專利名稱：O－乙酰高絲氨酸巰基酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及O-乙酰高絲氨酸巰基酶(O-acetyl homoserine sulfhydrylase)基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及通過提高編碼釀造酵母O-乙酰高絲氨酸巰基酶Met17p的基因MET17，特別是啤酒酵母中特征性的non-ScMET17基因的表達(dá)量，提高產(chǎn)品香味的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
背景技術(shù)：
市售的pilsner type的淡色啤酒制造中使用的啤酒酵母在主發(fā)酵過程中具有生成硫化氫的特性。此硫化氫是造成啤酒品質(zhì)上不受歡迎的嫩啤酒味的原因之一，將其降低到閾值之下的對策是進(jìn)行后發(fā)酵或延長貯酒期。
為減少啤酒中的硫化氫，以往即有關(guān)于影響硫化氫生成的因子的研究(Jangaard，N.O.，Gress，H.S.and Coe，R.W.；Amer.Soc.Brew.Chem.Proc.，p46，1973；Kuroiwa，Y.and Hashimoto，N.；Brew.Dig.，45，44，1970；Hysert，D.W.and Morrison，N.M.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，34，25，1976)、使用突變法或細(xì)胞融合法進(jìn)行硫化氫生成少的酵母的育種研究(Molzahm，S.W.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，35，54，1977)的報(bào)道。
這些方法均不只減少了酵母的硫化氫生成量，還影響了酵母的其他釀造特性(發(fā)酵速度、啤酒香味)，所以，至今還未得到適合作為啤酒釀造用酵母的酵母。近年來，也利用基因操作技術(shù)進(jìn)行釀造用酵母的育種，日本特開平5-244955號公報(bào)中公開了導(dǎo)入編碼胱硫醚β-合成酶的DNA片段的啤酒酵母，可減少硫化氫的生成。但其減少程度甚微，形質(zhì)轉(zhuǎn)化株的硫化氫生成量仍為親株生成量的60～80％左右。
酵母的物質(zhì)代謝中，硫化氫是在從培養(yǎng)基中吸收的硫酸根離子(SO42-)的還原過程中生成的。此代謝系統(tǒng)是蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸的生物合成途徑，且有關(guān)于各階段的酶及其基因(MET17基因)的詳細(xì)報(bào)道(Tabor，H.and Tabor，C.W.(eds.)；Methods in Enzymology Vol.17B，Academic Press，London，1971；Jakoby，W.B.and Griffith，O.W.(eds.)；Methods in EnzymologyVol.143，AcademicPress，London，1987)。
O-乙酰高絲氨酸巰基酶是將硫原子從硫化氫轉(zhuǎn)移到O-乙酰高絲氨酸(O-acetyl homoserine)的酶，由MET17基因編碼。該酶還具有向O-乙酰絲氨酸轉(zhuǎn)移硫原子的活性。有報(bào)道指出采用來源于SaccharomycescerevisiaeX2180-1A的MET17基因組成性表達(dá)的啤酒酵母株，硫化氫的生成量減少到了親株的2％左右(日本特開平7-303475號公報(bào))。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，為使產(chǎn)品中硫化氫生成量減少，獲取了突變株，但其結(jié)果顯示了未曾預(yù)期的發(fā)酵延遲和不受歡迎的香味成分的增加，所以，作為實(shí)用性酵母還存在著問題。由此，非常期望有既不影響發(fā)酵速度、不損害產(chǎn)品品質(zhì)，又能減少硫化氫生成量的酵母的育種方法。
本發(fā)明者等為解決上述課題不斷銳意研究的結(jié)果，從啤酒酵母中成功地鑒定·分離出了編碼O-乙酰高絲氨酸巰基酶的新型基因。且制備了將所得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_(dá)的形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母，確認(rèn)了硫化氫生成量的減少，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母以控制產(chǎn)品中硫化氫生成量的方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入了該載體的形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母、使用該形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母的酒類的制造方法等。
(1)從以下(a)～(f)一組中選擇的多核苷酸(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有把由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；(c)在序列號2的氨基酸序列中，含有把1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；
(d)含有對具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1中的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸，在嚴(yán)格條件下雜交，且把具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有把序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸，在嚴(yán)格條件下雜交，且把具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)一組中選擇(g)在序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中，把1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有把具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸，在嚴(yán)格條件下雜交，且把具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有把由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)加以編碼的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)蛋白質(zhì)，其由上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
(7)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(y)組成要素的表達(dá)框架(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其與該啟動子以正向或反向結(jié)合；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。
(8)酵母，其中導(dǎo)入了上述(7)中所述的載體。
(9)上述(8)中所述的酵母，其通過導(dǎo)入上述(7)中所述的載體降低硫化氫生成能。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通過增加上述(6)中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，降低硫化氫生成能。
(11)酒類的制造方法，其使用上述(8)～(10)中任一項(xiàng)所述的酵母。
(12)上述(11)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
(13)上述(11)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
(14)酒類，其使用上述(11)～(13)中任一項(xiàng)所述的方法制造。
(15)評價(jià)方法，其是使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能的方法。
(15a)根據(jù)上述(15)中所述的方法，選別硫化氫生成能降低了的酵母的方法。
(15b)使用通過(15a)中所述方法選別的酵母制造酒類(例如啤酒)的方法。
(16)評價(jià)方法，其是通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，以評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能的方法。
(16a)使用上述(16)中所述的方法評價(jià)被檢酵母，選別O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因表達(dá)量高的酵母，選別硫化氫生成能降低了的酵母的方法。
(16b)使用根據(jù)上述(16a)中所述方法選別的酵母，制造酒類(例如啤酒)的方法。
(17)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母，對上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量或測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能對應(yīng)的前述蛋白質(zhì)量或前述基因表達(dá)量的被檢酵母。
(17a)培養(yǎng)被檢酵母，測定硫化氫生成能或O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性，選擇目的硫化氫生成能或O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的被檢酵母的酵母選擇方法。
(18)上述(17)中所述的酵母選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母。
(19)上述(17)中所述的酵母選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇該蛋白質(zhì)量比標(biāo)準(zhǔn)酵母多的被檢酵母。即，培養(yǎng)多種酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇其中該蛋白質(zhì)量多的被檢酵母。
(20)酒類的制造方法，其特征在于，使用上述(8)～(10)中所述的酵母及通過上述(17)～(19)中所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行用于酒類制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)硫化氫生成量。
根據(jù)本發(fā)明的使用形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母的酒類制造方法，通過O-乙酰高絲氨酸巰基酶可迅速消耗硫化氫，可將啤酒釀造及產(chǎn)品中的硫化氫濃度抑制到很低水平，從而制造出香味優(yōu)異的酒類。


圖1是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660的值。
圖2是啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母的nonScMET17基因表達(dá)變動的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示檢測出的信號輝度。
圖4是啤酒試驗(yàn)釀造中親株、nonScMET17高表達(dá)株酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660的值。
圖5是啤酒試驗(yàn)釀造中親株、nonScMET17高表達(dá)株浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明者等認(rèn)為，通過使酵母的O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性增大，可更高效地減少硫化氫?；诖嗽O(shè)想反復(fù)進(jìn)行了研究，以用日本特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎(chǔ)，分離·鑒定了編碼啤酒酵母特有的O-乙酰高絲氨酸巰基酶的non-ScMET17基因。此堿基序列如序列號1所示。另外，被此基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號2所示。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有把序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不只限于編碼來自上述啤酒酵母的O-乙酰高絲氨酸巰基酶的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質(zhì)具同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質(zhì)，例如，可例舉為(c)由序列號2的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，在序列號2的氨基酸序列中，例如，可由1～100個(gè)、1～90個(gè)、1～80個(gè)、1～70個(gè)、1～60個(gè)、1～50個(gè)、1～40個(gè)、1～39個(gè)、1～38個(gè)、1～37個(gè)、1～36個(gè)、1～35個(gè)、1～34個(gè)、1～33個(gè)、1～32個(gè)、1～31個(gè)、1～30個(gè)、1～29個(gè)、1～28個(gè)、1～27個(gè)、1～26個(gè)、1～25個(gè)、1～24個(gè)、1～23個(gè)、1～22個(gè)、1～21個(gè)、1～20個(gè)、1～19個(gè)、1～18個(gè)、1～17個(gè)、1～16個(gè)、1～15個(gè)、1～14個(gè)、1～13個(gè)、1～12個(gè)、1～11個(gè)、1～10個(gè)、1～9個(gè)、1～8個(gè)、1～7個(gè)、1～6個(gè)(1～數(shù)個(gè))、1～5個(gè)、1～4個(gè)、1～3個(gè)、1～2個(gè)、1個(gè)的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。另外，上述氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或付加的數(shù)量，一般優(yōu)選較小的數(shù)量。此種蛋白質(zhì)可例舉為，具有(d)與序列號2的氨基酸序列有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的氨基酸序列，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。上述同源性的數(shù)值一般越大越好。
還有，O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性，例如可根據(jù)Yeast9(12)1335-42，1993中所述的方法測定。
另外，本發(fā)明也包含(e)含有與序列號1堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸、或編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸DNA。雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的“嚴(yán)格條件”，意指低嚴(yán)格條件中、高嚴(yán)格條件中的任一種?！暗蛧?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件。“中嚴(yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件?！案邍?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸DNA。影響雜交嚴(yán)格性的因素為溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適宜選擇這些因素，均可實(shí)現(xiàn)同樣的嚴(yán)格條件。
另外，雜交中使用市場銷售的試劑盒時(shí)，例如，可使用Alkphos DirectLabelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時(shí)，根據(jù)試劑盒中附帶的說明方案，與標(biāo)記了的探針進(jìn)行一夜培養(yǎng)后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗滌緩沖液1次洗滌之后，可檢測雜交后的多核苷酸DNA。
此外，可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認(rèn)值(default)計(jì)算時(shí)，可為與編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc Natl AcadSci USA 905873，1993)決定。開發(fā)了基于BLAST算法的被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ Mol Biol 215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時(shí)，參數(shù)例如為score＝100、wordlength＝12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)值(default)參數(shù)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一個(gè)編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，是由序列號2中的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，例如，可例舉為由序列號2的氨基酸序列中上述數(shù)量的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。另外，此種蛋白質(zhì)，可例舉為含有與序列號2的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可使用(《分子克隆》第3版)、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點(diǎn)誘變法獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列中等于或大于1個(gè)的氨基酸殘基被缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、且1個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列的位置上，有1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2種或大于2種也可同時(shí)發(fā)生。以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、Perkin Elmer公司制、Farumashia公司制、Protein TechnologiesInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、島津制作所公司制等的肽合成機(jī)進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的形質(zhì)轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體，是涉及含有上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)的載體。本發(fā)明的載體通常如下構(gòu)成，其含有(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向結(jié)合的、上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號作為構(gòu)成因子的表達(dá)框架。本發(fā)明中，后述的啤酒釀造中，使上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)高表達(dá)時(shí)，為促進(jìn)上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)，將這些多核苷酸針對該啟動子正向?qū)搿?br> 導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型載體中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時(shí)又不受醪液中成分的影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如可通過M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中詳細(xì)記載的已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，形質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)使用的選擇性標(biāo)記可利用耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍(lán)菌素基因(fas2m，PDR4)(分別由豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母，可例舉為可用于釀造的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，雖可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，但在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；還可使用例如協(xié)會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會酵母、清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomyces pastorianus。
酵母的形質(zhì)轉(zhuǎn)化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質(zhì)球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實(shí)施，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養(yǎng)，使OD600nm時(shí)的值為1～6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約30℃條件、靜置約60分鐘后，與導(dǎo)入的DNA(約1～20μg)同時(shí)在約30℃條件、靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000Dalton的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42℃條件、加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入所定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30℃、靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得形質(zhì)轉(zhuǎn)化體。
其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)，可參照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒類制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒類將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造作為制造對象的酒類的酵母中，并可通過使用其酵母，制造所需要的、且減少了硫化氫含量、增加了香味的酒類。另外，通過下述的本發(fā)明的酵母的評價(jià)方法選擇的酵母也可同樣使用。作為制造對象的酒類并不限于此，例如可例舉為啤酒、發(fā)泡酒等的啤酒味飲料，葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒類時(shí)，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往完全相同，不會為制造減少硫化氫含量的酒類而增加成本。即，根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)施、不增加成本的情況下，制造出香味優(yōu)異的酒類。
5.本發(fā)明的酵母的評價(jià)方法本發(fā)明涉及，使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能的方法。使用引物或探針的評價(jià)方法的一般手法為公知，例如，如WO 01/040514號公報(bào)、日本特開平8-205900號公報(bào)等中記載的方法。以下，就此評價(jià)方法進(jìn)行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據(jù)O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計(jì)的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設(shè)計(jì)可使用公知的手法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測，可使用公知的手法進(jìn)行。例如，將含有包含特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為一個(gè)引物使用，另一個(gè)引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸，通過PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測定擴(kuò)增物的有無、擴(kuò)增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為等于或大于10bp，優(yōu)選為15～25bp。另外，夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常為300～2000bp較適當(dāng)。
PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環(huán)數(shù)等于或大于10次等的條件。所得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進(jìn)行分離，測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。根據(jù)此方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來預(yù)測·評價(jià)其酵母的硫化氫生成能。且通過分析擴(kuò)增物的堿基序列，可進(jìn)一步更正確地預(yù)測·評價(jià)上述性能。
本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能。另外，O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)定量來進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法來進(jìn)行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
另外，，通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能相應(yīng)的前述基因表達(dá)量的酵母，可選擇適合釀造所需酒類的酵母。也可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定各酵母中前述基因的表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母的前述基因的表達(dá)量，以選擇所需的酵母。具體地說，例如，可通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母，來選擇適合所需酒類釀造的酵母。
或者，可通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇硫化氫生成能低的、或O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性高或低的酵母，以選擇適合所需酒類釀造的被檢酵母。
此時(shí)，被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、抑制了上述本發(fā)明的多核苷酸(DNA)表達(dá)的酵母、實(shí)施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。硫化氫生成量，例如可通過Brauwissenschaft.31.1(1978)、Applied.Environm.Microbiol.664421-4426(2000)、J.Am.Soc.Brew.Chem.5358-62(1995)中的任一個(gè)所述的方法測定。O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性，例如可通過Yeast 9(12)1335-42，1993中所述的方法測定。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學(xué)方法等的任何方法進(jìn)行(例如，參照大島泰治編著、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、p67-75、學(xué)會出版中心等)。
另外，可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時(shí)可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用例如協(xié)會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會酵母、清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomyces pastorianus。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1新型O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因(nonScMET17)的克隆使用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的新型O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因nonScMET17(序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各自全長基因的引物nonScMET17_for(序列號3)/nonScMET17_rv(序列號4)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScMET17全長基因的DNA片段(約1.3kb)。
將如上所述得到的nonScMET17基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制)。將nonScMET17基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。
實(shí)施例2啤酒試驗(yàn)釀造中nonScMET17基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗(yàn)釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度8.6ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL對發(fā)酵液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時(shí)變化。與此同時(shí)對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GCOS；Gene Chip OperatingSoftware 1.0(AFFYMETRIX公司制)進(jìn)行。nonScMET17基因表達(dá)模式如圖3所示。由此結(jié)果，可確認(rèn)通常的啤酒發(fā)酵中nonScMET17基因進(jìn)行了表達(dá)。
實(shí)施例3nonScMET17基因高表達(dá)株的制作將實(shí)施例1中所述的nonScMET17/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶切，制備包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)域全長的DNA片段。使此片段與用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構(gòu)建了nonScMET17高表達(dá)載體nonScMET17/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達(dá)。酵母中的選擇性標(biāo)記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達(dá)載體，用日本特開平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇形質(zhì)轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例4啤酒試驗(yàn)釀造中硫化氫生成量的解析使用親株及用實(shí)施例3得到的nonScMET17高表達(dá)株通過以下條件進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)。
麥汁浸出物濃度12％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度約8ppm發(fā)酵溫度 15℃一定酵母投入量5g濕酵母菌體/L麥汁對發(fā)酵醪液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(參照圖4)、浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化(參照圖5)。對發(fā)酵中硫化氫的定量，參考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。測定含有預(yù)知濃度的硫化氫的試樣，從檢測出的硫化氫峰面積制成硫化氫的校正曲線，用與標(biāo)準(zhǔn)試樣的分析條件同一的條件測定發(fā)酵醪液，從檢測出的硫化氫的面積與校正曲線的關(guān)系對硫化氫量進(jìn)行定量。
表1.發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵醪液中的硫化氫量

(注)-；檢測極限以下(未檢測出H2S的峰)由表1可見，發(fā)酵終止時(shí)硫化氫的生成量，對于親株的22.1ppb，其nonScMET17高表達(dá)株為檢測極限以下。由此結(jié)果可知，通過nonScMET17高表達(dá)，硫化氫的生成量大幅度減少了。
根據(jù)本發(fā)明的酒類制造法，啤酒釀造及產(chǎn)品中硫化氫的濃度可抑制到很低的水平，所以，可制造出香味優(yōu)異的酒類。
本申請主張日本專利申請第2005-240351號(2005年8月22日申請)及日本國專利申請第2006-47564號(2006年2月23日申請)的優(yōu)先權(quán)，其申請的記載全部納入本申請。且其他的引用文獻(xiàn)的記載也全部納入本申請。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因及其用途(O-acetylhomoserinesulfhydorelace gene and its use)<130>PCT06-0076<150>JP2005-240351<151>2005-08-22<150>JP2006-47564<151>2006-02-23<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1335<212>DNA<213>酵母(yeast)<400>1atgccatctc atttcgatac tgttcaatta cacgctggtc aagaggaccc tagtgacaat60gctcacagaa caagagctgt cccaatctac gccactagtt cttacgtctt tgaaaactct 120aagcatggtt ctcaattgtt tggcctagaa gtgccaggtt acgtttattc tcgtttccaa 180aatcctacca gtaacgtttt ggaggaaaga atcgctgctt tagaaggtgg tgctgctgct 240ttagccgttt cctctggtca ggctgcccaa actcttgcca ttcaaggttt ggctcacact 300ggtgacaaca ttgtctccac ttcttactta tatggtggta cttacaacca attcaaaatc 360tcattcaaaa gattcggtat cgaagccaga tttgtcgaag gtgacaatcc agaagacttc 420
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Ser Ser Tyr Val Phe Glu Asn Ser Lys His Gly Ser Gln Leu Phe Gly35 40 45Leu Glu Val Pro Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Phe Gln Asn Pro Thr Ser50 55 60Asn Val Leu Glu Glu Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Gly Ala Ala Ala65 70 75 80Leu Ala Val Ser Ser Gly Gln Ala Ala Gln Thr Leu Ala Ile Gln Gly85 90 95Leu Ala His Thr Gly Asp Asn Ile Val Ser Thr Ser Tyr Leu Tyr Gly100 105 110Gly Thr Tyr Asn Gln Phe Lys Ile Ser Phe Lys Arg Phe Gly Ile Glu115 120 125Ala Arg Phe Val Glu Gly Asp Asn Pro Glu Asp Phe Glu Lys Val Phe130 135 140Asp Glu Arg Thr Lys Ala Val Tyr Leu Glu Thr Ile Gly Asn Pro Ser145 150 155 160Tyr Asn Val Pro Asp Phe Glu LysIle Val Ala Ile Ala His Lys His165170 175Gly Ile Pro Val Val Val Asp Asn Thr Phe Gly Ala Gly Gly Phe Phe180 185 190
Cys Gln Pro Ile Lys Cys Gly Ala Asp Ile Val Thr His Ser Ala Thr195 200 205Lys Trp Ile Gly Gly His Gly Thr Thr Ile Gly Gly Ile Ile Val Asp210 215 220Ser Gly Lys Phe Pro Trp Lys Asp Tyr Pro Glu Lys Phe Pro Gln Phe225 230 235 240Ser Gln Pro Ala Glu Gly Tyr His Gly Thr Ile Tyr Asn Glu Ala Tyr245 250 255Gly Asn Leu Ala Tyr Ile Val His Val Arg Thr Glu Leu Leu Arg Asp260 265 270Leu Gly Pro Leu Met Asn Pro Phe Ala Ser Phe Leu Leu Leu Gln Gly275 280 285Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Ala Glu Arg His Gly Glu Asn Ala Leu290 295 300Lys Leu Ala Lys Trp Leu Glu Gln Ser Pro Tyr Val Ser Trp Val Ser305 310 315 320Tyr Pro Gly Leu Ala Ser His Ser His His Glu Asn Ala Lys Lys Tyr325 330 335Leu Ser Asn Gly Phe Gly Gly Val Leu Ser Phe Gly Val Lys Asp Leu
340 345 350Pro Asn Ala Asp Lys Glu Thr Asp Pro Phe Lys Leu Ser Gly Ala Gln355 360 365Val Val Asp Gly Leu Lys Leu Ala Ser Asn Leu Ala Asn Val Gly Asp370 375 380Ala Lys Thr Leu Val Ile Ala Pro Tyr Phe Thr Thr His Lys Gln Leu385 390 395 400Asn Asp Lys Glu Lys Leu Ala Ser Gly Val Thr Lys Asp Leu Ile Arg405 410 415Val Ser Val Gly Ile Glu Phe Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Phe Gln420 425 430Gln Ser Leu Glu Thr Val Phe Ala Gly Gln Lys Pro435 440<210>3<211>40<212>DNA<213>引物(primer)<400>3gagctcatag cggccatgcc atctcatttc gatactgttc 40<210>4<211>42
<212>DNA<213>引物(primer)<400>4ggatcctatg cggccgcaaa aaaggatatt catttcaata ac。4權(quán)利要求
1.從以下(a)～(f)一組中選擇的多核苷酸，其為(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有把由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有把由序列號2的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有把具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且具有把O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有把序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且把具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)一組中選擇(g)含有由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且把具有O-乙酰高絲氨酸巰基酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的多核苷酸。
3.按照權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有把由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸。
5.按照權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其是DNA。
6.一種蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
7.一種載體，其含有權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.一種酵母，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求7中所述的載體。
9.按照權(quán)利要求8中所述的酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求7中所述的載體降低硫化氫生成能。
10.按照權(quán)利要求9中所述的酵母，其通過使權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，降低硫化氫生成能。
11.一種酒類的制造方法，其使用權(quán)利要求8～10中任一項(xiàng)所述的酵母。
12.按照權(quán)利要求11中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
13.按照權(quán)利要求11中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
14.一種酒類，其用權(quán)利要求11～13中任一項(xiàng)所述的方法制造。
15.一種評價(jià)方法，其使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能。
16.一種評價(jià)方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，評價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能。
17.一種酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母，對權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)定量或測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能相應(yīng)的前述蛋白質(zhì)量或前述基因表達(dá)量的被檢酵母。
18.按照權(quán)利要求17中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的O-乙酰高絲氨酸巰基酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母。
19.按照權(quán)利要求17中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對各酵母中的權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇該蛋白質(zhì)量比標(biāo)準(zhǔn)酵母多的被檢酵母。
20.一種酒類的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8～10中所述的酵母及通過權(quán)利要求17～19中所述方法選擇的酵母中的任一個(gè)酵母，進(jìn)行用于酒類制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)硫化氫的生成量。
全文摘要
本發(fā)明涉及O－乙酰高絲氨酸巰基酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及通過提高編碼釀造酵母O－乙酰高絲氨酸巰基酶Met17p的基因MET17，特別是通過提高啤酒酵母中特征性的non－ScMET17基因的表達(dá)量，產(chǎn)品香味被提高的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
文檔編號C12N9/00GK1920044SQ20061012138
公開日2007年2月28日 申請日期2006年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月22日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社