專利名稱：一種菜用大豆dna指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種植物DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和用于植物品種鑒定的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菜用大豆是近年發(fā)展起來的深受國際市場歡迎的重要特色蔬菜之一，尤其是我國南方居民喜食的傳統(tǒng)特色蔬菜，年栽培面積達500萬畝以上，并有不斷擴大的趨勢。
菜用大豆新品種的選育一直是日本和我國臺灣省大豆育種家的主攻目標。我國臺灣省育種家自上個世紀50年代就開始菜用大豆的育種研究，先后推出了臺290、臺292、臺75-1、9308、KVS844和KVS862等多個優(yōu)良品種，其中臺292和臺75-1以其大莢、大粒、灰白毛和優(yōu)良的口感品質(zhì)等特征成為我國南方地區(qū)出口生產(chǎn)上的主打品種。
中國菜用大豆的育種始于20世紀80年代后期，相繼育成的品種有蕭墾8901、泉豆8473、安豆三號、淮哈豆1號、華春18號和地神21號等，但這些品種均系粒用品種的系選或有性雜交而成，鮮豆粒吃口硬，風味差，不適合速凍加工，且成熟期偏晚。近幾年，上海市農(nóng)業(yè)科學院相繼育成推出了青酥系列早熟、優(yōu)質(zhì)菜用大豆新品種，填補了我國南方春播型菜用大豆品種的市場空白，栽培面積迅速擴大。
由于菜用大豆屬嚴格自花授粉作物，留種較為容易，育成新品種一投放于市場，就很快被不法種子商們冠以新的名稱，紛紛自行擴繁推廣，致使種子市場菜用大豆的品種極為混亂，既損壞了品種育成單位和種子經(jīng)營單位的利益，也不利于國家有關(guān)菜用大豆品種推廣中種子質(zhì)量的控制，以及菜用大豆雜交育種中親本的選擇與可持續(xù)利用。
生物指紋圖譜是能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜。這種電泳圖譜多態(tài)性豐富，且具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，就像人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。指紋圖譜技術(shù)極其適合于品種的鑒定和登記。
作物品種指紋圖譜目前主要有兩種類型一類是較早研究開發(fā)的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜，另一類是90年代之后發(fā)展起來的DNA分子標記指紋圖譜，即“DNA指紋圖譜”，該詞可以泛指一切具有某一種質(zhì)特異性的譜帶，借助DNA指紋圖譜，可以區(qū)分不同的品種，是鑒定品種、品系的有力工具。
目前廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜繪制的分子標記主要包括以下5種RFLP技術(shù)即限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性(RFLP)，是近年發(fā)展起來的以生物基因組DNA序列變異為基礎(chǔ)，研究不同基因組差異的一項新技術(shù)。RFLP技術(shù)不受顯隱型關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響；在數(shù)量上不受限制，檢測方便；具有穩(wěn)定遺傳和特異性；而且用于檢測RFLP的克隆探針可隨意選擇，可以是核糖體DNA、葉綠體DNA或總DNA，這樣就可以產(chǎn)生大量的多態(tài)性，為研究植物的類群，特別是屬間、種間甚至品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育與演化提供有力的依據(jù)。但因RFLP技術(shù)復(fù)雜，研究所需DNA量大，所研究對象需要有一定的遺傳背景，目前已逐漸被其它分子標記技術(shù)所代替。
RAPD技術(shù)即隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)，是J.Williams和J.Welsh兩個研究小組在1990年發(fā)展起來的一種新型遺傳標記，它是以人工合成的隨機引物對基因組DNA進行擴增而產(chǎn)生能顯示多態(tài)性的DNA指紋圖譜，RAPD技術(shù)是一種基于序列的多態(tài)性，其可以在沒有任何分子生物學研究基礎(chǔ)的情況下對某一物種進行指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的研究，相對于RFLP技術(shù)來說比較經(jīng)濟簡便，DNA用量也少(ng級)；而且避免了使用放射性同位素，近年來在品種資源研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。但目前RAPD技術(shù)尚存在以下兩個問題(1)重復(fù)性和穩(wěn)定性差，有許多因素會影響RAPD的擴增結(jié)果，在進行RAPD分析之前，要反復(fù)進行RAPD分析條件的優(yōu)化實驗。(2)過于靈敏，使遺傳分析變得復(fù)雜化，因為有的RAPD標記不依照預(yù)期的遺傳樣式。
小衛(wèi)星DNA(VNTR)技術(shù)1980～1984年，人類遺傳學家相繼在人體基因組中發(fā)現(xiàn)了一些串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列由長度為11～60bp的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，后來稱之為小衛(wèi)星DNA。由于重復(fù)單位的數(shù)目不同和重復(fù)拷貝數(shù)的等位性不同，使其表現(xiàn)出高度多態(tài)性。不同生物、同一生物的不同品種，甚至同一品種的不同個體，其所含小衛(wèi)星各異，雜交產(chǎn)生的圖譜各不相同，譜帶遵循孟德爾遺傳方式遺傳，并具有體細胞穩(wěn)定性。這些特點使之成為較先進的遺傳標記系統(tǒng)，而廣泛應(yīng)用在許多作物的品種鑒定和遺傳多樣性研究中。
SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)SSR是一類由幾個核苷酸(一般為15個)為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。植物體內(nèi)的二核苷酸(AT)n遠比哺乳動物豐富，植物基因組中平均每隔2Kb就有一個三核苷酸或四核苷酸重復(fù)，且每種類型的SSR在每種物種中出現(xiàn)的頻率不同。SSR多態(tài)性的信息量非常豐富，具有所有RFLP的遺傳學優(yōu)點，又比RAPD重復(fù)性能和可信度高，因而是目前遺傳標記中的熱點。但由于SSR必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列以設(shè)計引物，因而給SSR標記的利用帶來了一定困難，然而一旦開發(fā)出某種生物的SSR標記，就顯現(xiàn)出該標記的利用價值。SSR目前已廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物的鑒定和標記中。
AFLP技術(shù)AFLP技術(shù)是1993年由荷蘭生物技術(shù)公司KEYGENE的Zabeau和Vos等人發(fā)明的，已申請了專利。AFLP技術(shù)是RFLP和PCR相結(jié)合的一種方法。與RAPD一樣，AFLP可以用于沒有任何分子生物學研究基礎(chǔ)的物種，其引物在不同物種間是通用的，被稱為一種“半隨機”的擴增。一個0.5mg的DNA樣品，可作4000個AFLP反應(yīng)，獲得8萬個標記，600萬條帶紋?？梢夾FLP的多態(tài)性非常高。利用放射性標記或銀染方法在變性的聚丙烯酰胺凝膠上通?？梢詸z測到50～100個擴增產(chǎn)物，而且重復(fù)性強，因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究等。多數(shù)作物上的研究結(jié)果都表明其產(chǎn)生的多態(tài)性遠遠超過了RFLP、RAPD等，目前被認為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項技術(shù)。實際上，AFLP最適的應(yīng)用范圍，也是Zabeau和Vos申請的專利的關(guān)鍵，就是利用AFLP技術(shù)鑒定品種的指紋，檢測品種的質(zhì)量和純度。由于AFLP已申請專利，因而它在生產(chǎn)及商業(yè)上的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種菜用大豆DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
本發(fā)明首先提供了一種菜用大豆DNA指紋圖譜，首先本發(fā)明選用如表1所示的28個菜用大豆品種/系為供試材料，選材以生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的早、中熟優(yōu)質(zhì)菜用大豆品種為主，包括一些高代自交系和育種材料，具有較好的代表性。
表1 28個菜用大豆品種/系的來源和特性


根據(jù)上述28個品種所建立的指紋圖譜用數(shù)字表示為0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111。
其中，“1”代表圖譜中某個位置上有擴增條帶存在，而“0”代表圖譜中某個位置上沒有擴增條帶存在。
而數(shù)字表示的指紋圖譜用附圖的形式表示，即為附圖1，其中附圖中的“-”相對應(yīng)的是數(shù)字中的“1”，而數(shù)字中的“0”在附圖中則為空白。
本發(fā)明還提供了上述菜用大豆指紋圖譜的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟菜用大豆DNA的提取；PCR擴增引物的篩選，PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測，條帶分子量大小的測定及菜用大豆DNA指紋圖譜的構(gòu)建。
具體步驟為①、DNA的提取剪取每個菜用大豆品種的幼嫩葉片(2～5g)，提取其總DNA；
②、PCR擴增應(yīng)用表2中的13對引物，使用PCR熱循環(huán)儀分別對所研究的菜用大豆品種的基因組DNA進行擴增。在PCR熱循環(huán)儀上循環(huán)30個周期，對模板進行擴增；③、PCR產(chǎn)物的鑒定擴增產(chǎn)物進行8％丙烯酰胺垂直凝膠電泳，銀染后用Bio-Rad凝膠掃描系統(tǒng)掃描照相；④、數(shù)據(jù)分析按照照片上各材料在各引物上的擴增情況作記錄，有帶的記為1，無帶的記為0；按照井正列(Nei)的方法計算菜用大豆品種間的相似系數(shù)(Gs)，再按照平均距離法(UPGMA法)進行聚類分析；⑤、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照照片上各材料在各引物上的擴增情況，挑取具有代表性(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好)的SSR多態(tài)性帶，繪制菜用大豆品種/系的DNA指紋圖譜。
表2 13對引物的序列

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢和效果品種鑒定和種子純度分析在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上極其重要，而檢測方法的準確性和可靠性對鑒定結(jié)果至關(guān)重要。上世紀80年代以前，田間形態(tài)觀察的方法在作物品種鑒定和種子純度分析上起過極其重要的作用，但隨著品種的豐富和育種親本利用的集中化，品種鑒定愈來愈困難，傳統(tǒng)的形態(tài)學方法已愈來愈不適應(yīng)品種鑒定和純度分析。DNA分子標記方法的出現(xiàn)，使我們能夠用分子生物學方法進行品種鑒定和純度分析。目前，利用DNA分子標記技術(shù)進行品種鑒定和種子純度分析已在重要農(nóng)作物生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但該方法在菜用大豆種質(zhì)資源研究及菜用大豆種子生產(chǎn)上還未見到報道，至今，菜用大豆品種的鑒定與區(qū)分仍然采用最原始的田間形態(tài)觀察方法，這對菜用大豆新品種的選育及良種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展極為不利。考慮到RFLP分析的復(fù)雜性、AFLP已被發(fā)明人申請專利、以及小衛(wèi)星DNA(VNTR)與SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)需要了解實驗材料的遺傳背景等，本發(fā)明以SSR分析技術(shù)為基礎(chǔ)，針對菜用大豆的基因組特點，研究建立了一種菜用大豆品種/系DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(1)本發(fā)明填補了菜用大豆品種資源研究尤其DNA指紋圖譜研究的空白；(2)應(yīng)用本發(fā)明的指紋圖譜進行菜用大豆品種堅定比目前用在菜用大豆品種鑒定中所采用的田間形態(tài)觀察法更準確、簡便，本專業(yè)領(lǐng)域的專業(yè)人員均能使用；(3)本發(fā)明的菜用大豆品種/系DNA指紋圖譜簡明、直觀，適于計算機管理。


圖1 28個菜用大豆品種/系的DNA指紋圖譜其中橫坐標為28個菜用大豆品種/系的編號；縱坐標為構(gòu)建該DNA指紋圖譜所用的13對引物的編號?！?”表示擴出了特異帶，“ ”表示沒有擴增出特異帶。
具體實施例方式
實施例1構(gòu)建菜用大豆指紋圖譜1、DNA的提取采取各品種/系的新鮮葉片磨樣，利用CTAB法提取其DNA，所得的DNA原液利用EB法測其濃度，然后稀釋成10ng/ul左右DNA稀釋液。
2、PCR擴增PCR反應(yīng)在型號為PTC-225的PCR擴增儀上進行。反應(yīng)體系為10ul，其中包含模板基因組DNA溶液4.5ul(10ng/ul)10xbuffer(100mmol/l tris-Hclph8.0 1.36ul500mmol/lkcl0.1％gelatin)dNTP(10mM) 0.24ulTaq酶(5u/ul) 0.1ulMg2+(25Mm) 0.8ul引物(1ppm) 3.0ul附PCR反應(yīng)程序(1)94度預(yù)變性3min(2)95度變性1min(3)55度退火110s(4)72度延伸60s
(5)72度保溫8min(6)4度保溫其中從第二步到第五步要重復(fù)循環(huán)30次3、PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物中加入2ul Loading buffer(二甲苯氰緩沖液)，在8％聚丙烯酰胺膠(PAGE)上20W恒功率電泳1小時左右，然后銀染檢測。
具體步驟如下(1)玻璃板的組裝取干凈的玻璃板成對組裝并固定到北京六一廠產(chǎn)的型號為DYZ-30的電泳槽上，用0.1％的瓊脂糖封住下部狹縫。
(2)灌膠向裝有8％的聚丙烯酰胺溶液的三角瓶中加入適量的10％過硫酸銨和四甲基乙二胺原液，混勻，靜止2分鐘左右。沿灌膠口將膠輕輕灌入，若膠中有氣泡及時用細針將其挑出。插入梳子，等待膠液凝聚。
(3)點樣和電泳向電泳槽加入1XTBE電泳緩沖液，拔出梳子。在PCR擴增產(chǎn)物中加入2ul loading buffer。點樣量視點樣孔的多少而定。
電泳采用恒定功率，10w/膠板。大約電泳50～70min即可。
(4)卸膠和銀染電泳完畢后，倒出電泳緩沖液，卸膠。將膠放入固定液，在搖床上搖動固定至少15分鐘；固定完畢后，將固定液倒出，加入滲透液，滲透10min(滲透時間要嚴格保證)；然后用純水漂洗2～3次(30秒/次)，加入顯色液進行顯色，以能清楚地看到條帶為準，停止顯色，用清水清洗干凈。
4、條帶分子量大小的測定將已經(jīng)顯色清楚的凝膠利用Bio-Rad的Quantity One軟件進行凝膠成像掃描保存圖像，并分析分子量大小(分子量大小以50bp ladder Marker為標準)。
5、數(shù)據(jù)資料的分析統(tǒng)計13個能產(chǎn)生多態(tài)性的引物(引物序列見表2)在28個菜用大豆品種(系)的DNA樣品中擴增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)性帶的數(shù)目。在電泳圖譜同一個SSR位點上有電泳帶記錄為1，無電泳帶記錄為0。作0，1矩陣圖輸入計算機。根據(jù)井正利(Nei)的方法計算菜用大豆品種間的相似系數(shù)(GS)，從而得遺傳差異GD＝1-GS。利用GD按平均距離法(UPGMA法)計算遺傳分類。
6、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照上述照片上各材料各引物(13個SSR引物)擴增情況，挑取具有代表性的(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的)SSR多態(tài)性帶，繪制28個菜用大豆品種(系)的DNA指紋圖譜。在該DNA指紋圖譜中，每個菜用大豆品種(系)均有其特異的DNA指紋，可以把這28個品種(系)彼此區(qū)分開(見圖1)。28個品種(系)的名稱、來源等見表1。
實施例2將本發(fā)明的菜用大豆DNA指紋圖譜用于某個菜用大豆品種的真實性檢測菜用大豆標準DNA指紋圖譜建立以后，要對某個品種(系)進行鑒定時，用目前廣泛應(yīng)用的CTAB法提取DNA，用提取的DNA作為模板，用篩選出的13個引物對其進行PCR擴增，并根據(jù)各引物(引物序列見表2)在該菜用大豆品種(系)的DNA樣品的電泳圖譜同一個SSR位點上擴增出特異性條帶的有、無，繪制出該批待測種子的DNA指紋圖譜，與標準DNA指紋圖譜進行對比，就可以知道它是用來構(gòu)建DNA指紋圖譜的28個菜用大豆品種(系)中的哪一個。
實施例3將本發(fā)明的菜用大豆DNA指紋圖譜用于某個菜用大豆品種的真實性檢測如供試材料中的“青酥二號”菜用大豆品種是目前生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用的優(yōu)良品種，現(xiàn)有一批種子不能確定是否是真正的“青酥二號”種子，因此，按照本發(fā)明的方法建立這批種子的DNA指紋圖譜，然后對照標準圖譜進行對比鑒定。
鑒定結(jié)果若它的DNA指紋與標準DNA指紋圖譜中“青酥二號”的指紋是一致的，這批種子就是真正的“青酥二號”。如果待測樣品的DNA指紋與標準DNA指紋圖譜中“青酥二號”的指紋不是一致的，那么這批種子就不是真正的“青酥二號”。
權(quán)利要求
1.一種菜用大豆DNA指紋圖譜，其特征在于該指紋圖譜用數(shù)字表示為0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111；其中，“1”代表圖譜中某個位置上有擴增條帶存在，而“0”代表圖譜中某個位置上沒有擴增條帶存在。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的指紋圖譜的方法，其特征在于該方法的具體步驟為①、DNA的提取剪取每個菜用大豆品種的幼嫩葉片，提取其總DNA；②、PCR擴增應(yīng)用13對引物，對上述DNA進行擴增；③、PCR產(chǎn)物的鑒定擴增產(chǎn)物進行8％丙烯酰胺垂直凝膠電泳，銀染后用Bio-Rad凝膠掃描系統(tǒng)掃描照相；④、數(shù)據(jù)分析按照照片上各材料在各引物上的擴增情況作記錄，有帶的記為1，無帶的記為0；按照井正列的方法計算菜用大豆品種間的相似系數(shù)，再按照平均距離法進行聚類分析；⑤、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照照片上各材料在各引物上的擴增情況，挑取具有穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的SSR多態(tài)性帶，繪制菜用大豆品種的DNA指紋圖譜。
3.一種權(quán)利要求1所述的指紋圖譜，可應(yīng)用于菜用大豆品種/系的鑒定或純度分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菜用大豆品種的DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該指紋圖譜是以28個菜用大豆品種/系為供試材料，通過DNA的提取、PCR擴增、PCR產(chǎn)物的鑒定、數(shù)據(jù)分析，最終構(gòu)建DNA指紋圖譜。該指紋圖譜可用于菜用大豆品種/系和純度的鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK1944649SQ200610117638
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者顧衛(wèi)紅, 麻浩, 王麗群, 馬坤, 宋榮浩, 高文瑞, 楊紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院