專利名稱：重組人甲狀旁腺素(1～84肽)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的方法，包括有關(guān)的基因的優(yōu)化、工程菌的構(gòu)建、重組人甲狀旁腺素(l 84肽)的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
PTH的基本生理作用是刺激破骨細(xì)胞骨吸收，使鈣、磷從骨骼中釋放，促進(jìn)腎小管對 鈣重吸收、抑制磷回吸收，增加25— (0H) D3在腎臟轉(zhuǎn)化為1， 25— (0H) 2D3，促進(jìn)腸 道對鈣、磷的重吸收。研究表明，PTH能直接增加破骨細(xì)胞數(shù)目，增加破骨細(xì)胞皺折緣， 提高破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收。然而PTH并非直接作用于破骨細(xì)胞，它通過作用于成骨 細(xì)胞，刺激其釋放破骨細(xì)胞刺激因子，促進(jìn)骨吸收，還促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶及氧自由 基產(chǎn)生，改變骨骼微環(huán)境，活化破骨細(xì)胞。低濃度PTH能夠刺激大鼠成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn) 骨合成代謝。PTH誘導(dǎo)骨形成的作用與胰島素樣生長因子一I 、 一II (IGF—I、 一II)和 e轉(zhuǎn)化生長因子(TGF—e )有關(guān)。PTH還能短暫而迅速地促進(jìn)c一fos等早期反應(yīng)基因表 達(dá)，c一fos基因?qū)τ赑TH調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能與分化具有重要作用。甲狀旁腺素是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個 氨基酸殘基，分子量約為9500，分子中不含半胱氨酸和酪氨酸，是維持血鈣恒定的主要 激素。人血漿中PTH有三種存在形式，除了完整的激素外，還包括分子量約7 000和4 500 兩種降解產(chǎn)物。目前hPTH(1 84)、 (1 38)及(1 34)片段已被應(yīng)用于臨床研究，PTH (卜84)及 PTH(1 34)已進(jìn)入III期臨床藥理研究階段，有望最早上市。目前己有的PTH制劑價(jià)格 昂貴，需注射給藥，限制了其長期應(yīng)用，開發(fā)經(jīng)濟(jì)、方便的PTH制劑十分必要。
生物工ft技術(shù)的興起及發(fā)展使得生物大分子的體外表達(dá)成為可能。PTH基因序列的闡 明也為il立體外高效表達(dá)體系的研究奠定了基礎(chǔ)。Born等(1987)將pr印roPTH基因，人 到大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pr印ro序列不能提高PTH的分泌表達(dá)，可能是由于原核 生物對真核生物的pr印ro序列不能識別。隨后，Born等將目光轉(zhuǎn)向酵母，然而天然蛋白 質(zhì)在酵母細(xì)胞中表達(dá)很不穩(wěn)定，另外一個問題是酵母細(xì)胞不易破碎。因此，pr印roPTH基 因在酵母中表達(dá)產(chǎn)量較大腸桿菌體系沒有明顯的提高。Rabbani等(1988)將人工合成的 PTH基因在大腸桿菌中表達(dá)，產(chǎn)物不均一，包括了 PTH(8-84)， PTH(3-84)， fMet-PTH和完 整PTH。為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，人們想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金 黃色葡萄球菌蛋白A的啟動子和信號肽序列在大腸桿菌中表達(dá)PTH，產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中， 分離純化方法簡單迅速。酵母6因子表達(dá)系統(tǒng)也是比較理想的融合蛋白表達(dá)體系，即用外 源基因代替a因子的編碼序列，外源蛋白會與a因子引導(dǎo)肽形成融合蛋白。在一系列與膜 相關(guān)的蛋白運(yùn)輸和分泌過程中，融合蛋白在KEX2基因產(chǎn)物類胰蛋白酶和STE13基因產(chǎn)物 二肽氨肽酶作用下生成具有正確高級結(jié)構(gòu)的外源蛋白。這些外源蛋白或直接分泌到培養(yǎng)基 中或在細(xì)胞周質(zhì)空間積累。采用a因子表達(dá)系統(tǒng)在啤酒酵母中表達(dá)PTH，也出現(xiàn)產(chǎn)物不'均 一現(xiàn)象，除了完整PTH,還有兩個不同的糖基化形式。Sung等(1991)改造了PTH基因的核 苷酸組成，利用簡并密碼使PTH(1 5)區(qū)域富含腺嘌呤，使表達(dá)產(chǎn)量有很大提高。Paulsen 等(1995)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)菌，以e -半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白方式表達(dá)產(chǎn)生hPTH， 并建立了大規(guī)模純化方法，這使hPTH大規(guī)模生產(chǎn)方面取得較大的進(jìn)展。盡管人們采用不同的表達(dá)體系以提高PTH的表達(dá)量，但由于其分子內(nèi)無二硫鍵，本 身不穩(wěn)定，以及mRNA的不穩(wěn)定，PTH的表達(dá)量都比較低。因此，迫切需要開發(fā)新的高效 生產(chǎn)重組hPTH的方法，本發(fā)明采用了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)hPTH,通過對hPTH基因的 優(yōu)化，并考慮到PTH基因較小，構(gòu)建含有優(yōu)化的hPTH基因的融合表達(dá)載體，并獲得了高 水平的表達(dá)菌株；通過控制發(fā)酵條件，達(dá)到了較高融合蛋白表達(dá)率；在此基礎(chǔ)上對可溶表 達(dá)的rhPTH的純化進(jìn)行了大量的摸索和研究后，得到了高純度、高得率、可供動物實(shí)驗(yàn)的 rhPTH蛋白。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡便的生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的 方法。本發(fā)明的另一目的就是提供優(yōu)化的重組人甲狀旁腺桌(1 84肽)的編碼序列和問于 該方法的表達(dá)載體及工程菌株。在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種優(yōu)化的編碼重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的 氨基酸序列，其特征在于，所述的重組人甲狀旁腺素G 84肽)序列為SEQ IDNO:2所 示的氨基酸序列；較佳地，編碼所述的重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的DNA序列為SEQID N0:1所示核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求l所述的核苷酸序列。，在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pThioHisA，該載體提供了一個融合蛋白一硫氧 還蛋白(HP-Thioredoxin)。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的表 達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是大腸桿菌BL2I(DE3)，是多個蛋白酶的基因缺陷菌株，基因型為力6'必卵7 P c/ts^7 // W5^7/7^57ac〃K5-77基因)，非常適合外源基因 的高效表達(dá)。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素G 84肽)的方法，該方 法包括歩驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出人甲 狀旁腺素(1 84肽)蛋白；較佳地，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)。 b)分離純化出表達(dá)的人甲狀旁腺素(1 84肽)融合蛋白。在本發(fā)明的第五方面，融合蛋白經(jīng)EK酶切后，經(jīng)進(jìn)一步純化獲得目的蛋白人甲狀 旁腺素U 84肽)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)的培養(yǎng)條件包括-培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D,為5.0左右，誘導(dǎo) 時(shí)間為3 4hr,發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在37'C，微量元素的量為0. l-2ml/L，誘導(dǎo)期的pH 值為7.0'誘導(dǎo)期IPTG濃度在O. l-lmg/L。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)過程還可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白，胨 (p印t騰)、奶粉、精氨酸等作為保護(hù)劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括步驟v) 對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾方式去除上清，獲得發(fā)酵后菌體；vi) 對發(fā)酵沉淀進(jìn)行壓搾破菌、收集壓搾上清；vii) 層析純化，所述的層析選自陰離子交換層析、金屬螯和親和層析、陽離子交換層析及其組合。viii) 采用腸激酶EK酶切后，經(jīng)進(jìn)一步純化獲得目的蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，壓搾上清經(jīng)Q—S印haroseF.F.層析、Ni螯和親和層析、 SP—Sepharose F. F.層析、EK酶切、再經(jīng)SP-Sepharose F. F.層析進(jìn)一步純化以后得到 純度大于98%、得率在20%以上的純品。


圖l. hPTH U 84肽)理論序列與hPTH U 84肽)優(yōu)化序列的同源性比較。Query:f天然hPTH Cl 84肽)基因序列；Sbjct:優(yōu)化的hPTH G 84肽)基因序列。 圖2. pThioHisA/84aaPTH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖。圖3. PTH (1 84aa)表達(dá)情況及表達(dá)定位研究。1.誘導(dǎo)前；2.誘導(dǎo)4h; 3.誘導(dǎo)5h; 4.超聲上清；5.超聲沉淀具體實(shí)施方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過優(yōu)化設(shè)計(jì)人甲狀旁腺素U 84肽)基因編 碼序列，并考慮到目的基因編碼后的目的蛋白分子量較小，將優(yōu)化后的人甲狀旁腺素 U 84肽)編碼序列構(gòu)建入合適表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得高表達(dá)菌株，并通過 優(yōu)化發(fā)酵、純化工藝，實(shí)現(xiàn)了人甲狀旁腺素U 84肽)融合蛋白高效表達(dá)，并且表達(dá) 出的人甲狀旁腺素Cl 84肽)保持生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明根據(jù)人甲狀旁腺素n 84肽)天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改 變氨基酸序列的條件下，優(yōu)化其核苷酸序列，全基因合成經(jīng)優(yōu)化的重組人甲狀旁腺素 (1 84肽)蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到pThiHisA中測序驗(yàn)證后，用分子克 隆的常規(guī)方法，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過施加抗生素篩選出表達(dá)工程細(xì)胞。 試管篩選獲得高表達(dá)工程細(xì)胞。搖瓶試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)4小時(shí)后，目的蛋白占總蛋白30% 以上，表達(dá)水平150mg/L以上。在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程。在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)重組 人甲狀旁腺素U 84肽)的發(fā)酵條件沒有特別限制。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。 例如，合適的培養(yǎng)基包括(但不限于)以下組成(i) 氮源含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母提取粉，或 二者的混合物，總濃度0.5-1%;無機(jī)氮源如氨水或(NH丄SO,等銨鹽，濃 度為O. 35_25%。Hi) 無機(jī)鹽包括磷酸鹽、C鹽、Mg"鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM， pH5-8; Mg."鹽0-5mM。在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補(bǔ)充維生素，濃度L 100()PPM。(iv) 根據(jù)MJ:咅養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加O. I-2ml/L培液。(v) 碳源為葡萄糖，是單一碳源。較佳地，葡萄糖濃度為1.0。/。，補(bǔ)料中葡萄糖 濃度為11.25%。為大規(guī)模獲得重組人甲狀旁腺素(1 84肽)，需要在發(fā)酵罐中進(jìn)行表達(dá)培養(yǎng)。本發(fā) 明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平達(dá)到500mg/L。在發(fā)酵表達(dá)后，對表達(dá)的重組人甲狀旁腺素(1 84肽)蛋白進(jìn)行分離。通常，發(fā)酵 樣品先離心獲得發(fā)酵液后沉淀即菌體。然后壓榨破菌經(jīng)離心獲得壓榨上清，后經(jīng)Q — S印harose F. F.層析、Ni2+螯和親和層析、SP— s印harose F. F.層析、EK酶切、再經(jīng)SP 一S印harose F. F.層析進(jìn)一步純化等。經(jīng)不同層析過程比較，優(yōu)化的純化方法包括1. 對發(fā)酵樣品進(jìn)行離心獲得發(fā)酵后沉淀；2. 通過壓榨獲得壓榨上清后經(jīng)Q S印harose F.F.層析、化2+螯和親和層析、SP — s印harose F.F.層析、EK酶切、再經(jīng)SP—S印harose F.F.層析進(jìn)一步純化，純 品純度98%以上，得率約120mg/L發(fā)酵液。純品的活性按細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行測定，結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀測定0D;7。值，最后 以國際標(biāo)淮品校正活性單位。生物活性檢測目的蛋白比活性達(dá)2. 5X 106U/mg。
純化后重組人甲狀旁腺紊U 84肽)可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。在本發(fā)明的一個實(shí)例中，構(gòu)建了生產(chǎn)重組人人甲狀旁腺素U 84肽)的大腸桿菌表 達(dá)工程細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)，高水平可溶表達(dá)。在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進(jìn)一歩提高了重組人甲狀旁腺素 (1 84肽)的表達(dá)量。在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，由于蛋白可溶表達(dá)，菌體經(jīng)壓搾、離心獲得壓榨上清， 再經(jīng)一系列純化步驟后可得到純品120mg/L。純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成重組人甲狀旁腺素G 84肽)的注射用粉針劑。，初 步穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該粉針劑穩(wěn)定。中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲 得重組人甲狀旁腺素U 84肽)純品120mg，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1) 選用的是大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞，通過施加抗生素篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，進(jìn)而篩選出高表達(dá)工程細(xì)胞。(2) 優(yōu)化后的重組人甲狀旁腺素(1 84肽)蛋白基因非常適合在大腸桿菌BL21(DE3) 宿主細(xì)胞中表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的特點(diǎn)，而且以可溶形式表達(dá)。(3) 通過控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平達(dá)到500mg/L。(4) 由于蛋白是以可溶形式表達(dá)，確定了較佳的工藝路線，使可溶的目的蛋白能夠折疊成結(jié)構(gòu)l卩確的天然形式，經(jīng)純化能得到高純度的[L-4蛋白，每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液可獲 得120毫克以匕、純度大于98%重組人甲狀旁腺素U 84肽)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和高表達(dá)工程菌株的獲得
根據(jù)人甲狀旁腺素(1 84肽)天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變氨基酸 序列的條件下，PCR方法合成重組人甲狀旁腺素(1 84肽)蛋白的目的基因序列(SEQ'ID NO- 1)，該優(yōu)化的IL-4基因序列與天然的IL-4基因序列同源性為82% (見圖1)。將該基 因克隆到pThiHisA中并測序驗(yàn)證。
表達(dá)載體構(gòu)建方法見圖2。通過PCR擴(kuò)增得到目的人甲狀旁腺素(1 84肽)基因， 用fevT^I和fco/ I雙酶切分別處理基因PTH(1 84肽)的PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pThiHisA， 酶切后回收相應(yīng)的片段用T4 DNA連接酶在16'C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ， 在含有50ug/mL氨芐青霉素的LB平板上挑選抗性陽性的克隆，抽提質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行質(zhì) 粒酶切鑒定。得到在pThiHisA中插入了 IL-4基因的重組質(zhì)粒pThiHisA/84aaPTH。
將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pThiHisA/PTH轉(zhuǎn)化進(jìn)入已制備好的大腸桿菌BL21 (DE3)感受 態(tài)細(xì)胞，涂布含50ug/mL氨芐青霉素的LB平板，然后在轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆，用堿裂 解法抽提并檢測質(zhì)粒。將確證含有表達(dá)質(zhì)粒pThiHisA/PTH的單克隆在含50" g/mL氨芐青 霉素的LB平板上保存。
實(shí)施例2重組人甲狀旁腺素U 84肽)的表達(dá)及表達(dá)形式的確定
挑選一株確證好的表達(dá)工程菌BL21 (DE3) /pThiHisA/PTH,用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)及
用[PTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測是否有目的條帶的出現(xiàn)，并分析貝:表達(dá)量。取 一部 分發(fā)酵后的菌液離心，重懸于pH 7.4， 20mM PB， +2.5mM EDTA緩沖液，在冰浴下超聲破 菌，離心收集超聲上清和超聲沉淀，SDS-PAGE電泳檢測，確定其表達(dá)形式。分折其超聲 上淸和超聲沉淀，目的蛋白絕大部分在沉淀中，表明目的蛋白是以可溶形式表達(dá)(見圖3)。
實(shí)施例3重組人甲狀旁腺素U 84肽)的規(guī)模化發(fā)酵
取鑒定為陽性克隆的表達(dá)工程菌BL21 (DE3) /pThiHisA/PTH，在含有50 w g/mL氨芐 青霉素LB培養(yǎng)14 16小時(shí)；再按3W接種量接種于LB中長至Ca。。為1 3，作為二級種 子液。配制改良M9發(fā)酵培養(yǎng)基2. 96L (Glucose 1%, Yeast extract 0. 5%， K2HP04 0. 5%， K,O. 35%， (NH4)2HP04 0.35%, MgS04 0. 025%, CaCL2 0. 1%)，倒入清潔過的發(fā)酵罐內(nèi)， 連罐高壓滅菌后，冷卻至30 4(TC，將培養(yǎng)好的二級種子液按1.5%接種量接入發(fā)酵罐，37 'C培養(yǎng)，并根據(jù)溶氧值不斷調(diào)整通氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶氧40%以上。每小時(shí)取樣鄰!l 0Dw。值。培養(yǎng)至ODe。。達(dá)到5. 0左右開始誘導(dǎo)，在發(fā)酵罐中加入IPTG至終濃度lraM進(jìn)行誘 導(dǎo)，誘導(dǎo)3.5小時(shí)收罐，發(fā)酵液于4200rpm,20分鐘離心，收集沉淀稱重。表達(dá)產(chǎn)物占菌 體總蛋白的35%。見圖4。
實(shí)施例4重組人甲狀旁腺素U 84肽)純化
將發(fā)酵后的菌體按1: 10的比例重懸于pH 7. 4, 20mM PB， +2. 5mM EDTA破菌緩沖液， 在冰浴下壓搾破菌，離心取上清，將破菌后上清過Q—Seharose fast flow離子交換層析 柱，用0-lMNaCl緩沖液梯度洗脫，分管收集洗脫蛋白峰；將含有目的蛋白的洗脫液混合 后過Ni2+螯合親和層析，用含0. l-0.3M咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，收集的洗脫峰再過 SP-S印harose fast flow離子交換層析柱。收集的融合蛋白溶液EK酶切、再經(jīng)SP— S印harose F. F.層析進(jìn)一步純化。經(jīng)15%SDS-PAGE電泳檢測純化過程目的蛋白的純度及 含量(見圖5)。
經(jīng)過以上純化工藝，最后可得蛋白純品120mg/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同毎一篇文獻(xiàn)被單 獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利耍求 書所限定的范圍。
序列表
< 110>上海新生源生物醫(yī)藥研究冇限公S] 〈120〉亞組人甲狀旁腺素U 84肽)的生產(chǎn)方法 <聽 2 <210> 1 <211> 282 <212> 隱 <213> 人工序列 <221> misc_feature <222> (1)..(282)
〈223〉優(yōu)化的重組人甲狀旁腺素a 84肽)基因
<400〉 1
GGA TCC GAT GAC GAT GAC MG TCT MC TCC ATG GM AGG GTT GAA TGG GGT GCT CCG. CTG GCT CCG AGG GAC GTT GAA AGC CAC GAG MG AGC CTG AM TCC CAG TM GM TTC
<210> 2
<2I1> 84
<212〉 PRT <213〉智人
<400> 2
SVSEIQLMH NLGKHLNSME RVEWLRKKLQ DVHNFVALGA PLAPRDAGSQ RPRKKEDNVL VESHEKSLGE ADKADVNVLT KAKSQ
GTT AGT GAA ATC CAG CTG ATG CTG CGT MG AAA CTG CAG GAC GCT GGT TCC CAG AGG CCG CGT GGT GM GCT GAC AAA GCT GAC
CAC MT CTG GGT AAA CAC CTG GTT CAC MC TTC GTT GCT CTG AAG MG GAA GAC AAC GTT TTG GTT MC GTT TTG ACC MA GCT
權(quán)利要求
1.一種編碼重組人甲狀旁腺素(1～84肽)的氨基酸序列，其特征在于，其編碼序列如SEQID NO2所示的氨基酸序列，較佳地，編碼該氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO1所示。
2. —種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求l所述的編碼該重組人甲狀旁腺素(1 84 肽)氨基酸序列的DNA序列。較佳地，所述的表達(dá)載體是pThiHisA/PTH。
3. —種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求1所述的編碼 該重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的DNA序列。
4. 一種生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素(1 84肽)的方法，其特征在于，它包括步驟a) 在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出重組人 甲狀旁腺素(1~84肽)蛋白；b) 分離純化出表達(dá)的人甲狀旁腺素(1 84肽)蛋白。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中進(jìn)行高密度懸浮培養(yǎng)。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括步驟i) 對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾方式去除上清，獲得發(fā)酵后菌體；ii) 對發(fā)酵沉淀進(jìn)行壓榨破菌、收集壓榨上清；iii) 層析純化，所述的層析選自陰離子交換層析、金屬螯和親和層析、 陽離子交換層析及其組合。iv) 采用腸激酶EK酶切后，經(jīng)進(jìn)一步純化獲得目的蛋白。對發(fā)酵樣品通過離心 和/或過濾方式去除上清，獲得發(fā)酵后菌體。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為30-40'C,更佳 地34-38'C;磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM, pH5-8; Mg"鹽0-5mM;碳源為葡萄糖，是單 一碳源，較佳地，葡萄糖濃度為1.0%，補(bǔ)料中葡萄糖濃度為11.25%;添加維生素B1作為 補(bǔ)充維生素，濃度1 1000PPM;微量元素可加O. 1-2ml/L培液；誘導(dǎo)劑為IPTG濃度在 0.卜lmg/L之l'Hj,誘導(dǎo)甜OD6()0在0. 5 20之間，更佳地在1 10之問；誘^吋問().5 10小 時(shí)，更佳地為1 5小時(shí)。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的純化條件是先離心獲得發(fā)酵液后沉淀 即菌體。然后壓榨破菌經(jīng)離心獲得壓搾上清，后經(jīng)Q—S印haroseF.F.層析、Ni"螯和親和 層析、SP—s印haroseF.F.層折、EK酶切、再經(jīng)SP—S印harose F. F.層析進(jìn)一歩純化，獲 得純度98%以上的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人甲狀旁腺素(1～84肽)的核甘酸序列，高效生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素(1～84肽)的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的重組人甲狀旁腺素蛋白基因，非常適合在原核細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)通過發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡便、低成本地獲得重組人甲狀旁腺素純品。
文檔編號C12N15/09GK101153279SQ200610116768
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者軍 任, 孫九如, 翊 張, 張繼崗, 梁光軍, 燕 邱, 黃陽濱 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司