專利名稱：一種生物殺蟲劑篩選模型及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及利用基因工程方法對(duì)生物殺蟲劑進(jìn)行大規(guī)模篩選的方法。
背景技術(shù)：
隨著全球自然環(huán)境變化以及人類活動(dòng)的影響，蟲媒病的傳播有加重的趨勢(shì)。目前衛(wèi)生害蟲的防治主要使用化學(xué)殺滅的方法，化學(xué)殺蟲劑雖然對(duì)衛(wèi)生害蟲和水生生物毒性較大，但是對(duì)哺乳動(dòng)物也有傷害，而且衛(wèi)生害蟲容易對(duì)化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。
昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是近20年發(fā)展起來(lái)的生物殺蟲劑，對(duì)環(huán)境和人畜安全，防治效果好，還可以防止昆蟲產(chǎn)生抗藥性，可達(dá)到長(zhǎng)期控制的目的，因而應(yīng)用前景十分廣闊。但是，目前昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選通常以整個(gè)蟲體為對(duì)象進(jìn)行篩選，這種篩選方法篩選信號(hào)弱，靈敏度低，作用靶點(diǎn)和機(jī)理不明，大大影響了篩選效率。因此，需要研究一種可以大規(guī)模篩選的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
由于昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育是通過(guò)定期的蛻皮實(shí)現(xiàn)的，蛻皮過(guò)程是在甾醇、保幼素、20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)等幾種昆蟲激素的調(diào)節(jié)下完成的。20E的受體是一種核酸受體，由蛻皮激素受體(ecdysteriod receptor，EcR)及哺乳動(dòng)物類維生素AX受體類似物超螺旋蛋白(Ultraspiracleprotein，USP)組成，前者為前導(dǎo)DNA結(jié)合位點(diǎn)，后者為配體結(jié)合位點(diǎn)。只有在EcR及USP結(jié)合形成二聚體時(shí)，EcR-USP二聚體才能與位于蛻皮激素可誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)的蛻皮激素響應(yīng)元件(Ecdysone responseelement，EcRE)相結(jié)合而啟動(dòng)早期基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)這種激素依賴性的生化代謝步驟的任何干擾，都可導(dǎo)致靶昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育異常甚至死亡。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種生物殺蟲劑篩選模型，該模型具有篩選信號(hào)強(qiáng)，靈敏度高，作用靶點(diǎn)和機(jī)理明確，篩選效率高的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種生物殺蟲劑篩選模型，該模型是染色體上整合有以下外源基因序列的巴斯德畢赤酵母(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段；(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的基因片段(3)核苷酸序列為SEQ ID NO.3所述的基因片段。
本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型，其中SEQ ID NO.1是能在巴斯德畢赤酵母中組成型表達(dá)白紋伊蚊(A.albopictus)蛻皮激素受體EcR的基因表達(dá)盒GAP Promoter-EcR-AOXl TT，其堿基序列為agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa120cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc180gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc240
aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480tatgaattca tgatgaaaag aagatggtcc aacaatggtg gattcactgc tttgagaatg 540ctggacgact cttcttccga ggttacttcc tcttccgccg ccctgggtat gaccatgtct 600ccaaattctc tcggttcacc aaactacgat gaactggaac tgtggagttc ttacgaagac 660aatgcctaca acggtcactc tgtcctatct aatggtaaca acaacctggg aggttgtgga 720gctgccaaca acctgctgat gaacggtatc gtcggtaaca acaacttgaa cggaatgatg 780aacatggcct ctcaagctgt ccaggccaac gcaaactcta ttcagcacat cgtcggtaac 840ctgatcaacg gtgtgaaccc aaatcagacc ttgattccac ctctgccttc tattatccag 900aataccttga tgaacacccc aagatctgaa tccgtcaact ccatttcttc aggtagagag 960gatttgtctc cttcctcttc attgaatggt tacaccgacg gttctgacgc caagaagcag1020aagaagggac caactccaag acagcaggag gaactgtgtc tggtttgtgg tgatagagct1080tccggttatc actacaatgc cttgacctgt gagggttgta aaggtttctt tagaagatct1140gtcaccaaga atgctgttta ctgttgtaag ttcggtcacg cctgtgagat ggacatgtac1200atgagaagaa agtgtcaaga gtgtagattg aagaagtgtc tggccgtcgg aatgagacct1260gagtgtgtcg tgccagagaa ccagtgtgcc atcaagagaa aggagaagaa agcccagaag1320gagaaggaca aggtgcaaac taacgccacc gtctctacaa ctaactctac ctacagatct1380gagatactgc caatcctgat gaaatgtgat ccaccgccgc accaagctat acctctacta1440ccagaaaagt tgctgcagga gaatagattg agaaacatac ctctgctgac tgctaaccaa1500atggccgtca tctacaaatt gatctggtac caggacggtt acgagcagcc atctgaggaa1560gatttgaaaa gaataatgat cggttctcca aacgaggagg aagatcaaca tgacgtgcac1620ttcagacaca taactgaaat cacaatcttg acagttcaat tgatcgtgga gttcgccaag1680ggactgccag catttaccaa gattccacag gaggaccaga tcactctgct gaaggcctgt1740tcttctgagg tcatgatgct gagaatggcc agaagatacg acgctgccac cgactccatc1800ctgttcgcta acaacagatc ttacactaga gactcctaca gaatggccgg catggctgac1860actatagagg acctgctgca cttctgtaga cagatgttct ccttgactgt ggacaacgtc1920gagtacgcct tgctgactgc tatcgtcatc ttctctgaca gaccaggtct ggagcaggcc1980gagctggtcg agcacatcca gtcttactac atcgacactc tgagaatcta catcctgaat2040agacacgctg gtgacccaaa gtgttctgtg atattcgcca aactgctgtc tatcctgacc2100gaactgagaa ctttgggtaa ccagaactct gagatgtgtt tctctttgaa gctgaagaac2160agaaaactgc caagattcct ggaggagatc tgggacgtcc aggacatacc tccatctatg2220caggcccaga tgcactctca tggtactcca cagtcctctt cctcctcttc ctcttcctct2280tcctcttcct cttccaacgg ttcttccaat ggtaattcta attccaacgg acctcatcca2340catcctcacg gacagcaatt aactccaaat cagcagcagc ctccacaccc acagcagcag2400cagcactctc agttacagca agttcacgcc aacggttctg gatctggtgg tgcctcttcc2460aacaattctt ctagttccgg aggtttgggt gtccctgttg gtttgggtgg aggtgccttg2520gaccacgttt aatctagaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc2580gaccatcatc atcatcatca ttgagtttta gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag2640ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct agattctaat caagaggatg tcagaatgcc2700atttgcctga gagatgcagg cttcattttt gatacttttt tatttgtaac ctatatagta2760taggattttt tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct2820cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt2880cttggtattt cccactcctc ttcagagtac agaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcg2940atccg2945
本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型，其中SEQ ID NO.2是能在巴斯德畢赤酵母中組成型表達(dá)超螺旋蛋白USP的基因表達(dá)盒TEF1 Promoter-USP-CYC1 TT，其堿基序列是cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg 60actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa attttccctc 120tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga 180ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt 240tcttgaaatt ttttttttta gtttttttct ctttcagtga cctccattga tatttaagtt 300aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt 360ttttacttct tgttcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagggc ggaattatcg 420gatcccgaat tatcggatcc catgctgaag aaggaaaaac caatgctgtc tgttgctgct 480atcatccagg ctcagggaag atgggataga acattgcctc tggcaggatt ggcaggtttc 540gatgccgcct tggttggtca catgggtcca ctgtctccac aggacatgaa acctgatttg 600aaaccagaca tatctttgct gaatggttct gtgggtccat tttctcttag acacaactgt 660ggtccagcct ctccaggtgc tttcaaccag caggtcgctg cagcccctca acagcaacag 720cagaatgtca acaactcttt gaactctcag cagcaaaatt ccggtggagg tggaggtgga 780ggtacaccaa ctaccccaac caacatgtct caacagtacc caccaaatca tccattgtct 840ggttccaagc atctgtgttc tatctgtggt gatagagcct ctggaaagca ttacggtgtt 900tattcttgtg aaggatgtaa aggatttttc aagagaactg ttagaaaaga cttgtcctat 960gcctgtagag aggacaagaa ctgtactata gacaaaagac aaagaaacag atgtctgtac1020tgtagatacc agaaatgttt ggcctgtggt atgaagagag aagccgtcca ggaggagaga1080caaagatctt ccaagttttc cattaagtct gaagagatca actctacctc ttccgtgaga1140gacgtgacca tcgagagaat cactgctgct gaacagttgt ctgaacagaa atctggtgat1200aatgctatcc catacttgag agtcggatcc aactctatga ttcctccaga atataaggga1260gccgtttctc acctttgtca gatggtgaac aaacaaatct accagctgat agactttgcc1320agaagattgc cacactttac caacttgcat agagacgacc aggtcatgct gctgagatgt1380ggttggaacg agatgttgat cgctgccgtc gcctggagat ctatggagta catcgaaact1440gaaagatccc cagatggttc cagaatatct attagacagc cacaactgat gtgtttagga1500ccaaatttta ccctgcacag aaactctgcc cagcaggctg gagttgacac tctgttcgat1560agaatcctgt gtgagttggg aatcaaaatg aaaagactgg atgtgaccag agctgagctt1620ggagttctca aagctatcat actgttcaat ccagacatta gaggacttaa gtgtcagaat1680ggagacgacg gaatgagaga gaaaatctac gcctgtttgg acgaacattg taaacaacag1740catccatctg aggatggtag attcgctcag cttttgctga gattaccagc cctgagatct1800atctctctca agtgtctcga tcacctgaac tttataagat tgctctctga taaacatttg1860gacaatttta tcatcgagat gctcgatatg ccaatgtaat ctagacacgt ccgacggcgg1920cccacgggtc ccaggcctcg gagatccgtc ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt1980agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg2040agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag2100aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa2160cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa2220gct 2223本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型，其中SEQ ID NO.3是5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，由果蠅蛻皮激素受體響應(yīng)原件5次重復(fù)序列(5×EcRE)、果蠅熱休克蛋白(HSP27)基因啟動(dòng)子序列、綠色熒光蛋白(GFP)基因序列按上述順序串聯(lián)組成，其堿基序列是cgacaagggt tcaatgcact tgtcgacaag ggttcaatgc acttgtcgac aagggttcaa60
tgcacttgtc accggtcaat gaaaatacaa gctctgttgc actctgaaaa gacagctttt 120aaaagcgcga taagagaaga aaatgtttta aataaataca tacatacatg tacatatgta 180tgtactgcat cttaactgtt cgttttgctt tttattcgca aagagaaact cccagaaaag 240aaatgtcaag aagtttctgg ttctttctcc ctctctctat gaaaagccgg ctgtgctaga 300aagagccagt agatgcgaga gaaaactgtt tgttgaatta cggggcgtat tcaaaggggc 360ttttaaatgt cgcttaaatt ttaagtttga caggctaata attgcttgcc tatatctaaa 420tattattata tttgcattag gggatcatag ggaaaacctt ctctgcaggc aaaatctaac 480gaagatggca accccccatc attttattaa agttccgtcc ctggttgcca tgcactagtg 540tgtgtgagcc cagcgtcagt ataaaagccg gcgtcaacgt cgcccgagca cagtctaaac 600tgaaaaattg aaggcaaacg ttgaagcaaa cttcgctaaa aaaattcgaa aaagcaaaaa 660aaattccttt gtctagacag ggttgtgaat aaagagaaaa aaaatcaaaa ccatggggat 720ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 780ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 840ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 900gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 960cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag1020gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc1080gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc1140aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc1200gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc1260agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg1340ctgcccgaca accactacct gagcaccca 1369本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型的作用機(jī)理是在改造后的巴斯德畢赤酵母內(nèi)表達(dá)EcR及USP，形成EcR-USP二聚體，作用于EcRF，啟動(dòng)HSP27 promoter后使GFP表達(dá)，使巴斯德畢赤酵母呈現(xiàn)綠色熒光；本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型篩選出的藥物可以影響EcR或USP的表達(dá)、EcR-USP二聚體的形成和EcR-USP二聚體與EcRE結(jié)合的途徑，導(dǎo)致GFP表達(dá)發(fā)生改變(表現(xiàn)為發(fā)熒光的酵母所發(fā)出的熒光強(qiáng)度改變或使熒光酵母數(shù)目的增減)，即說(shuō)明該藥物能夠改變EcR-USP二聚體形成并與EcRE結(jié)合的效率，從而影響所控制基因的表達(dá)，是一種有效的生物殺蟲劑。
本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型的制備方法，其構(gòu)建策略見圖1，由以下步驟組成(1)人工合成白紋伊蚊EcR及USP的編碼序列，以雙表達(dá)盒形式插入到pGAPZ質(zhì)粒，得到pGAPZ重組質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)如圖1(A)所示；(2)將pGAPZ重組質(zhì)粒載體上的EcR表達(dá)盒和USP表達(dá)盒通過(guò)同源重組整合到巴斯德畢赤酵母的染色體上，得到酵母A；(3)將果蠅蛻皮激素受體響應(yīng)原件5次重復(fù)序列，依次接上受其調(diào)控的HSP27啟動(dòng)子和GFP基因，構(gòu)建出5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，然后將該DNA片段插入pPIC3.5K質(zhì)粒，得到pPIC3.5K重組質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)如圖1(B)所示；(4)將pPIC3.5K重組質(zhì)粒載體上的5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段通過(guò)同源重組整合到酵母A的染色體上，得到酵母B，即本發(fā)明所述的的生物殺蟲劑篩選模型。
本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型用于篩選生物殺蟲藥物的方法，具體步驟如下(1)本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型在YPD培養(yǎng)基中于28～30℃，250rpm培養(yǎng)至菌液濃度為OD600＝0.1～0.2，平均分裝于試管中，再按100μl藥物/ml菌液加入待篩選藥物，同時(shí)設(shè)加入等量溶解該藥物的溶劑的菌液為對(duì)照組，置于28℃～30℃、250～260rpm的條件下培養(yǎng)至菌液濃度為OD600＝0.8～1；(2)吸取步驟(1)所得到的菌液觀察，選出可以使GFP表達(dá)量改變的藥物即可。
采用本發(fā)明篩選生物殺蟲藥物的方法得到藥物是否為生物殺蟲藥物有以下兩種判斷方法1、吸取菌液用熒光顯微鏡觀察，能使發(fā)熒光的巴斯德畢赤酵母的熒光強(qiáng)度改變或使發(fā)熒光的巴斯德畢赤酵母數(shù)目增減的藥物即為目標(biāo)篩選物，否則為非目標(biāo)篩選物；2、通過(guò)半定量RT-PCR法檢測(cè)施加藥物組及對(duì)照組酵母模型的GFP基因轉(zhuǎn)錄效率來(lái)判斷待篩選藥物是否為目標(biāo)篩選物，具體方法為提取出步驟(2)所得的巴斯德畢赤酵母的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為擴(kuò)增的模板，然后設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增GFP基因的引物和可以擴(kuò)增巴斯德畢赤酵母染色體上能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的基因片段的引物，如巴斯德畢赤酵母的管家基因Actin-1，進(jìn)行半定量RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物包括GFP基因和巴斯德畢赤酵母染色體上能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的基因片段，最后以巴斯德畢赤酵母染色體上能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的基因片段為內(nèi)參，檢驗(yàn)GFP基因的轉(zhuǎn)錄效率，通過(guò)凝膠成像掃描系統(tǒng)掃描各條帶的灰度，求出GFP基因片段與內(nèi)參灰度的比值，該比值施藥前后有顯著變化，則該藥物即為目標(biāo)篩選物，否則為非目標(biāo)篩選物。
由于本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型能篩選出影響EcR或USP的表達(dá)、EcR-USP二聚體的形成、EcR-USP二聚體與EcRE結(jié)合的途徑的藥物，這些藥物可導(dǎo)致昆蟲發(fā)育受影響甚至于死亡，因此本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型可用于生物殺蟲藥物的快速、大規(guī)模篩選，本發(fā)明還具有篩選信號(hào)強(qiáng)，靈敏度高，作用機(jī)理明確的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型的構(gòu)建策略圖，其中(A)圖是pGAPZ重組質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)示意圖，(B)圖是pPIC3.5K重組質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是篩選例中空白對(duì)照組酵母模型顯微鏡下明視野(10×20)圖；圖3是篩選例中空白對(duì)照組酵母模型熒光顯微鏡視野(10×20)圖；圖4是篩選例中施藥組的酵母模型顯微鏡下明視野(10×20)圖；圖5是篩選例中施藥組的酵母模型熒光顯微鏡視野(10×20)圖；圖6是篩選例中施藥組模型酵母與空白組模型酵母的的半定量RT-PCR結(jié)果Lane 1是施藥組的擴(kuò)增結(jié)果，Lane 2是空白組的擴(kuò)增結(jié)果，M是100bp DNA標(biāo)志物。
具體實(shí)施例方式
制備例一、材料1、EcR序列(Genbank IDAF210733)、USP序列(Genbank IDAF210734)換上畢赤酵母偏愛(ài)的密碼子，果蠅蛻皮激素受體的響應(yīng)元件5次重復(fù)序列，5×EcRE(采用果蠅HSP27啟動(dòng)子區(qū)的EcRE序列，Genbank IDY07758)，均由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成；2、引物用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)，由北京賽百勝公司合成。
引物15`-gagctccccacacaccatag-3`引物25`-gaattccgcccttagattag-3`引物35`-tctagacacgtccgacggc-3`引物45`-aagcttagcttgcaaattaaag-3`3、pGAPZ質(zhì)粒購(gòu)自Invitrongen公司4、pPIC3.5K質(zhì)粒購(gòu)自Invitrongen公司5、pEGFP-N1購(gòu)自美國(guó)clonetech公司6、畢赤酵母GS115購(gòu)自Invitrongen公司7、工具酶HindIII、Sac I、Bgl II、Not I均購(gòu)自Takara公司二、方法1、將人工合成的EcR序列和USP序列克隆到pUC57質(zhì)粒上，得到EcR-pUC57質(zhì)粒和USP-pUC57質(zhì)粒。
2、構(gòu)建pGAPZ重組質(zhì)粒載體(1)將人工合成的EcR亞克隆入pGAPZ質(zhì)粒GAP啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建pGAP promoter-EcR-AOX1TT讀碼框。
(2)以pGAP質(zhì)粒為模板，用引物1和引物2擴(kuò)增TEF1 promoter序列；以pGAP質(zhì)粒為模板，用引物3和引物4擴(kuò)增CYC1 TT序列；將擴(kuò)增的TEF1 promoter序列和CYC1 TT序列分別插入到USP-pUC57質(zhì)粒中USP序列的上游和下游，構(gòu)建TEF1 promoter-USP-CYC1 TT讀碼框；用HindIII和Sac I雙酶解回收目的基因TEF promoter-USP-CYC1 TT序列，插入pGAP promoter-ECR-AOX1TT讀碼框的下游，構(gòu)建pGAPZ-ECR-AOX1TT-TEF promoter-USP-CYCTT質(zhì)粒。
3、構(gòu)建pPIC3.5K-5×EcRE-HSP27promoter-GFP質(zhì)粒從果蠅基因組DNA中擴(kuò)增出HSP27promoter序列，連接到5×EcRE序列下游，然后將5×EcRE-HSP27promoter序列連接入pEGFP-N1質(zhì)粒的GFP基因的上游，然后用BglII和Not I雙酶解獲得5×EcRE-HSP-GFP片斷，并利用相同的酶切位點(diǎn)將該片段亞克隆入pPIC3.5K質(zhì)粒。
4、構(gòu)建本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型使用AvrII酶解pGAPZ-ECR-AOX1TT-TEF promoter-USP-CYCTT質(zhì)粒，使得質(zhì)粒線性化，凝膠純化回收，電轉(zhuǎn)化GS115酵母，Zeocin+梯度平板篩選陽(yáng)性高拷貝克隆，獲得重組酵母A(操作參見Invitrongen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè))。
使用Bgl II酶切pPIC3.5K-5×EcRE-HSP27promoter-GFP質(zhì)粒，凝膠純化回收大片斷，電轉(zhuǎn)化上述重組酵母A，組氨酸缺陷型平板篩選陽(yáng)性克隆，G418+梯度陽(yáng)性平板篩選高拷貝克隆，從而獲得高拷貝重組酵母B(操作參見Invitrongen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè))。
三、結(jié)果從培養(yǎng)3天的Zeocin+上平板挑取陽(yáng)性高拷貝克隆(酵母B)至YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)，29℃搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液涂板，熒光顯微鏡下可見球狀的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，見圖4。說(shuō)明將EcR基因和USP基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、結(jié)合形成EcR-USP二聚體、二聚體作用于響應(yīng)序列EcRE，啟動(dòng)HSP27啟動(dòng)子從而啟動(dòng)報(bào)告基因GFP表達(dá)的模型在巴斯德畢赤酵母體內(nèi)成功建立，即本發(fā)明所述的一種生物殺蟲劑篩選模型已成功建立。
篩選例(1)待篩選藥物中文名稱蟲酰肼，購(gòu)于江蘇山達(dá)化工有限公司。
通用名稱tebbufenozide商品名稱MIMIC，comfirm，Romdan，米滿化學(xué)名稱N-叔丁基-N-(4-乙基苯甲酰基)-3，5-二甲基苯酰肼毒性對(duì)眼睛和皮膚無(wú)刺激性，對(duì)高等動(dòng)物無(wú)致畸、致癌、致突變作用。該劑按世界糧油組織(FAO)標(biāo)準(zhǔn)，全面衡量，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)農(nóng)藥產(chǎn)品。
作用機(jī)制蟲酰肼類殺蟲劑是20-羥基蛻皮酮類似物，其作用機(jī)制尚不明確。
(2)篩選方法將本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型(菌液濃度為OD600＝0.1)分裝于試管中，每管5毫升。留5個(gè)空白管(不加待篩選藥物，只加500μl溶解該藥物的溶劑)做為對(duì)照組，其它實(shí)驗(yàn)組加入500μl待篩選藥物(施藥過(guò)程參見說(shuō)明書)，于28℃及250rpm的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。待菌液濃度為OD600＝0.8時(shí)，吸取10μl于載玻片上用熒光顯微鏡觀察。
(3)篩選結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4、圖5、圖6，從圖中可以看出，施藥組相對(duì)于空白對(duì)照組其熒光的酵母數(shù)明顯減少，熒光酵母的熒光強(qiáng)度也明顯減弱?？梢娤x酰肼是有效的生物殺蟲劑。
下面將通過(guò)半定量RT-PCR法檢測(cè)施加藥物組及對(duì)照組酵母模型的GFP基因轉(zhuǎn)錄效率。
a.引物用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)，由北京賽百勝公司合成。
pActin15′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′pActin25′-AACCAGCGTAAATTGGAACG-3′pGFP15′-TATACGTAATGGTGAGCAAGGGCG-3′pGFP25′-ATCCAAGGGTTGGCTAGATCCGGTGGAT-3′b.模板使用Omega公司酵母總RNA提取試劑盒分別提取施藥組與空白組的模型酵母總RNA，使用隨機(jī)引物、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。
c.PCR產(chǎn)物引物pActin1和pActin2擴(kuò)增酵母管家基因Actin-1，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度283bp；引物pGFP1和pGFP2擴(kuò)增EGFP基因，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為737bp。
d.PCR反應(yīng)采用GFP和Aetin-1同管擴(kuò)增的方法，以反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物cDNA為模板，采用54℃復(fù)性溫度擴(kuò)增GFP、Actin-1基因。
e.結(jié)果與分析PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖7，以巴斯德畢赤酵母管家基因Actin-1作為內(nèi)參，檢驗(yàn)GFP基因的轉(zhuǎn)錄效率。通過(guò)凝膠成像掃描系統(tǒng)掃描各條帶的灰度，求band1(GFP)與band2(內(nèi)參)灰度的比值，lane 1比值為0.614，lane2比值為1.134?？梢娛┘铀幬锖?，巴斯德畢赤酵母的GFP基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，也就說(shuō)明了蟲酰肼是有效的生物殺蟲劑。
核苷酸序列表<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>一種生物殺蟲劑篩選系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用<160>3<210>1<211>2945<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<223>人工序列描述基因片斷<400>1agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480tatgaattca tgatgaaaag aagatggtcc aacaatggtg gattcactgc tttgagaatg 540ctggacgact cttcttccga ggttacttcc tcttccgccg ccctgggtat gaccatgtct 600ccaaattctc tcggttcacc aaactacgat gaactggaac tgtggagttc ttacgaagac 660aatgcctaca acggtcactc tgtcctatct aatggtaaca acaacctggg aggttgtgga 720gctgccaaca acctgctgat gaacggtatc gtcggtaaca acaacttgaa cggaatgatg 780aacatggcct ctcaagctgt ccaggccaac gcaaactcta ttcagcacat cgtcggtaac 840ctgatcaacg gtgtgaaccc aaatcagacc ttgattccac ctctgccttc tattatccag 900aataccttga tgaacacccc aagatctgaa tccgtcaact ccatttcttc aggtagagag 960gatttgtctc cttcctcttc attgaatggt tacaccgacg gttctgacgc caagaagcag1020aagaagggac caactccaag acagcaggag gaactgtgtc tggtttgtgg tgatagagct1080tccggttatc actacaatgc cttgacctgt gagggttgta aaggtttctt tagaagatct1140gtcaccaaga atgctgttta ctgttgtaag ttcggtcacg cctgtgagat ggacatgtac1200atgagaagaa agtgtcaaga gtgtagattg aagaagtgtc tggccgtcgg aatgagacct1260gagtgtgtcg tgccagagaa ccagtgtgcc atcaagagaa aggagaagaa agcccagaag1320gagaaggaca aggtgcaaac taacgccacc gtctctacaa ctaactctac ctacagatct1380gagatactgc caatcctgat gaaatgtgat ccaccgccgc accaagctat acctctacta1440ccagaaaagt tgctgcagga gaatagattg agaaacatac ctctgctgac tgctaaccaa1500atggccgtca tctacaaatt gatctggtac caggacggtt acgagcagcc atctgaggaa1560gatttgaaaa gaataatgat cggttctcca aacgaggagg aagatcaaca tgacgtgcac1620ttcagacaca taactgaaat cacaatcttg acagttcaat tgatcgtgga gttcgccaag1680ggactgccag catttaccaa gattccacag gaggaccaga tcactctgct gaaggcctgt1740tcttctgagg tcatgatgct gagaatggcc agaagatacg acgctgccac cgactccatc1800ctgttcgcta acaacagatc ttacactaga gactcctaca gaatggccgg catggctgac1860actatagagg acctgctgca cttctgtaga cagatgttct ccttgactgt ggacaacgtc1920gagtacgcct tgctgactgc tatcgtcatc ttctctgaca gaccaggtct ggagcaggcc1980gagctggtcg agcacatcca gtcttactac atcgacactc tgagaatcta catcctgaat2040
agacacgctg gtgacccaaa gtgttctgtg atattcgcca aactgctgtc tatcctgacc2100gaactgagaa ctttgggtaa ccagaactct gagatgtgtt tctctttgaa gctgaagaac2160agaaaactgc caagattcct ggaggagatc tgggacgtcc aggacatacc tccatctatg2220caggcccaga tgcactctca tggtactcca cagtcctctt cctcctcttc ctcttcctct2280tcctcttcct cttccaacgg ttcttccaat ggtaattcta attccaacgg acctcatcca2340catcctcacg gacagcaatt aactccaaat cagcagcagc ctccacaccc acagcagcag2400cagcactctc agttacagca agttcacgcc aacggttctg gatctggtgg tgcctcttcc2460aacaattctt ctagttccgg aggtttgggt gtccctgttg gtttgggtgg aggtgccttg2520gaccacgttt aatctagaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc2580gaccatcatc atcatcatca ttgagtttta gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag2640ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct agattctaat caagaggatg tcagaatgcc2700atttgcctga gagatgcagg cttcattttt gatacttttt tatttgtaac ctatatagta2760taggattttt tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct2820cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt2880cttggtattt cccactcctc ttcagagtac agaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcg2940atccg2945<210>2<211>2223<212>DNA<213>人工序列<220>
<220>CDS<223>人工序列描述基因片斷<400>2cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg 60actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa attttccctc 120tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga 180ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt 240tcttgaaatt ttttttttta gtttttttct ctttcagtga cctccattga tatttaagtt 300aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt 360ttttacttct tgttcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagggc ggaattatcg 420gatcccgaat tatcggatcc catgctgaag aaggaaaaac caatgctgtc tgttgctgct 480atcatccagg ctcagggaag atgggataga acattgcctc tggcaggatt ggcaggtttc 540gatgccgcct tggttggtca catgggtcca ctgtctccac aggacatgaa acctgatttg 600aaaccagaca tatctttgct gaatggttct gtgggtccat tttctcttag acacaactgt 660ggtccagcct ctccaggtgc tttcaaccag caggtcgctg cagcccctca acagcaacag 720cagaatgtca acaactcttt gaactctcag cagcaaaatt ccggtggagg tggaggtgga 780ggtacaccaa ctaccccaac caacatgtct caacagtacc caccaaatca tccattgtct 840ggttccaagc atctgtgttc tatctgtggt gatagagcct ctggaaagca ttacggtgtt 900tattcttgtg aaggatgtaa aggatttttc aagagaactg ttagaaaaga cttgtcctat 960gcctgtagag aggacaagaa ctgtactata gacaaaagac aaagaaacag atgtctgtac1020tgtagatacc agaaatgttt ggcctgtggt atgaagagag aagccgtcca ggaggagaga1080caaagatctt ccaagttttc cattaagtct gaagagatca actctacctc ttccgtgaga1140gacgtgacca tcgagagaat cactgctgct gaacagttgt ctgaacagaa atctggtgat1200aatgctatcc catacttgag agtcggatcc aactctatga ttcctccaga atataaggga1260gccgtttctc acctttgtca gatggtgaac aaacaaatct accagctgat agactttgcc1320
agaagattgc cacactttac caacttgcat agagacgacc aggtcatgct gctgagatgt1380ggttggaacg agatgttgat cgctgccgtc gcctggagat ctatggagta catcgaaact1440gaaagatccc cagatggttc cagaatatct attagacagc cacaactgat gtgtttagga1500ccaaatttta ccctgcacag aaactctgcc cagcaggctg gagttgacac tctgttcgat1560agaatcctgt gtgagttggg aatcaaaatg aaaagactgg atgtgaccag agctgagctt1620ggagttctca aagctatcat actgttcaat ccagacatta gaggacttaa gtgtcagaat1680ggagacgacg gaatgagaga gaaaatctac gcctgtttgg acgaacattg taaacaacag1740catccatctg aggatggtag attcgctcag cttttgctga gattaccagc cctgagatct1800atctctctca agtgtctcga tcacctgaac tttataagat tgctctctga taaacatttg1860gacaatttta tcatcgagat gctcgatatg ccaatgtaat ctagacacgt ccgacggcgg1920cccacgggtc ccaggcctcg gagatccgtc ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt1980agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg2040agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag2100aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa2160cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa2220gct 2223<210>3<211>1369<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述基因片斷<400>3cgacaagggt tcaatgcact tgtcgacaag ggttcaatgc acttgtcgac aagggttcaa 60tgcacttgtc accggtcaat gaaaatacaa gctctgttgc actctgaaaa gacagctttt 120aaaagcgcga taagagaaga aaatgtttta aataaataca tacatacatg tacatatgta 180tgtactgcat cttaactgtt cgttttgctt tttattcgca aagagaaact cccagaaaag 240aaatgtcaag aagtttctgg ttctttctcc ctctctctat gaaaagccgg ctgtgctaga 300aagagccagt agatgcgaga gaaaactgtt tgttgaatta cggggcgtat tcaaaggggc 360ttttaaatgt cgcttaaatt ttaagtttga caggctaata attgcttgcc tatatctaaa 420tattattata tttgcattag gggatcatag ggaaaacctt ctctgcaggc aaaatctaac 480gaagatggca accccccatc attttattaa agttccgtcc ctggttgcca tgcactagtg 540tgtgtgagcc cagcgtcagt ataaaagccg gcgtcaacgt cgcccgagca cagtctaaac 600tgaaaaattg aaggcaaacg ttgaagcaaa cttcgctaaa aaaattcgaa aaagcaaaaa 660aaattccttt gtctagacag ggttgtgaat aaagagaaaa aaaatcaaaa ccatggggat 720ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 780ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 840ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 900gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 960cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag1020gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc1080gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc1140aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc1200gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc1260agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg1340ctgcccgaca accactacct gagcaccca 1369
權(quán)利要求
1.一種生物殺蟲劑篩選模型，該模型是染色體上整合有以下外源基因序列的巴斯德畢赤酵母(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段；(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的基因片段；(3)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述的基因片段。
2.權(quán)利要求1所述的一種生物殺蟲劑篩選模型的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)人工合成白紋伊蚊EcR及USP的編碼序列，以雙表達(dá)盒形式插入到pGAPZ質(zhì)粒，得到pGAPZ重組質(zhì)粒載體；(2)將pGAPZ重組質(zhì)粒載體上的雙表達(dá)盒通過(guò)同源重組整合到巴斯德畢赤酵母的染色體上；(3)將果蠅蛻皮激素受體的響應(yīng)元件5次重復(fù)序列，依次接上受其調(diào)控的HSP27啟動(dòng)子和GFP基因，構(gòu)建出5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，然后將該DNA片段插入pPIC3.5K質(zhì)粒，得到pPIC3.5K重組質(zhì)粒載體；(4)將pPIC3.5K重組質(zhì)粒載體上的5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段通過(guò)同源重組整合到已含有EcR基因表達(dá)盒和USP基因表達(dá)盒的巴斯德畢赤酵母的染色體上。
3.權(quán)利要求1所述的生物殺蟲劑篩選模型用于篩選生物殺蟲藥物的方法，該方法由以下步驟組成(1)本發(fā)明所述的生物殺蟲劑篩選模型在YPD培養(yǎng)基中于28～30℃，250rpm培養(yǎng)至菌液濃度為OD600＝0.1～0.2，平均分裝于試管中，再按100μl藥物/ml菌液加入待篩選藥物，同時(shí)設(shè)加入等量溶解該藥物的溶劑的菌液為對(duì)照組，置于28℃～30℃、250～260rpm的條件下培養(yǎng)至菌液濃度為OD600＝0.8～1；(2)吸取步驟(1)所得到的菌液觀察，選出可以使GFP表達(dá)量改變的藥物即可。
全文摘要
一種生物殺蟲劑篩選模型，該模型是染色體上整合有以下外源基因序列的巴斯德畢赤酵母(1)組成型表達(dá)白紋伊蚊蛻皮激素受體EcR的基因表達(dá)盒GAP Promoter－EcR－AOX1 TT；(2)組成型表達(dá)超螺旋USP蛋白的基因表達(dá)盒TEF1 Promoter－USP－CYC1 TT；(3)5×EcRE－HSP27 Promoter－GFP DNA片段。該模型的制備是先將含有蛻皮激素受體EcR及超螺旋蛋白USP基因整合到巴斯德畢赤酵母的染色體上，再把含有果蠅5×EcRE－HSP27 Promoter－GFP DNA片段整合到在已含有EcR基因和USP基因的酵母的染色體上得到。把待篩選藥物與本發(fā)明所述的生物殺蟲藥物篩選模型共培養(yǎng)，即可篩選出能遏止或增強(qiáng)GFP表達(dá)的生物殺蟲劑，具有篩選快速、靈敏度高、作用機(jī)理明確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101016518SQ20061012205
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者彭鴻娟, 陳曉光, 顧金保, 楊俊 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)