專利名稱：汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵 制備丙酮丁醇的方法。
背景技術(shù)：
丙酮、丁醇是重要的食品和化工原料，傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝多以淀粉，糖蜜等為 原料，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylium)發(fā)酵生產(chǎn)，工藝復(fù)雜， 原料成本高。隨著秸稈等可再生資源的開發(fā)，以秸稈為原料進行微生物發(fā)酵生產(chǎn) 的研究也開始受到重視。秸稈是一類產(chǎn)量巨大，來源豐富的可再生資源，秸稈降 解后產(chǎn)生大量的可溶性糖類，包括葡萄糖，木糖等，能夠被用作丙酮丁醇梭菌發(fā) 酵的良好底物。以秸稈為原料進行丙酮丁醇發(fā)酵的研究己經(jīng)有很多，如Ropars 等利用汽爆玉米芯酶解液制取丙雨丁醇〖Ropars， et al, Bioresource technology 1992;42:197-204.]，陳守文等利用稻草酶解液[陳守文等，工業(yè)微生物， 1998;28(4):30-34]制取丙酮丁醇。由于秸稈酶解的最適溫度為5(TC，而丙酮丁醇 梭菌發(fā)酵的最適溫度為35°C，因此，現(xiàn)有的生產(chǎn)方式都要經(jīng)過原料預(yù)酶解，過 濾得到酶解液，向酶解液中添加營養(yǎng)組分，滅菌等幾個步驟，才能進行發(fā)酵生產(chǎn)， 生產(chǎn)步驟復(fù)雜，難以實^L同步酶解和連續(xù)發(fā)酵。而且，在秸稈原料酶解過程中， 需要用到大量的纖維素酶，由于纖維素酶價格昂貴，用量大，因此，酶制劑的成 本往往在整個生產(chǎn)成本中占有很大的比例，導(dǎo)致生產(chǎn)成本據(jù)高不下。而且，酶解 反應(yīng)還受到其它許多條件的限制，包括產(chǎn)物抑制，反應(yīng)速率低，缺乏適合的反應(yīng) 器等[Sen Y， Process Biochem2006;41:721-725]，生產(chǎn)效率難以提高。
此外，發(fā)酵產(chǎn)物中的溶劑，尤其是丁醇，會對細胞產(chǎn)生毒性。在丙酮丁醇梭 菌發(fā)酵過程中，當發(fā)酵液中總?cè)軇┑臐舛却笥?.3%時，就會對細胞產(chǎn)生毒害 [Eric F， et al. J Chem Tech Biotech 1996;65:221-228]。有研究采用氣提，液液抽提，
滲透蒸發(fā)以及吸附的方法對發(fā)酵液進行在線處理[Thaddeus， Bioprocess
Biosystem Eng 2005;27: 207-214. QuresM N, Renewable Energy 2001;22:557-564.]，
但都存在著設(shè)備復(fù)雜，成本高的問題。因此，必須改進發(fā)酵方式，提高發(fā)酵效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對以秸稈為原料的丙酮丁醇發(fā)酵過程中存在的處理步驟 復(fù)雜，酶制劑成本高，難以實現(xiàn)同步糖化發(fā)酵，產(chǎn)物抑制效應(yīng)顯著等問題，而提 供一種汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵裝置。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，其步 驟如下
1) 將汽爆秸稈料置于酶解罐中，加入用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的含KH2P04 、 MgS(V7H20和酵母抽提物的蒸餾水溶液；所述汽爆秸稈原料的重量和蒸餾水溶
液的體積的比例為l: 7 1: 10 (W/V，下同)；同時加入纖維素酶制劑，加入量
為每g汽爆秸稈添加20FPU的纖維素酶制劑；并將酶解罐置入5(TC的第一水浴 鍋內(nèi)進行酶解；
將所得酶解液透過中空纖維膜組件進入置于35'C的第二水浴鍋內(nèi)的發(fā)酵罐 中，進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中為了彌補由于酶解液透出而導(dǎo)致的酶解罐中的液體量減
少，利用補液罐向酶解罐中不斷補充和酶解罐中組分相同的蒸餾水溶液，調(diào)節(jié)循環(huán) 泵的流速，使流入酶解罐的液體量和經(jīng)由中空纖維膜滲透出的酶解液的量相同，以
保持酶解罐中的上述固液比；
2) 制備丙酮丁醇梭菌種子液
將丙酮丁醇梭菌接種于種子培養(yǎng)基后，在35'C厭氧環(huán)境下培養(yǎng)至對數(shù)生長 期，第IJ得丙酮丁醇梭菌種子液；
所述種子培養(yǎng)基所含組分及配比為每升種子培養(yǎng)基含20g葡萄糖，3g酵 母抽提物，0.2gKH2PO4， 1.6gK2HP04, 0.2g MgS04'7H20， O.lgNaCl， O.Olg CaCl2, 0.25g Na2S.9H20， O.Olg N^lo04'2H20， 0.2g NaHC03 0.2g和3.0g 4;
3)開啟循環(huán)泵，使酶解罐中的酶解液透過中空纖維膜組件進入發(fā)酵罐中；
在進入發(fā)酵罐中的酶解液體積達到100 120ml時，關(guān)閉循環(huán)泵，向發(fā)酵罐中接 種上述丙酮丁醇梭菌種子液，并迅速通入氮氣除氧后，置于35'C靜止培養(yǎng)，到 對數(shù)生長期后，再次開啟循環(huán)泵，稀釋率為0.05~0.07511-1，進行循環(huán)酶解和連續(xù) 發(fā)酵，制取丙酮丁醇。
本發(fā)明提供的汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，所述 步驟3)的循環(huán)酶解和連續(xù)發(fā)酵過程中還包括每隔20 28h向酶解罐中補充新 鮮的汽爆秸稈料，補充量為初始添加的汽爆秸稈原料重量的20 60%，同時補 加新鮮的纖維素酶制劑，補加量每克新補充的汽爆秸稈料補加8~15 FPU的纖 維素酶制劑。
所述汽爆植物秸稈料為汽爆玉米秸稈料、汽爆高梁秸稈料或汽爆小麥秸稈料。 所述上述步驟l)中還包括管道和發(fā)酵罐的滅菌。
所述步驟(2)中，發(fā)酵所用菌種丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 購自中國微生物保藏管理委員會普通微生物保藏中心，其保藏號為CGMCC ASU32。
所述步驟3)中空纖維膜組件和發(fā)酵罐之間通過U形管連通。 本發(fā)明的方法所使用的循環(huán)酶解耦合發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)如下請參見圖l，該裝 置包括酶解罐4和發(fā)酵罐8，其特征在于，還包括補液罐3和中空纖維膜組件6-， 所述補液罐3頂端與酶解罐4頂端通過安裝在其連接管道上的第二循環(huán)泵21相 連通；所述酶解罐4頂端與中空纖維膜組件6的輸入端通過安裝在其連接管道上 的閥門5相連通，其連接管道上還安裝有第二壓力表P2;所述酶解罐4底端與 中空纖維膜組件6的輸入端通過安裝在其連接管道上的第一循環(huán)泵2相連通，其 連接管道上還安裝有第一壓力表Pl;所述中空纖維膜組件6的輸出端與發(fā)酵罐8 頂端通過U形管相連通；所述酶解罐4和發(fā)酵罐8分別置于第一水浴鍋1和第 二水浴鍋9中。
本發(fā)明提供的汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備—丙酮丁醇的方法與現(xiàn) 有制備丙酮丁醇的方法相比，具有如下優(yōu)點
1、本發(fā)明方法中的秸稈原料酶解和微生物發(fā)酵分別在各自最適宜的條件下
進行，提高了酶解和發(fā)酵效率；
2、 本發(fā)明方法釆用中空纖維膜循環(huán)組件進行秸稈原料的酶解，水解產(chǎn)生的 糖經(jīng)中空纖維膜組件分離到發(fā)酵罐中，纖維素酶分子被膜截留，回到酶解罐中繼 續(xù)降解底物，有效解除了酶解產(chǎn)物對酶的抑制效應(yīng)，并節(jié)約了纖維素酶的用量， 降低了生產(chǎn)成本；
3、 本發(fā)明的方法采用汽爆秸稈進行酶解得到酶解液連續(xù)進入發(fā)酵罐，在連 續(xù)補充營養(yǎng)的同時對發(fā)酵液不斷進行稀釋，使溶劑產(chǎn)物的濃度保持在較低水平， 避免了溶劑產(chǎn)物濃度過高對菌體產(chǎn)生毒性和抑制作用；
4、 本發(fā)明的方法中的膜循環(huán)組件采用的中空纖維膜為聚砜膜，截留分子量 為10,000 Da，經(jīng)由該膜滲透到發(fā)酵罐中的發(fā)酵液為無菌，省去了發(fā)酵過程中的 滅菌過程，同時微生物發(fā)酵所需無機鹽和氮源等直接添加到酶解介質(zhì)中，與酶解 液一起進入發(fā)酵罐，簡化了操作步驟。
總之，本發(fā)明的方法利用中空纖維膜裝置進行汽爆秸稈原料的循環(huán)酶解， 所得到的酶解液連續(xù)進入發(fā)酵罐中，不斷補充營養(yǎng)和稀釋產(chǎn)物，使微生物保持在
高活性的狀態(tài)，同時有效避免了酶解和發(fā)酵的產(chǎn)物抑制；膜循環(huán)裝置使得纖維素 酶能夠被重復(fù)利用，大大降低了酶制劑的成本；利用該裝置使酶解和發(fā)酵在各自 最適的條件下進行，提高了反應(yīng)效率。


圖1為本發(fā)明方法使用的膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)示意圖 其中第一水浴鍋l 第一循環(huán)泵2 補液罐3
酶解罐4 閥門5 中空纖維膜裝置6
發(fā)酵罐8 第二水浴鍋9 第二循環(huán)泵:21
U形管ll
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明進一步說明。
實施例1.用本發(fā)明提供的方法以汽爆玉米秸稈為原料進行丙酮丁醇的制
取，具體步驟如下
1、 以玉米秸稈為原料，首先進行汽爆預(yù)處理汽爆介質(zhì)為水蒸汽，向裝有玉米秸稈料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐壓力達到1.5MPa，維持6min后，立即 打開閥門，使罐壓迅速降至常壓，得到汽爆玉米秸稈料；
向酶解罐4中加入汽爆玉米秸稈以及用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的含KH2PO4 0.3g， MgS(V7H2O0.5g和酵母抽提物2g的蒸餾水溶液；所述汽爆秸稈料的重量和蒸餾 水溶液體積的比例為1: 7 (w/v);同時加入纖維素酶制劑，加入量為20FPU/g-汽爆秸稈；補液罐3中裝入與酶解罐4組成相同組分的蒸餾水溶液；第一水浴鍋 1保持在50°C;
2、 制備丙酮丁醇梭菌種子液
按每升種子培養(yǎng)基包括以下組分的比例配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g,酵母抽提物3g， KH2P04 0.2g， K2HP04 1.6g, MgS04.7H20 0.2g， NaCl O.lg， CaCl2 0.0 lg, Na2S-9H20 0.25g， NaMo04.2H20 O.Olg， NaHC03 0.2g and (NH4)2S04 3.0g;
將丙酮丁醇梭菌接種于所述種子培養(yǎng)基，在35'C厭氧條件下培養(yǎng)至對數(shù)生 長期，即可制得丙酮丁醇梭菌種子液；
3、 同時開啟兩個循環(huán)泵，使酶解罐中的酶解液透過中空纖維膜組件進入發(fā) 酵罐中；在進入發(fā)酵罐中酶解液體積達到100ml時，關(guān)閉循環(huán)泵，向發(fā)酵罐中接 種上述丙酮丁醇梭菌種子液，并迅速通入氮氣除氧后，置于35'C靜止培養(yǎng)。到 對數(shù)生長期后，再次同時開啟兩個循環(huán)泵開始循環(huán)，稀釋率為O.05h'1，酶解液 連續(xù)進入發(fā)酵罐中，。
4、 在汽爆秸稈循環(huán)酶解耦合發(fā)酵的過程中，.每隔20h向酶解罐中補充新鮮 底物，補充量為初始添加的汽爆秸稈料重量的40%，同時補加新鮮的纖維素酶 制劑，補加量為10FPU/g-新鮮底物。
由于酶解罐和發(fā)酵罐容量的限制，發(fā)酵在144h結(jié)束，三種主要產(chǎn)物丙酮、 丁醇和乙醇的產(chǎn)量分別為1.84 g/l， 5.28g/l和0.71 g/l。單位底物酶解所需的纖維 素酶為14FPU/g底物，與批次發(fā)酵相比，纖維素酶酶用量節(jié)約30%;發(fā)酵過程 中溶劑的最高體積含量為1.20%，有效避免了對微生物的毒性。
實施例2.用本發(fā)明掛供的方法以汽爆小麥秸稈為原料進行丙酮丁醇的制取，具體步驟如下-
1、以小麥秸稈為原料，首先進行汽爆預(yù)處理汽爆介質(zhì)為水蒸汽，向裝有
玉米秸稈料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐壓力達到1.5MPa,維持5min后，立即
打開閥門，使罐壓迅速降至常壓，得到汽爆小麥秸稈料；
向酶解罐4中加入汽爆小麥秸稈以及用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的含KH2PO40.3g， MgSOr7H20 0.5g和酵母抽提物2g的蒸餾水溶液；所述汽爆秸稈料的重量和蒸 餾水溶液體積的比例為1: 10(w/v);同時加入纖維素酶制劑，加入量為2FPU/g汽爆秸稈；補液罐3中裝入與酶解罐4組成相同組分的蒸餾水溶液；第一水浴鍋 l保持在50°C;
步驟2同實施例1;
3、 同時開啟兩個循環(huán)泵，使酶解罐中的酶解液透過中空纖維膜組件進入發(fā) 酵罐中；在進入發(fā)酵罐中酶解液體積達到110ml時，停止循環(huán)，向發(fā)酵罐中接種 上述丙酮丁醇梭菌種子液，并迅速通入氮氣除氧后，置于35'C靜止培養(yǎng)。到對 數(shù)生長期后，再次同時開啟兩個循環(huán)泵開始循環(huán)，稀釋率為0.06h-1、酶解液連 續(xù)進入發(fā)酵罐中;
4、 在汽爆秸稈循環(huán)酶解耦合發(fā)酵的過程中，每隔24h向酶解罐中補充新鮮 底物，補充量為初始添加的汽爆秸稈料重量的60%，同時補加新鮮的纖維素酶 制劑，補加量為15FPU/g新鮮底物；
發(fā)酵在144h結(jié)束，丙酮，丁醇和乙醇的產(chǎn)量分別為1.64 g/l， 4.86g/l和0.63 g/l， 單位底物所用纖維素酶的添加量為14 FPU/g底物。發(fā)酵過程中溶劑的最高體積 含量為1.13%，有效避免了對微生物的毒性。
實施例3.用本發(fā)明提供的方法以汽爆高梁秸稈為原料進行丙酮丁醇的制 取，具體歩驟如下
1、以髙粱秸稈為原料，首先進行汽爆預(yù)處理汽爆介質(zhì)為水蒸汽，向裝有 玉米秸稈料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐壓力達到1.5MPa，維持7min后，立即 打開閥門，使罐壓迅速降至常壓，得到汽爆高粱秸稈料；
向酶解罐4中加入汽爆高粱秸稈以及用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的含KH2PO4 0.3g， MgS04*7H2O 0.5g和酵母抽提物2g的蒸餾水溶液；所述汽爆秸稈料的重量和蒸 餾水溶液體軹的比例為l: 8(w/v);同時加入纖維素酶制劑，加入量為2FPU/g汽爆秸稈；補液罐3中裝入與酶解罐4組成相同組分的蒸餾水溶液；第一水浴鍋 1保持在5(TC;
步驟2同實施例1;
3、 同時開啟兩個循環(huán)泵使系統(tǒng)開始循環(huán)，當進入發(fā)酵罐中的酶解液體積達 到120ml時，停止循環(huán)，向其中接種成熟的丙酮丁醇梭菌種子液，迅速通入氮氣 除氧后，置于35'C靜止培養(yǎng)，到對數(shù)生長期后，再次同時開啟兩個循環(huán)泵開始 循環(huán)，酶解液連續(xù)進入發(fā)酵罐中，稀釋率為0.075h—'。
4、 每隔20h向酶解罐中補充新鮮底物，補充量為初始添加的汽爆秸稈料重 量的50%，同時補加新鮮的纖維素酶制劑，補加量為8FPU/g新鮮底物。
發(fā)酵在168h結(jié)束，丙酮，丁醇和乙醇的產(chǎn)量分別為1.82 g/l，4.93g/1和0.76g/l， 單位底物所用纖維素酶的添加量為14 FPU/g底物。發(fā)酵過程中溶劑的最高體積 含量為1.16%，有效避免了對微生物的毒性。
權(quán)利要求
1、一種汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，其步驟如下1)將汽爆秸稈料置于酶解罐中，加入用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的含KH2PO4、MgSO4·7H2O和酵母抽提物的蒸餾水溶液；所述汽爆秸稈料的重量和蒸餾水溶液的體積比為1∶7～1∶10；同時，按每克汽爆秸稈料加入20FPU的加入量加入纖維素酶制劑；并將酶解罐置入50℃的第一水浴鍋內(nèi)進行酶解；將所得酶解液透過中空纖維膜組件進入置于35℃的第二水浴鍋內(nèi)的發(fā)酵罐，進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中為了彌補由于酶解液透出而導(dǎo)致的酶解罐中的液體量減少，利用從上部與酶解罐相連通的補液罐向酶解罐中不斷補充和酶解罐中組分相同的蒸餾水水溶液，調(diào)節(jié)安裝在所述酶解罐與中空纖維膜裝置之間管路上的循環(huán)泵的流速，以保持酶解罐中的上述固液比；2)制備丙酮丁醇梭菌種子液將丙酮丁醇梭菌接種于種子培養(yǎng)基后，在35℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制得丙酮丁醇梭菌種子液；所述種子培養(yǎng)基所含組分及配比為每升種子培養(yǎng)基含20g葡萄糖，3g酵母抽提物，0.2g KH2PO4，1.6gK2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g NaCl，0.01gCaCl2，0.25g Na2S·9H2O，0.01g NaMoO4·2H2O，0.2g NaHCO30.2g和3.0g(NH4)2SO43.0g；3)開啟循環(huán)泵，使酶解罐中的酶解液透過中空纖維膜組件進入發(fā)酵罐中；在進入發(fā)酵罐中酶解液體積達到100～120ml時，關(guān)閉循環(huán)泵，向發(fā)酵罐中接種上述丙酮丁醇梭菌種子液，并迅速通入氮氣除氧后，置于35℃靜止培養(yǎng)，到對數(shù)生長期后，再次開啟循環(huán)泵，稀釋率為0.05～0.075h-1，進行循環(huán)酶解和連續(xù)發(fā)酵，制得丙酮丁醇。
2、 按權(quán)利要求1所述的汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方 法，其特征在于，所述上述步驟3)的循環(huán)酶解和連續(xù)發(fā)酵過程中還包括每隔 20～28h向酶解罐中補充新鮮的汽爆秸稈料，補充量為初始添加的汽爆秸稈料重量的20 60%，同時補加新鮮的纖維素酶制劑，補加量每克新補充的汽爆秸 稈料補加8~15 FPU的纖維素酶制劑。
3、 按權(quán)利要求1所述的膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，其 特征在于，所述步驟3)中空纖維膜組件和發(fā)酵罐之間通過U形管連通。
4、 按權(quán)利要求1所述的膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，其 特征在于，所述汽爆植物秸稈料為汽爆玉米秸稈料、汽爆高梁秸稈料或汽爆小麥 秸稈料。
5、 按權(quán)利要求1所述的膜循環(huán)酶解耦合連續(xù)發(fā)酵制備丙酮丁醇的方法，其 特征在于，所述上述步驟l)中還包括汽爆秸稈料制取和發(fā)酵罐的滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用膜反應(yīng)器進行汽爆秸稈循環(huán)酶解并耦合丙酮丁醇連續(xù)發(fā)酵的方法。該方法利用中空纖維膜裝置進行汽爆秸稈原料的循環(huán)酶解，所得到的酶解液連續(xù)進入發(fā)酵罐中，不斷補充營養(yǎng)和稀釋產(chǎn)物，使微生物保持在高活性的狀態(tài)，同時有效避免了酶解和發(fā)酵的產(chǎn)物抑制。膜循環(huán)裝置使得纖維素酶能夠被重復(fù)利用，大大降低了酶制劑的成本。利用該裝置酶解和發(fā)酵在各自最適的條件下進行，提高了反應(yīng)效率。
文檔編號C12P7/26GK101173306SQ20061011424
公開日2008年5月7日 申請日期2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月2日
發(fā)明者李冬敏, 陳洪章 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所