序列的DNA片段MBL-P779進行比對分析，結(jié)果沒有找到序列同源性信息，表明所分離的馬檳榔MBL基因的啟動子MBL-P695是一個新的啟動子。用在線軟件NNPP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)對其保守序列元件進行預(yù)測和分析，結(jié)果如圖2所示，自5’端第220-270位堿基為核心啟動子區(qū)域I，自5’端第677-727位堿基為核心啟動子區(qū)域II，發(fā)現(xiàn)在該啟動子序列里除含有轉(zhuǎn)錄起始位點(自5’端第260位和第717位堿基)、TATA-box(自5’端第230-238位堿基，自5’端第310-318位堿基，自5’端第685-691位堿基)、和ACGT-box(自5’端第544-552位堿基，自5’端第677-684位堿基)基本啟動子元件外，還含有RY-repeat(自5’端第663-668位堿基)、napin-motif(自5’端第625-631位堿基)、E-box(自5’端第36-41位堿基，自5’端第652-657位堿基)、I-box(自5’端第170-175位堿基，自5’端第544-548位堿基，自5’端第568-572位堿基)和CAAT重復(fù)序列(自5’端第275-278位堿基，自5’端第297-300位堿基，自5’端第361-364位堿基，自5’端第455-458位堿基)等大量種子特異表達相關(guān)的保守序列元件，暗示MBL基因可能受種子發(fā)育階段的調(diào)控，其啟動子是一個種子特異表達的啟動子。實施例2、馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695及其核心功能片段的獲得及馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695的組織化學(xué)分析一、融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表達載體的構(gòu)建先設(shè)計四對引物以用PCR的方法對實施例1獲得的含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695的DNA片段MBL-P779進行系列缺失，并在缺失片段的兩端分別添加限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI識別位點，引物序列如下用于擴增缺失片段MBL-Pa的引物Pa15’-ctggagctcatcaaaatgctaaccgcct-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識別位點)Pm5’-catggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)；用于擴增缺失片段MBL-Pb的引物Pb15’-ctggagctctaaaagaatctacaaaac-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識別位點)Pm5’-catggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)；用于擴增缺失片段MBL-Pc的引物Pc15’-ctggagctcttatacaggtatagactcaat-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識別位點)Pm5’-catggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)；用于擴增缺失片段MBL-Pd的引物Pd15’-ctggagctctttagtcatgtatgggacac-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識別位點)Pm5’-catggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)。以實施例1獲得的含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695的DNA片段MBL-P779為模板，分別在上述4對引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖4所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道aMBL-Pa，泳道bMBL-Pb，泳道cMBL-Pc，泳道dMBL-Pd)，結(jié)果用上述4對引物進行PCR擴增分別獲得了長度約為300bp、424bp、510bp和695bp的DNA片段，回收這4個DNA片段并將回收片段分別連接至載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明上述4個DNA片段確實為實施例1獲得的含有馬檳榔MBL基因啟動子MBL-P695DNA片段MBL-P779的系列缺失片段，且序列兩端分別添加有限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI識別位點，將這4個缺失片段分別命名為MBL-Pa(300bp)、MBL-Pb(424bp)、MBL-Pc(510bp)和MBL-Pd(695bp)。然后用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對上述4個缺失片段進行雙酶切，再將4個酶切片段分別與經(jīng)相同酶雙酶切的植物表達載體pVKH-35S-GUS-pA(Hygr，13.29kb，物理圖譜見圖3)連接，使酶切片段取代pVKH-35S-GUS-pA中GUS基因上游的CaMV35S啟動子，先對重組載體進行PCR鑒定(檢測引物為上述PCR擴增各MBL-P779缺失片段的引物)，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了大小分別為300bp、424bp、510bp和695bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對重組載體進行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道ApVKH-35S-GUS-Pa的SacI和BamHI雙酶切產(chǎn)物，泳道BpVKH-35S-GUS-Pb的SacI和BamHI雙酶切產(chǎn)物，泳道CpVKH-35S-GUS-Pc的SacI和BamHI雙酶切產(chǎn)物，泳道DpVKH-35S-GUS-Pd的SacI和BamHI雙酶切產(chǎn)物)，PCR及SacI和BamHI雙酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，表明獲得了插入序列及位置均正確的分別含有融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段MBL-Pa(300bp)、MBL-Pb(424bp)、MBL-Pc(510bp)和MBL-Pd(695bp)的植物表達載體，依次命名為pVKH-35S-GUS-Pa、pVKH-35S-GUS-Pb、pVKH-35S-GUS-Pc和pVKH-35S-GUS-Pd。對四種植物表達載體進行測序，測序結(jié)果表明MBL-Pa具有序列表中SEQIDNO2的核苷酸序列，由300個堿基組成；MBL-Pb具有序列表中SEQIDNO3的核苷酸序列，由424個堿基組成；MBL-Pc具有序列表中SEQIDNO4的核苷酸序列，由510個堿基組成；MBL-Pd具有序列表中SEQIDNO5的核苷酸序列，由695個堿基組成。同時，以來自豌豆(Pisumsativum)的種子特異表達的leguminA(legA)基因的啟動子LegA-P(Genbank號GI20777)作為陽性對照，該啟動子的克隆方法為用CTAB方法提取豌豆苗基因組DNA，然后以提取的豌豆苗基因組DNA為模板，在引物A1(5’-gtggatcctttagaattatttttttag-3’，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)和A2(5’-tattcgaaattctcttacaaccaacta-3’，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切HindIII識別位點)的引導(dǎo)下進行PCR擴增，得到長度為1245bp的legA基因的啟動子LegA-P序列，并在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII識別位點。用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII對PCR產(chǎn)物進行酶切，并與經(jīng)相同酶雙酶切的克隆載體pBluescriptII(購自Takara公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明插入序列與legA基因的啟動子LegA-P序列的同源性為100％，將該含有LegA-P的重組克隆質(zhì)粒命名為pBS-legA。以pBS-legA質(zhì)粒為模板，在引物P15’-catggatccgaatgttggttgtgatgcgg-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)和引物P25’-ctggagctcttggcgtctcattgattgac-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識別位點)的引導(dǎo)下PCR擴增legA啟動子的LegA-P，同時在擴增片段的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI的識別位點，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖4所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道eLegA-P)，經(jīng)PCR擴增獲得長度約為1245bp的DNA片段，再用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對擴增的LegA-P片段進行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的植物表達載體pVKH-35S-GUS-pA連接，先用引物P1和P2對該重組載體進行PCR進行鑒定，再用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對重組載體進行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道MDNAMarkerDL2000+15000，泳道EpVKH-35S-GUS-LegA-P的SacI和BamHI雙酶切產(chǎn)物)，PCR及SacI和BamHI雙酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，表明獲得了插入序列及位置均正確的含有融合GUS基因的LegA-P的植物表達載體，命名為pVKH-35S-GUS-LegA-P。二、分別轉(zhuǎn)化有融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表達載體的擬南芥的組織化學(xué)分析1、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得在農(nóng)桿菌LBA4404的介導(dǎo)下，用真空滲入轉(zhuǎn)化法將步驟一構(gòu)建的5個植物表達載體和具有35S啟動子的載體pVKH-35S-GUS-pA(用作組成型表達的陽性對照)分別轉(zhuǎn)化Columbia生態(tài)型的擬南芥(Arabidopsisthaliana)，篩選陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。2、MBL-P779系列缺失片段驅(qū)動GUS基因表達情況的組織特異性分析對步驟1獲得的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉和花用GUS原位組織化學(xué)活性分析方法對MBL-P779及其系列缺失片段驅(qū)動GUS基因表達情況的組織特異性進行檢測，其中，根、莖和葉中GUS基因的表達情況如圖5A所示(apVKH-35S-GUS-Pa轉(zhuǎn)化植株，bpVKH-35S-GUS-Pb轉(zhuǎn)化植株，cpVKH-35S-GUS-Pc轉(zhuǎn)化植株，dpVKH-35S-GUS-Pd轉(zhuǎn)化植株，epVKH-35S-GUS-LegA-P轉(zhuǎn)化植株，opVKH-35S-GUS-pA轉(zhuǎn)化植株，ck陰性對照)，花中GUS基因的表達情況如圖5B所示(apVKH-35S-GUS-Pa轉(zhuǎn)化植株，bpVKH-35S-GUS-Pb轉(zhuǎn)化植株，cpVKH-35S-GUS-Pc轉(zhuǎn)化植株，dpVKH-35S-GUS-Pd轉(zhuǎn)化植株，epVKH-35S-GUS-LegA-P轉(zhuǎn)化植株，opVKH-35S-GUS-pA轉(zhuǎn)化植株，ck陰性對照)，MBL基因啟動子MBL-P779各缺失片段MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd都不能驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉中表達(圖5A中的圖a-圖d)，但MBL-Pd可驅(qū)動GUS基因在花中較強表達(圖5B中的圖d)，而MBL-Pa、MBL-Pb和MBL-Pc的花表達活性很弱或不明顯。3、MBL-P779系列缺失片段啟動活性的強度分析對步驟1獲得的T2代(和/或T3代也可)轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子用GUS原位組織化學(xué)活性分析方法對MBL-P779系列缺失片段啟動活性的強度進行檢測，GUS基因的表達情況如圖6所示(apVKH-35S-GUS-Pa轉(zhuǎn)化植株，bpVKH-35S-GUS-Pb轉(zhuǎn)化植株，cpVKH-35S-GUS-Pc轉(zhuǎn)化植株，dpVKH-35S-GUS-Pd轉(zhuǎn)化植株，epVKH-35S-GUS-LegA-P轉(zhuǎn)化植株，opVKH-35S-GUS-pA轉(zhuǎn)化植株，ck陰性對照)，MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd轉(zhuǎn)基因植株種子的顯色都比MBL-Pa轉(zhuǎn)基因植株的種子深，而MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd轉(zhuǎn)基因植株種子間的顯色深淺差異不顯著，MBL-Pa轉(zhuǎn)基因植株種子與legA-P轉(zhuǎn)基因植株種子的顏色深淺接近，表明MBL-Pa驅(qū)動GUS表達的能力與種子特異性啟動子legA-P基本相當(dāng)，而MBL-Pb、MBL-Pc、MBL-Pd的驅(qū)動能力都比MBL-Pa的強。上述結(jié)果說明MBL-Pd即為馬檳榔MBL基因的啟動子MBL-P695，是一個具有繁殖器官特異性，特別是種子特異性的強啟動子，MBL-Pa、MBL-Pb和MBL-Pc是啟動子MBL-P695的必需序列，即核心功能片段。4、MBL基因啟動子MBL-P695驅(qū)動基因表達的時序分析在步驟1獲得的MBL-P695核心功能片段MBL-PbT2代轉(zhuǎn)基因擬南芥開花后第6、10、12、14、16、18、20天對其種子進行GUS原位組織化學(xué)染色，以分析啟動子MBL-P779驅(qū)動基因表達的時序，不同時間的GUS染色結(jié)果如圖7所示，開花后第12天開始，啟動子MBL-P695開始在種子中驅(qū)動GUS基因表達，約到第16天表達水平達到最高峰(藍色最深)，之后種子的GUS顯色一直維持在較高水平，表明啟動子MBL-P695驅(qū)動基因表達受發(fā)育階段的調(diào)控，啟動子MBL-P695主要在種子成熟的中后期驅(qū)動GUS基因表達，表達時間與擬南芥種子自身貯藏蛋白mabinlin的積累同步，從而也更進一步證明MBL基因啟動子MBL-P695是種子特異性啟動子。5、MBL基因啟動子MBL-P695在種子中的表達定位在步驟1獲得的MBL-P695核心功能片段MBL-PbT2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子的不同部位進行GUS原位組織化學(xué)染色，以對啟動子MBL-P695在種子中啟動基因的表達部位進行定位，結(jié)果如圖8所示，啟動子MBL-P695主要在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的胚中驅(qū)動GUS基因表達，在種皮中GUS基因沒有表達，其中在胚根、胚軸中的表達活性強于子葉；與此相呼應(yīng)的是，馬檳榔種子胚的胚軸長而膨大，子葉較小，胚軸是貯藏蛋白mabinlin的主要貯藏場所(胡忠等，馬檳榔甜味蛋白的研究II，云南植物研究，7(2)187-195，1985)，因此在上述轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的胚軸中觀察到GUS基因最強表達。序列表<160>5<210>1<211>779<212>DNA<213>山柑屬馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)<400>1ttggcatttttaaatttttattttatgtttttatacaaatgtttttcaaaaagtaaatat60aaaattcacttttttagtcatgtatgggacacaaattttaaattcattttcgaccctctt120caaaggttttcttatttaaaatttttttaaaaaaaattatagacatatagataaggacct180attttttattttatttttttatctaaattaagatccaacttgatccacatataaaataaa240cccgatagaaaatttatttatacaggtatagactcaattcataccaagccaaaaaccaat300ccgcaccattatataaataaattaaagttagtggttacaactttaaaagaatctacaaaa360caattttattttaatatatatagaatttaaaatattaaatcgaagttatttttttacaaa420aaaaaacctagtaaattatgaaattatttttgtgcaattatgcaaaaatcaaaatgctaa480ccgcctaatttataagtataccttacaaaaggttatagatctccctctctctttaaattt540ttcgataacgttaaaacccgcaacttcgataatgtctcctgctcaacacgcaacatattg600cgtgtattattatttgatcattgttacacataatcatctcatctattcttacacgtgatc660gccatgcaaagtcctcaacgttcgtataaatatacccaccaaataatcccctcgtcacct720cactcatcacccaacaaaaccctaataacaagaacacacactcacccaaaaccttagca779<210>2<211>300<212>DNA<213>山柑屬馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)<400>2atcaaaatgctaaccgcctaatttataagtataccttacaaaaggttatagatctccctc60tctctttaaatttttcgataacgttaaaacccgcaacttcgataatgtctcctgctcaac120acgcaacatattgcgtgtattattatttgatcattgttacacataatcatctcatctatt180cttacacgtgatcgccatgcaaagtcctcaacgttcgtataaatatacccaccaaataat240cccctcgtcacctcactcatcacccaacaaaaccctaataacaagaacacacactcaccc300<210>3<211>424<212>DNA<213>山柑屬馬檳榔(Capparismasaikailévl.)<400>3taaaagaatctacaaaacaattttattttaatatatatagaatttaaaatattaaatcga60agttatttttttacaaaaaaaaacctagtaaattatgaaattatttttgtgcaattatgc120aaaaatcaaaatgctaaccgcctaatttataagtataccttacaaaaggttatagatctc180cctctctctttaaatttttcgataacgttaaaacccgcaacttcgataatgtctcctgct240caacacgcaacatattgcgtgtattattatttgatcattgttacacataatcatctcatc300tattcttacacgtgatcgccatgcaaagtcctcaacgttcgtataaatatacccaccaaa360taatcccctcgtcacctcactcatcacccaacaaaaccctaataacaagaacacacactc420accc424<210>4<211>510<212>DNA<213>山柑屬馬檳榔(CapparismasaikaiLévl.)<400>4ttatacaggtatagactcaattcataccaagccaaaaaccaatccgcaccattatataaa60taaattaaagttagtggttacaactttaaaagaatctacaaaacaattttattttaatat120atatagaatttaaaatattaaatcgaagttatttttttacaaaaaaaaacctagtaaatt180atgaaattatttttgtgcaattatgcaaaaatcaaaatgctaaccgcctaatttataagt240ataccttacaaaaggttatagatctccctctctctttaaatttttcgataacgttaaaac300ccgcaacttcgataatgtctcctgctcaacacgcaacatattgcgtgtattattatttga360tcattgttacacataatcatctcatctattcttacacgtgatcgccatgcaaagtcctca420acgttcgtataaatatacccaccaaataatcccctcgtcacctcactcatcacccaacaa480aaccctaataacaagaacacacactcaccc510<210>5<211>695<212>DNA<213>山柑屬馬檳榔(Capparismasaikailévl.)<400>5tttagtcatgtatgggacacaaattttaaattcattttcgaccctcttcaaaggttttct60tatttaaaatttttttaaaaaaaattatagacatatagataaggacctattttttatttt120atttttttatctaaattaagatccaacttgatccacatataaaataaacccgatagaaaa180tttatttatacaggtatagactcaattcataccaagccaaaaaccaatccgcaccattat240ataaataaattaaagttagtggttacaactttaaaagaatctacaaaacaattttatttt300aatatatatagaatttaaaatattaaatcgaagttatttttttacaaaaaaaaacctagt360aaattatgaaattatttttgtgcaattatgcaaaaatcaaaatgctaaccgcctaattta420taagtataccttacaaaaggttatagatctccctctctctttaaatttttcgataacgtt480aaaacccgcaacttcgataatgtctcctgctcaacacgcaacatattgcgtgtattatta540tttgatcattgttacacataatcatctcatctattcttacacgtgatcgccatgcaaagt600cctcaacgttcgtataaatatacccaccaaataatcccctcgtcacctcactcatcaccc660aacaaaaccctaataacaagaacacacactcaccc69權(quán)利要求1.種子特異性啟動子的核心功能片段，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO2的DNA序列；2)序列表中SEQIDNO3的DNA序列；3)序列表中SEQIDNO4的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核心功能片段，其特征在于所述核心功能片段是序列表中SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4的DNA序列。3.含有權(quán)利要求1或2所述核心功能片段的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。4.權(quán)利要求1或2所述的種子特異性啟動子的核心功能片段在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。5.含有權(quán)利要求1所述核心功能片段的種子特異性啟動子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的啟動子，其特征在于所述啟動子是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO5的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動基因轉(zhuǎn)錄功能及種子特異性的核苷酸序列3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的啟動子，其特征在于所述啟動子是序列表中SEQIDNO5的DNA序列。8.含有權(quán)利要求5或6或7所述啟動子的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。9.權(quán)利要求5或6或7所述的種子特異性啟動子在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明公開了一個種子特異性啟動子及其應(yīng)用，其目的是提供一個來源于馬檳榔的種子特異性啟動子及其在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。該啟動子是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№5的DNA序列；2)與序列表中SEQID№5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動基因轉(zhuǎn)錄功能及種子特異性的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID№5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明一方面有助于深入闡明MBL基因在馬檳榔植物中的表達調(diào)控機理，并為MBL基因遺傳轉(zhuǎn)化常規(guī)作物奠定理論基礎(chǔ)，將在植物的品質(zhì)改良中發(fā)揮重要作用；另一方面，本發(fā)明對多肽藥物類功能蛋白基因的表達也顯示出獨特優(yōu)勢和潛在的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/82GK1920039SQ20061011315公開日2007年2月28日申請日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日發(fā)明者郭建春,劉四新,胡新文申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所