專利名稱：體液中5’－核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用試劑檢測方法，特別涉及體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。
背景技術(shù)：
利用現(xiàn)代生物技術(shù)所開發(fā)的超微量測定方法，極大的推動了生物和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的各項臨床和科研工作的快速發(fā)展，為人類的科學(xué)事業(yè)和社會進步作出了非凡的貢獻。
上世紀(jì)七十年代由Arakawa首先發(fā)表了應(yīng)用魯米諾——過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進行酶免分析的技術(shù)，這一技術(shù)由于靈敏度高達10-18mol，可在20分鐘內(nèi)快速測定出結(jié)果，可簡便實現(xiàn)完全自動化，有效期長達一年以上，無放射性和致畸物質(zhì)，利于環(huán)保而受到普遍歡迎，是目前發(fā)展最迅速的檢測技術(shù)。
目前，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在免疫分析中已得到相當(dāng)普及的程度，已發(fā)展為能檢測多種生物活性物質(zhì)的常規(guī)監(jiān)床檢測方法，從免疫反應(yīng)方式分，該方法有兩種基本類型，即化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)和免疫化學(xué)發(fā)光分析(Immunochemiluminometricassay，ICMA)；從發(fā)光方式上看，一是將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記到抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后，在起動劑的作用下而發(fā)光，另一種是用酶標(biāo)記抗體或抗原，免疫反應(yīng)后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在酶催作用下而發(fā)光。
該方法雖有突出的優(yōu)點，但目前僅限于免疫分析，而在生化分析中還是空白。
5’-核苷酸酶(5’-NT)廣泛在于肝臟和各種組織中，血清中此酶升高主要見于肝膽系統(tǒng)疾病，如阻塞性黃膽、原發(fā)及繼發(fā)性肝癌等，而且通常其活力變化與ALP的變化相平行。但在骨骼系統(tǒng)疾病，通常ALP活力增高而5’-NT正常，故對ALP活力增高的患者，測定5’-NT有助于鑒別ALP活力增高的起因。
現(xiàn)在普遍使用的測定體液中5’-核苷酸酶的方法為比色法，該法是利用5’-核苷酸酶催化5’-磷酸腺苷(AMP)水解，產(chǎn)生腺苷和磷酸，用比色法測定無機磷的含量，從而計算血清中的5’-核苷酸酶的濃度。該法的不足之處主要有1、線性范圍窄。由于檢測對顏色的變化分辨率不像化學(xué)發(fā)光那么敏感，線性范圍不能完全滿足臨床檢測的需要，對高濃度的樣品需要經(jīng)稀釋后測定，帶來一定不便。
2、靈敏度不如化學(xué)發(fā)光。酶法是比顏色的深淺，而化學(xué)發(fā)光是測定光信號，靈敏度要高出許多。
3、只能用儀器操作。有的是測定酶促反應(yīng)的速率，對時間要求十分嚴(yán)格，手工或半自動操作均難達到要求，只能使用全自動設(shè)備進行。
4、全自動生化儀昂貴。目前使用的全自動生化儀幾乎全為進口，設(shè)備十分昂貴，大多在幾十萬到幾百萬之間，中小醫(yī)院難以承受，普及使用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種提供能克服上述缺陷、且靈敏度高、線性范圍寬、方便、安全的體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。解決該技術(shù)問題采用的主要技術(shù)方案體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于5’-核苷酸酶催化環(huán)腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下產(chǎn)生次黃嘌呤；次黃嘌呤經(jīng)其氧化酶作用生成過氧化氫，經(jīng)HRP催化使化學(xué)發(fā)光物發(fā)光；用已知濃度的5’-核苷酸酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的5’-核苷酸酶含量可從該曲線推算出來；所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點用化學(xué)發(fā)光物代替顯色物，達到更靈敏、更穩(wěn)定、范圍寬、更安全的目的。用該方法可以制備相應(yīng)的定量測定5’-核苷酸酶的商品試劑盒。具體優(yōu)點是①靈敏度更高。傳統(tǒng)方法是檢測顏色深淺，而化學(xué)發(fā)光是測光信號，可一個一個光子計數(shù)，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。②線性范圍寬。測顏色的深淺的分辨率比光子計數(shù)的精度要低得多，化學(xué)發(fā)光的檢測范圍高達105。③安全適用?；瘜W(xué)發(fā)光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現(xiàn)，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環(huán)境保護。④便于普及。本發(fā)明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫(yī)療和研究機構(gòu)使用。⑤巨大的社會效益。用化學(xué)發(fā)光法測定生化指標(biāo)或免疫物質(zhì)，可同用一臺化學(xué)發(fā)光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節(jié)省大量資金，不只降低了成本，對醫(yī)療機構(gòu)、患者及社會均大有益處。
具體實施例方式現(xiàn)舉例說明本發(fā)明的實施例。5’-核苷酸酶催化環(huán)腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下產(chǎn)生次黃嘌呤；次黃嘌呤經(jīng)其氧化酶作用生成過氧化氫，經(jīng)HRP催化使化學(xué)發(fā)光物發(fā)光；用已知濃度的5’-核苷酸酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的5’-核苷酸酶含量可從該曲線推算出來；所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾；這便是本發(fā)明的體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。
本發(fā)明的反應(yīng)原理用式子表示如下
一、試劑配制環(huán)腺苷緩沖液；混合酶液；5’-核苷酸酶標(biāo)準(zhǔn)(或替代品)單一或系列濃度；底物液。
二、測定程序，按下表進行，加樣單位為μl。

三、用適當(dāng)方法處理作出劑量-反應(yīng)曲線，根據(jù)樣品的RLU值從該曲線求出其血清5’-核苷酸酶的濃度?；蛑苯佑晒角蟪?’-核苷酸酶濃度＝(樣品RLU/標(biāo)準(zhǔn)RLU)×標(biāo)準(zhǔn)濃度四、也可用雙試劑測定。
本發(fā)明的靈敏度更高因為傳統(tǒng)方法是檢測顏色深淺，而本發(fā)明是測光信號，可一個一個光子計數(shù)，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。線性范圍寬這是因為傳統(tǒng)的測顏色的深淺的分辨率比光子計數(shù)的精度要低得多，本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光檢測范圍高達105。安全適用本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現(xiàn)，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環(huán)境保護。便于普及本發(fā)明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫(yī)療和研究機構(gòu)使用。社會效益巨大用本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光測定方法測定生化指標(biāo)或免疫物質(zhì)，可同用一臺化學(xué)發(fā)光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節(jié)省大量資金，不只降低了成本，對醫(yī)療機構(gòu)、患者及社會均大有益處。本發(fā)明方法簡單，適于大、中、小醫(yī)療機構(gòu)廣泛推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于5’-核苷酸酶催化環(huán)腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下產(chǎn)生次黃嘌呤；次黃嘌呤經(jīng)其氧化酶作用生成過氧化氫，經(jīng)HRP催化使化學(xué)發(fā)光物發(fā)光；用已知濃度的5’-核苷酸酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的5’-核苷酸酶含量可從該曲線推算出來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體液中5’-核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾。
全文摘要
本發(fā)明體液中5’－核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，涉及一種在生化分析中醫(yī)用試劑的化學(xué)發(fā)光測定方法。它所要解決的是現(xiàn)有檢測范圍窄、靈敏度低、操作難度大、設(shè)備昂貴等技術(shù)問題。解決該技術(shù)問題的主要技術(shù)方案體液中5’－核苷酸酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于5’－核苷酸酶催化環(huán)腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下產(chǎn)生次黃嘌呤；次黃嘌呤經(jīng)其氧化酶作用生成過氧化氫，經(jīng)HRP催化使化學(xué)發(fā)光物發(fā)光；用已知濃度的5’－核苷酸酶與測出的光信號，作出劑量－反應(yīng)曲線；未知樣品的5’－核苷酸酶含量可從該曲線推算出來。它靈敏度更高、線性范圍寬、安全適用、便于普及，適于大、中、小各類醫(yī)療機構(gòu)廣泛應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/28GK1912597SQ20061011499
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者王京, 高淑舫 申請人:福建省洪誠生物藥業(yè)有限公司