專利名稱：兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范圍，特別涉及兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)學(xué)者做過(guò)人的陰道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，所以我們申請(qǐng)了北京市科委的一項(xiàng)基金，作為關(guān)于人陰道上皮細(xì)胞模型建立和上皮細(xì)胞與白色念珠菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)費(fèi)來(lái)源。實(shí)驗(yàn)采用了組織塊法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，用角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)17005-042)作為主要細(xì)胞培養(yǎng)基。但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，K-SFM培養(yǎng)的原代細(xì)胞初期的生長(zhǎng)速度慢，單純K-SFM培養(yǎng)的陰道原代上皮細(xì)胞數(shù)量少，傳代困難，所以傳代成功率不高(約10％左右)，經(jīng)常因?yàn)閭鞔《鵁o(wú)法獲得大量細(xì)胞。查閱許多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)外進(jìn)行組織塊法的人陰道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)是用于永生化細(xì)胞系的研究，陰道上皮細(xì)胞數(shù)量要求不高，國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面的研究，而我們的陰道上皮細(xì)胞與白色念珠菌共培養(yǎng)試驗(yàn)中需要大量細(xì)胞，所以在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一種新方法，即兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法，這種方法能使我們獲得足夠量的陰道上皮細(xì)胞。國(guó)外也有兩種培養(yǎng)基聯(lián)合運(yùn)用培養(yǎng)上皮原代細(xì)胞的例子，但均為先是有血清培養(yǎng)基(2-7天)培養(yǎng)再到無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，與直接采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)相似，陰道上皮細(xì)胞同樣傳代困難。而我們的方法是無(wú)血清培養(yǎng)基+含血清培養(yǎng)基的人陰道上皮原代細(xì)胞序貫培養(yǎng)，目前采用這種方法獲取大量人陰道上皮細(xì)胞尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法。
本實(shí)施方案是對(duì)人陰道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明，普通培養(yǎng)過(guò)程如下(1)陰道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)1.1 取材
1)陰道前后壁膨出行全子宮切除的患者的陰道組織；2)子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的患者的陰道組織；3)所有標(biāo)本術(shù)前宮頸陰道細(xì)胞學(xué)檢查無(wú)異常，抗感染篩查均陰性，標(biāo)本均來(lái)源于未絕經(jīng)患者；4)術(shù)后病理均為良性疾病。
1.2 從手術(shù)室取下的新鮮的陰道組織放在加有慶大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的4℃ D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《細(xì)胞培養(yǎng)》介紹方法常規(guī)配制)的無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)，(三種抗生素等量混合液與D-Hank’s液的體積比為1∶100)。
1.3 消毒用上述1.2的加有抗生素的D-Hank’s液徹底清洗三遍。
1.4 分離用眼科手術(shù)剪刀去除多余的皮下組織，以減少成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞的污染。
1.5 接種將上皮組織切成0.2～0.3厘米的小塊，并盡快接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
1.6 培養(yǎng)將組織碎塊接種于一次性培養(yǎng)瓶中，加入1.5ml兩性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)17005-042)(三種抗生素等量混合液與無(wú)血清培養(yǎng)基的體積比均1∶100)，倒置3小時(shí)，在37℃濃度為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.7 換液3天后用上述1.6的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行第一次換液，之后每2-3天換液一次。
2. 陰道上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至85％-90％時(shí)，準(zhǔn)備傳代。
2.2 吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2.3 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml D-Hank’s液，清洗細(xì)胞后倒掉。
2.4 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1.5ml體積比濃度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品)和體積比濃度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司產(chǎn)品)等量混合的消化液。
2.5 37℃消化3-6分鐘。
2.6 倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、大部分細(xì)胞已從培養(yǎng)瓶底部脫落后，加入1.5ml含體積比濃度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，把液體收集入無(wú)菌離心管。
2.7 800rpm離心3分鐘。
2.8 棄去上清，加入新鮮的含抗生素的無(wú)血清培養(yǎng)基(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，二者體積比為1∶1)，吹打成單細(xì)胞懸液，取一滴在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.9 按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代。
2.10 細(xì)胞傳代后次日用上述2.8的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行換液，體外可傳7-9代，但因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量少傳代成功率低。
在組織塊培養(yǎng)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，單純采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代細(xì)胞時(shí)只有較少組織塊有細(xì)胞爬出(這可能與手術(shù)中電刀操作、反復(fù)鉗夾或術(shù)前陰道沖洗準(zhǔn)備等損傷的原因有關(guān))，而且K-SFM培養(yǎng)的原代細(xì)胞初期的生長(zhǎng)速度慢，所以單純K-SFM培養(yǎng)的陰道原代上皮細(xì)胞數(shù)量少，傳代困難，所以傳代成功率不高(約10％)，經(jīng)常因?yàn)閭鞔《鵁o(wú)法獲得大量細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果不同于國(guó)外的上皮原代細(xì)胞培養(yǎng)兩種培養(yǎng)基聯(lián)合運(yùn)用的例子，即先為有血清培養(yǎng)基(2-7天)再到無(wú)血清培養(yǎng)基，這與直接采用無(wú)血清培養(yǎng)基一樣傳代困難，陰道上皮原代細(xì)胞傳代成功率只有10％左右。本申請(qǐng)的原代細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(2周左右)、原代細(xì)胞有血清培養(yǎng)基(2周左右)然后再傳代細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的陰道上皮鱗狀細(xì)胞培養(yǎng)方法，簡(jiǎn)單易行，而且成功率高，傳代成功率達(dá)到80％左右。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的是提供一種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法，人陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下1.陰道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)1.1取材1)陰道前后壁膨出行全子宮切除的患者的陰道組織；
2)子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的患者的陰道組織；3)所有標(biāo)本術(shù)前宮頸陰道細(xì)胞學(xué)檢查無(wú)異常，抗感染篩查均陰性，標(biāo)本均來(lái)源于未絕經(jīng)患者；4)術(shù)后病理均為良性疾病。
1.2從手術(shù)室取下的新鮮的陰道組織放在加有抗生素慶大霉素50μg/ml，青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《細(xì)胞培養(yǎng)》介紹方法常規(guī)配制)的無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)。
1.3 消毒用上述1.2加有抗生素的D-Hank’s液徹底清洗三遍。
1.4 分離用眼科手術(shù)剪刀去除多余的皮下組織，以減少成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞的污染。
1.5 接種將上皮組織切成0.2～0.3厘米的小塊，并盡快接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
1.6 培養(yǎng)將組織碎塊接種于一次性培養(yǎng)瓶中，加入1.5ml的兩性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)17005-042)(三種抗生素等量混合液與無(wú)血清培養(yǎng)基的體積比均1∶100)，倒置3小時(shí)，在37℃濃度為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.7 換液3天后用上述1.6的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行第一次換液，之后每2-3天換液一次。
1.8 培養(yǎng)2周左右取出組織塊，往K-SFM中加入體積比濃度10％胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)繼續(xù)培養(yǎng)約2周左右，原代細(xì)胞數(shù)量大大增加。
2. 陰道上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至85％-90％時(shí)，準(zhǔn)備傳代。
2.2 吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2.3 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml D-Hank’s液，清洗細(xì)胞后倒掉。
2.4 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1.5ml體積比濃度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品)和體積比濃度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司產(chǎn)品)等量混合的消化液。
2.5 37℃消化3-6分鐘。
2.6 倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、大部分細(xì)胞已從培養(yǎng)瓶底部脫落后，加入1.5ml含體積比濃度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，把液體收集入無(wú)菌離心管。
2.7 800rpm離心3分鐘。
2.8 棄去上清，加入新鮮的含抗生素的無(wú)血清培養(yǎng)基(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，二者體積比為1∶1)，吹打成單細(xì)胞懸液，取一滴在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.9 按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代。
2.10 細(xì)胞傳代后次日用上述2.8的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行換液，體外可傳7-9代，傳代成功率高。
在原代細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)采用無(wú)血清培養(yǎng)基+含血清培養(yǎng)液序貫培養(yǎng)，即原代細(xì)胞最初2周左右為K-SFM培養(yǎng)，取出組織塊，往K-SFM中加入10％胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)繼續(xù)培養(yǎng)約2周左右，就可以得到較多的細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代成功率大大提高，細(xì)胞傳代后再采用單純K-SFM培養(yǎng)。這樣移去組織塊再加血清就避免了成纖維細(xì)胞污染，而且短期使用血清可以迅速使原代細(xì)胞大量增殖，可使傳代成功率達(dá)到80％左右，同時(shí)傳代后去掉血清，繼續(xù)K-SFM培養(yǎng)，對(duì)上皮細(xì)胞的體外存活時(shí)間和經(jīng)過(guò)多次不同患者組織標(biāo)本培養(yǎng)的結(jié)果證明對(duì)增殖能力均無(wú)明顯影響。
權(quán)利要求
1.一種兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞的方法，其特征在于所述對(duì)人陰道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程如下(1)陰道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)1.1取材1)陰道前后壁膨出行全子宮切除的患者的陰道組織；2)子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的患者的陰道組織；3)所有標(biāo)本術(shù)前宮頸陰道細(xì)胞學(xué)檢查無(wú)異常，抗感染篩查均陰性，標(biāo)本均來(lái)源于未絕經(jīng)患者；4)術(shù)后病理均為良性疾病；1.2從手術(shù)室取下的新鮮的陰道組織放在加有慶大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液的無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)；1.3消毒用上述1.2的加有抗生素的D-Hank’s液徹底清洗三遍；1.4分離用眼科手術(shù)剪刀去除多余的皮下組織，以減少成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞的污染；1.5接種將上皮組織切成0.2～0.3厘米的小塊，并盡快接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；1.6培養(yǎng)將組織碎塊接種于一次性培養(yǎng)瓶中，加入1.5ml兩性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液的角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)17005-042)，倒置3小時(shí)，在37℃，體積比濃度為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1.7換液3天后用上述1.6的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行第一次換液，之后每2-3天換液一次；1.8培養(yǎng)2周左右取出組織塊，往K-SFM中加入體積比濃度10％胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)繼續(xù)培養(yǎng)約2周左右，原代細(xì)胞數(shù)量大大增加；(2)陰道上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)2.1細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至85％-90％時(shí)，準(zhǔn)備傳代；2.2吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；2.3向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml D-Hank’s液，清洗細(xì)胞后倒掉；2.4向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1.5ml體積比濃度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品)和體積比濃度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司產(chǎn)品)等量混合的消化液；2.5 37℃消化3-6分鐘；2.6倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、大部分細(xì)胞已從培養(yǎng)瓶底部脫落后，加入1.5ml含體積比濃度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，把液體收集入無(wú)菌離心管；2.7800rpm離心3分鐘；2.8棄去上清，加入新鮮的含抗生素的無(wú)血清培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，取一滴在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，其中抗生素為青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml，二者體積比為1∶1；2.9按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代；2.10細(xì)胞傳代后次日用上述2.8的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行換液，體外可傳7-9代，傳代成功率高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)陰道上皮細(xì)胞的方法，其特征在于所述兩性霉素B 0.25μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液與無(wú)血清培養(yǎng)基的體積比為1∶100。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)陰道上皮細(xì)胞的方法，其特征在于，所述慶大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml三種抗生素等量混合液與D-Hank’s液的體積比為1∶100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)陰道上皮細(xì)胞的方法，其特征在于所述無(wú)血清培養(yǎng)基為角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)17005-042)；并且在原代細(xì)胞組織塊法培養(yǎng)中，可在一定階段去掉組織塊同時(shí)短期加入胎牛血清，達(dá)到原代細(xì)胞數(shù)大量增長(zhǎng)、傳代成功率高而基本不影響細(xì)胞的純度和壽命這一目的。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于人陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范圍的一種培養(yǎng)基聯(lián)合序貫培養(yǎng)細(xì)胞的方法。即用無(wú)血清培養(yǎng)基+含血清培養(yǎng)基的序貫培養(yǎng)，從而可以迅速使陰道上皮原代細(xì)胞大量增殖，傳代成功率在80％左右。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1970742SQ200610114239
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月2日
發(fā)明者廖秦平, 吳文湘, 楊慧霞, 劉朝暉, 張岱, 余麗 申請(qǐng)人:廖秦平, 吳文湘