專利名稱：抗氟甲喹的單克隆抗體、其制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗氟甲喹的單克隆抗體、其制備方法及其應用，屬于免疫化學技術領域。
背景技術：
氟甲喹(flumequine，F(xiàn)LU)是一種屬于第二代喹諾酮的抗菌藥，從20世紀70年代陸續(xù)在歐盟和日本等國家廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對各種革蘭氏陰性菌感染所致的疾病具有很好的療效。我國在近幾年有不少廠家開發(fā)生產(chǎn)氟甲喹，主要用于鮭魚、鱒魚、各種蝦、鰻魚以及豬雞等細菌感染性疾病的防治。
氟甲喹作為用于食品動物中的藥物，其在動物可食性組織和產(chǎn)品中的殘留毒性備受關注。由于氟甲喹在小鼠的18個月的常規(guī)致癌試驗中引起肝細胞瘤，JECFA(the Food and Agriculture Organization(FAO)/World HealthOrganization(WHO)Joint Expert Committee on Food Additivies)認為其致癌作用并非是由遺傳毒性引起，所以在1997年第48次JECFA會議制定了氟甲喹在鱒魚的MRL(500μg/kg)[WHO，1997]。然后2002年1月EMEA(the EuropeanAgency for the Evaluation of Medicinal Products)根據(jù)其對腸道菌群的作用，制定了微生物學日許量(ADI)為495μg/人，以及氟甲喹在牛、羊、豬、雞、火雞以及魚中的MRL(表1)(Flumequine(Extension to all food producingspecies)，www.emea.eu.int/pdfs/vet/mrls/082302en.pdf)。
表1氟甲喹的MRL(歐盟)


但是1999年Yoshida報道飼料中4000mg/kg的氟甲喹飼喂30周可以引起肝臟出現(xiàn)壞死灶(Yoshida M，Miyajima K，Shiraki K et al.Cancer letter，1999，14199-107)；2001年Takizawa報道氟甲喹具有引發(fā)和促進肝臟腫瘤發(fā)生的作用(Takizawa T，Mitsumori K，Takagi H et al.J Toxicol Pathol，2001，14135-143)；2002年Kashida報道氟甲喹具有引發(fā)和促進肝臟腫瘤作用與其引起DNA鏈斷有關(Kashida Y，Sasaki YF，Ohsawa K，Yokohama N，Takahashi A，Watanabe T，Mitsumori K.Mechanistic study on flumequine hepatocarcinogenicityfocusing on DNA damage in mice.Toxicol Sci.2002 Oct；69(2)317-321)。因此在2003年第60次會議上JECFA撤消1999年WHO制定的ADI(WHO TRS 879，1998)以及氟甲喹在豬、牛、羊、雞魚的MRL(WHO TRS 879，1998；WHOTRS 900，2001)(Summary report of the 60th meeting of JECFA(2003))。
鑒于氟甲喹的潛在毒性以及世界各國對氟甲喹在動物性食品中的殘留檢測的重視，國外已經(jīng)有美國的Diffchamb公司的氟甲喹ELISA試劑盒(LOD為0.1μg/kg)和美國ELISA Technologies Inc.的氟甲喹ELISA試劑盒(LOD為0.1μg/kg)。
為了建立氟甲喹ELISA試劑盒，需要制備特異強的、可大量生產(chǎn)的抗氟甲喹的抗體。本研究從合成氟甲喹的免疫原及包被原出發(fā)，用單抗制備技術制備了抗氟甲喹的單克隆抗體，為研制氟甲喹殘留檢測的ELISA試劑盒打下了基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性強、可大量生產(chǎn)抗氟甲喹的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抗氟甲喹殘留的單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種抗氟甲喹殘留的單克隆抗體在制備氟甲喹殘留檢測的ELISA試劑盒中的應用。
本發(fā)明的還一目的是提供一種分泌特異性抗氟甲喹的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
本發(fā)明所述的抗氟甲喹的單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細胞株2D12CGMCC No.1830產(chǎn)生的。
所述的小鼠雜交瘤細胞株2D12 CGMCC No.1830，已于2006年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
本發(fā)明的氟甲喹(flumequine，F(xiàn)LU)屬于小分子化合物，分子量為261，其本身不具有免疫原性，只有反應原性，不能直接刺激動物產(chǎn)生抗體，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原，才能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。
本發(fā)明所述的抗氟甲喹的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟先將氟甲喹分別和載體牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)制備免疫原(FLU-BSA)和包被原(FLU-OVA)，然后通過小鼠免疫、細胞融合、篩選出雜交瘤細胞株，再進行培養(yǎng)、純化成單克隆抗體。
其中，本發(fā)明所述的氟甲喹免疫原，是采用碳二亞胺法將氟甲喹(FLU)和載體牛血清白蛋白偶聯(lián)反應生成的。其原理是通過氟喹諾酮類藥物的羧基官能團與載體蛋白BSA上的游離氨基之間的縮合反應進行的。用該免疫原免疫Balb/c小鼠，小鼠血清效價能達到1∶102,400。
所述的氟甲喹包被原，是用混合酸酐法將氟甲喹(FLU)和卵清蛋白偶聯(lián)而成的。
本發(fā)明通過FLU-BSA免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，取得免疫小鼠血清，再建立間接ELISA和間接競爭ELISA法來測定免疫小鼠的血清效價及抗體的特異性，以確定小鼠是否有特異性抗體產(chǎn)生。
選取免疫反應強的小鼠，利用細胞融合技術，將免疫小鼠的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞株，篩選出分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株2D12 CGMCC No.1830。
最后將雜交瘤細胞株制備腹水，純化腹水而得到小鼠抗氟甲喹的特異性的單克隆抗體。
本發(fā)明抗氟甲喹殘留的單克隆抗體可用于制備氟甲喹殘留檢測的ELISA試劑盒。
本發(fā)明所提供的抗氟甲喹的單克隆抗體制備方法包括用合成的免疫原免疫小鼠，用免疫動物的脾細胞與小鼠雜交瘤細胞融合，用間接競爭ELISA方法篩選分泌抗氟甲喹抗體的細胞株，用該細胞株體內(nèi)誘導產(chǎn)生腹水，大量制備單克隆抗體。
本發(fā)明采用碳二亞胺法和混合酸酐法將氟甲喹(FLU)和載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián)，合成人工免疫原FLU-BSA和包被原FLU-OVA。用人工免疫原免疫Balb/c小鼠，利用細胞融合技術，將免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，用FLU-OVA作為包被原，建立間接競爭ELISA方法篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。獲得的細胞株的細胞培養(yǎng)上清效價在1∶4000以上，IC50為55ng/ml；細胞上清液對恩諾沙星、二氟沙星、氧氟沙星、噁喹酸和諾氟沙星的交叉反應率小于或等于1％。利用細胞株制備的腹水，純化后效價可以達到1∶640,000以上。本發(fā)明抗氟甲喹的單克隆抗體特異性強、并能大量生產(chǎn)，可用于研制氟甲喹酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，能快速和靈敏地測定動物性食品及水產(chǎn)品中氟甲喹的殘留量。
本發(fā)明所述細胞株為小鼠雜交瘤細胞株2D12，已于2006年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1830。


圖1為本發(fā)明所述BSA的掃描圖譜；圖2為本發(fā)明所述氟甲喹的掃描圖譜；
圖3為本發(fā)明所述FLU-BSA的掃描圖；圖4為本發(fā)明所述OVA掃描圖譜；圖5為本發(fā)明所述FLU-OVA掃描圖；圖6為本發(fā)明所述2D12細胞上清的標準曲線；圖7為本發(fā)明所述3E2細胞上清的標準曲線。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1免疫原(FLU-BSA)和包被原(FLU-OVA)的制備氟甲喹(flumequine，F(xiàn)LU)屬于小分子化合物，分子量為261，其本身不具有免疫原性，只有反應原性，不能直接刺激動物產(chǎn)生抗體，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原，才能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。本研究采用碳二亞胺法和混合酸酐法將FLU分別與BSA、OVA相偶聯(lián)，合成了免疫原與包被原。
1.1氟甲喹免疫原的合成與鑒定本研究采用碳二亞胺法合成氟甲喹人工抗原，其原理是通過氟喹諾酮類藥物的羧基官能團與載體蛋白BSA上的游離氨基之間的縮合反應進行的，合成具體步驟如下準確稱取氟甲喹7.8mg，先用2mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入11.6mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和30.5mg碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)，于磁力攪拌器上反應24h，室溫避光，命名為反應A液。稱取39.6mg牛血清白蛋白(BSA)溶于5mL磷酸鹽緩沖液PBS中，制成反應B液。在磁力攪拌器上，將反應液A液緩慢逐滴加入到反應B液中，混合液于室溫下避光，攪拌反應4h。收集反應液轉(zhuǎn)入預處理過的透析袋中，4℃攪拌下，對0.01mol/L PBS透析3天，每天更換透析液2～3次。收集透析液，分裝，-20℃保存。
Flu-BSA合成原理R-COOH代表氟甲喹； 代表NHSR1-NH2代表載體蛋白BSA；R-CO-NH-R1代表偶聯(lián)產(chǎn)物對徹底透析后的氟甲喹免疫原進行紫外掃描分析，得到它們的紫外吸收光圖譜見圖1-圖3。經(jīng)紫外掃描，氟甲喹的最大吸收峰波長為330nm，BSA的最大吸收峰波長分別為278nm和280nm，而FLU-BSA偶聯(lián)物的最大吸收峰波長分別出現(xiàn)在312nm，可見藥物在與BSA偶聯(lián)后吸收峰發(fā)生漂移，可以間接判斷偶聯(lián)成功。
1.2氟甲喹包被原的合成與鑒定采用混合酸酐法合成氟甲喹包被原，具體合成步驟如下準確稱取氟甲喹標準品7.8mg，用1.5mL DMF完全溶解，置于冰乙醇中預冷，隨后加入4.5μl三乙胺和6μl氯甲酸異丁酯，室溫下反應10min，制成反應A液。稱取20.25mg卵清白蛋白(OVA)溶于3mL pH9.6碳酸鹽緩沖液中，制成反應B液。在磁力攪拌作用下，將1.134mLA液緩慢加入到B液中(每mLB液中加入378μlA液)，室溫避光，攪拌反應4h以上。收集反應液轉(zhuǎn)入透析袋中，4℃攪拌下，對pH9.6碳酸鹽緩沖液透析3天，每天更換透析液2-3次。收集透析液，分裝，-20℃保存。
注R-COOH代表氟甲喹；NH2-OVA代表OVAFlu-OVA合成原理對OVA及徹底透析后的氟甲喹包被原進行紫外掃描分析，其紫外吸收光譜見圖4、圖5。氟甲喹的最大吸收峰波長為330nm(圖2)，OVA的最大吸收峰波長為280nm(圖4)，而FLU-OVA的最大吸收峰波長出現(xiàn)在314nm(圖5)?？梢娝幬镌谂c蛋白偶聯(lián)后吸收峰發(fā)生漂移，可以間接判斷偶聯(lián)成功。
實施例2抗氟甲喹的單克隆抗體的制備2.1材料氟甲喹標準品，牛血清白蛋白(BSA)，卵清白蛋白(OVA)，碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，弗氏完全佐劑(FCA)，弗氏不完全佐劑(FICA)，鄰苯二胺(OPD)，HAT和HT(50×濃縮)，Sigma公司；二甲基甲酰胺(DMF)，氯甲酸異丁酯，三乙胺，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，廣州化學試劑廠；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，武漢博士德生物工程有限公司；吐溫-20，Amresco公司；聚乙二醇4000(PEG4000)，Merck公司；雙抗(青鏈霉素)，HYCLONE公司；二甲基亞砜(DMSO)，廣州展晨生物有限公司；胎牛血清，小牛血清，HYCLONE公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，Gibco公司；脫脂奶粉，新西蘭進口分裝。
Balb/c小鼠(雌性、8～12周齡)，昆明鼠，南方醫(yī)科大學實驗動物中心，SP2/0細胞，本實驗室保存。
2.2試驗方法2.2.1動物免疫首次免疫時，取FLU-BSA免疫原與等量弗氏完全佐劑乳化，按100μg/只的劑量腹腔注射，免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠3只，以后每隔3周免疫1次，共免疫5次。
2.2.2 ELISA檢測方法的建立在小鼠第3次免疫后的7～10天，尾部采血，室溫靜置1h，然后4℃冰箱放置2h，3000rpm離心10min分離血清，4℃保存。建立間接ELISA和間接競爭ELISA法測定血清效價及特異性。
2.2.2.1間接ELISA方法的建立采用方陣法確定最適包被原濃度，具體操作步驟如下。
(1)包被用碳酸鹽緩沖溶液將包被原稀釋成一系列濃度加入酶標板中，100μl/孔，置于37℃水浴中孵育2h包被；(2)洗滌甩凈包被液，用洗滌液I(500mL 0.01mol/L pH7.4 PBS加入250μl吐溫配制成)洗板3～4遍，每次間隔1min，最后用PBS洗板1次，在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200μl 5％脫脂奶粉，37℃孵育2小時后洗滌拍干；(4)加一抗加入系列稀釋的血清抗體，100μl/孔，37℃孵育1小時；(5)洗滌同(2)；(6)加酶標二抗加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶20000稀釋)，100μl/孔，37℃孵育1小時，洗板同上；(7)顯色每孔加入100μl鄰苯二胺(OPD)底物顯色液，37℃顯色10min；(8)終止加入2mol/L的H2SO4 50μl/孔，酶標儀讀取各孔OD490。
判定標準陽性血清OD490在1.0～1.5左右抗原包被濃度和抗體稀釋度為最佳工作濃度。陽性血清(P)和陰性血清(N)比值P/N≥2.1所對應的陽性血清稀釋倍數(shù)為血清效價(具體結(jié)果見表2)。
2.2.2.2間接競爭ELISA方法的建立(1)包被用最適包被原濃度包被酶標板中，100μl/孔，置于37℃水浴中孵育2h或4℃過夜包被；(2)洗滌甩凈包被液，用洗滌液I洗板3～4遍，每次間隔1min，最后用PBS洗板1次，在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200μl 5％脫脂奶粉，37℃孵育2h后洗滌拍干；(4)加樣在酶標板的相鄰兩列先加入抗血清做倍比稀釋，50μl/孔；然后其中一列每孔加入適當濃度的氟甲喹標準品50μl/孔，而另一列加抗體稀釋液作為對照，37℃孵育1h；(5)洗滌用洗滌液I洗板3～4遍，每次間隔1min，再用PBS洗板1次，在吸水紙上拍干；
(6)加酶標二抗加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶20,000稀釋)，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板同上；(7)顯色每孔加入100μl OPD底物顯色液，37℃顯色10min；(8)終止加入2mol/L H2SO4 50μl/孔，酶標儀讀取各孔OD490。
判定標準肉眼觀察抑制孔與未抑制孔的顏色變化，若抑制孔顏色顏色變淺，則說明有特異性抗體產(chǎn)生，反之則無；OD值測定酶標儀讀取各孔OD490，若抑制孔OD490值變小，說明有特異性抗體產(chǎn)生。同時可根據(jù)競爭抑制率的大小判斷抗體的特異性。
競爭抑制率＝1-B/B0(其中B為加入競爭物抑制孔的OD值，B0為不加競爭物的陽性對照孔的OD值)。(具體結(jié)果見表3)2.2.3雜交瘤細胞的制備與篩選選取一只免疫反應強的小鼠，于融合前3天用不加佐劑的抗原沖擊免疫，利用細胞融合技術，用50％PEG4000作融合劑，將免疫脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合。采用間接ELISA和間接競爭ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清液中的抗體。陰性對照孔(SP2/0上清和陰性血清)應該接近無色，陽性對照孔(免疫小鼠血清)應明顯顯色。測定OD值，若雜交瘤細胞上清液檢測孔OD值大于或等于陰性對照孔的2.1倍，即為陽性孔；若加入藥物的抑制孔顏色變淺，則說明該雜交瘤細胞分泌特異性的抗氟甲喹抗體。采用有限稀釋法對陽性雜交瘤進行克隆，經(jīng)4次亞克隆后，對10株分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株的細胞培養(yǎng)上清，采用已建立的間接ELISA方法測定效價，并用間接競爭ELISA測定氟甲喹對上清OD值的抑制。
2.2.4單克隆抗體的制備采用體內(nèi)誘導產(chǎn)生腹水法大量制備單克隆抗體，具體步驟如下①選擇8～10周的雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐劑。
②7～10天后，用生理鹽水將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞稀釋成5×105個/mL的懸液，每只小鼠注射0.5mL。
③8天后，小鼠腹部明顯膨大，用針頭穿刺腹腔，收集腹水，4℃ 5000rpm離心10min，收集上清液，分裝，-80℃凍存。
采用辛酸-硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體，具體步驟如下①取腹水2mL，加入0.06mol/L pH4.0 NaAC-HAC緩沖液4mL，攪拌均勻。
②用1mol/L NaOH調(diào)整pH至4.8。
③按每mL腹水加入33μL辛酸的量，于磁力攪拌器上，向上述調(diào)好pH的腹水中緩慢加入66μL正辛酸，攪拌30min。
④4℃ 6000rpm離心30min，取上清，用0.1mol/L NaOH調(diào)整pH至7.2。
⑤向上清液中緩慢滴加等量飽和(NH4)2SO4(pH7.2～7.4)溶液，邊加邊攪拌，此時(NH4)2SO4溶液終濃度為50％，攪拌30min后，靜置1h，4℃ 6000rpm離心30min。
⑥棄上清，用5.5mL 0.01mol/L pH7.2 PBS溶解沉淀，于磁力攪拌器上，緩慢滴加4.5mL飽和(NH4)2SO4溶液，此時(NH4)2SO4溶液終濃度為45％，攪拌30min后，4℃ 6000rpm離心30min。
⑦棄上清液，將沉淀溶于適量的0.01mol/L pH7.2 PBS中。
⑧將沉淀懸浮液轉(zhuǎn)入透析袋，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析3天，每天更換透析液2～3次，除去NH4+和SO42-。
2.3結(jié)果2.3.1最佳包被原濃度根據(jù)方陣法確定ELISA方法的最佳包被抗原濃度為1μg/mL，結(jié)果見表2。
表2酶標儀檢測的血清OD490

2.3.2免疫小鼠的血清效價及特異性的測定第4次加強免疫后，小鼠血清效價均能達到1∶102,400，見表3(效價孔)。效價孔是指該孔中不含氟甲喹藥物，可用于測定血清效價。在間接ELISA中，加入5μg/mL的氟甲喹標準品作競爭ELISA時，OD值顯著降低，說明抗血清是針對氟甲喹的，結(jié)果見表3(抑制孔)。
表3免疫原血清效價及特異性測定(OD值)

2.3.3雜交瘤細胞的建立經(jīng)過4次克隆，篩選到10株能穩(wěn)定分泌抗氟甲喹單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對其中兩株進行分析鑒定，命名為2D12、3E2。
該小鼠雜交瘤細胞株2D12 CGMCC No.1830已于2006年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
2.3.4細胞上清液效價的測定將兩株細胞的上清作倍比稀釋后用間接ELISA檢測。結(jié)果見表4。判定標準陽性上清(P)和陰性上清(N)比值P/N≥2.1，且P-N＞0.2所對應的上清稀釋倍數(shù)為其效價。兩株細胞上清效價均達到1∶4000，并同時用OVA包被酶標板，結(jié)果表明所分泌抗體對OVA無反應，因此可以確定所篩選到的細胞株具有特異性，且針對FLU的。
表4細胞培養(yǎng)上清效價的測定(OD值)

注包被原FLU-OVA濃度為1μg/mL，OVA濃度為10μg/mL，酶標二抗稀釋倍數(shù)為1∶200002.3.5細胞上清液中單抗特異性的測定將細胞上清液適當稀釋后，與梯度濃度的氟甲喹標準溶液做間接競爭性ELISA，重復測定3次，結(jié)果見表5。以抑制率為縱坐標，藥物濃度的對數(shù)為橫坐標作圖，求兩株細胞的培養(yǎng)上清對氟甲喹的IC50。結(jié)果見圖6、圖7。2D12、3E2細胞上清液對FLU的IC50值分別為55ng/mL、75ng/mL。
表5兩株細胞培養(yǎng)上清的抑制

2.3.6細胞上清液中單抗交叉反應將恩諾沙星、二氟沙星、氧氟沙星、噁喹酸和諾氟沙星稀釋成梯度濃度的標準品，與細胞上清液做間接競爭性ELISA，結(jié)果表明細胞上清液對參與測試的5種同類藥物的最高交叉反應率為1％。見表6。
表6細胞上清液與其他喹諾酮類藥物的交叉反應

2.3.8腹水效價的測定用2D12注射小鼠腹腔制備腹水，用辛酸-硫酸銨法進行純化，經(jīng)間接ELISA法檢測，腹水效價達到1∶640,000以上。
2.4結(jié)論獲得10株分泌抗氟甲喹抗體的雜交瘤細胞株。其中2D12細胞株，細胞培養(yǎng)時得到的抗體效價均在1∶4000以上，制備的純化腹水效價可以達到1∶640,000以上，對FLU的IC50值分別為55ng/mL，細胞上清與恩諾沙星、二氟沙星、氧氟沙星、噁喹酸和諾氟沙星的交叉反應率低于1％。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗氟甲喹單克隆抗體，其特征在于其由小鼠雜交瘤細胞株2D12CGMCC No.1830產(chǎn)生的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于小鼠雜交瘤細胞株2D12細胞上清液對FLU的IC50值為55ng/mL。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述的抗氟甲喹單克隆抗體方法，其特征在于包括如下步驟先將氟甲喹分別和載體牛血清白蛋白、卵清白蛋白偶聯(lián)制備免疫原和包被原，然后通過小鼠免疫、細胞融合、篩選出雜交瘤細胞株2D12，再進行培養(yǎng)、純化成單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的氟甲喹免疫原采用碳二亞胺法制備，用所述免疫原免疫Balb/c小鼠，小鼠血清效價達到1∶102,400。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的氟甲喹包被原采用混合酸酐法制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任意一項所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述小鼠免疫為通過氟甲喹免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，取得免疫小鼠血清，再建立間接ELISA和間接競爭ELISA法來測定免疫小鼠的血清效價及抗體的特異性。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任意一項所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的細胞融合為選取免疫反應強的小鼠，用融合劑將免疫小鼠的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞株。
8.權(quán)利要求1或2所述抗氟甲喹單克隆抗體在用于制備氟甲喹殘留檢測的ELISA試劑盒中的應用。
9.一種能分泌抗氟甲喹單克隆抗體的細胞株為小鼠雜交瘤細胞株2D12CGMCC No.1830。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗氟甲喹單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細胞株2D12CGMCC No.1830產(chǎn)生的。其制備方法為采用碳二亞胺法和混合酸酐法將氟甲喹和載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián)，合成人工免疫原FLU－BSA和包被原FLU－OVA；用合成的免疫原FLU－BSA免疫Balb/c小鼠，將免疫脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，用包被原FLU－OVA建立間接競爭ELISA方法篩選能分泌特異性抗體的細胞株。獲得的細胞株的細胞培養(yǎng)上清效價在1∶4000以上，IC
文檔編號C12N5/18GK1974600SQ200610114109
公開日2007年6月6日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者曾振靈, 楊桂香, 黃思秀, 陳杖榴, 黃顯會, 賀利民, 丁煥中 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學