專利名稱：生物催化制備膠原蛋白肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物催化與生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種在水/有機(jī)溶劑雙相體系中生物催化制備膠原蛋白肽的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣、具有免疫學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)，在動(dòng)物的皮膚組織、骨骼等中含量尤為豐富。例如，豬皮的蛋白質(zhì)含量高達(dá)26.4％，其中膠原蛋白就占了87.8％；魚鱗、魚皮中的粗膠原蛋白約占80％；動(dòng)物骨骼中也富含該種蛋白質(zhì)，約占有機(jī)物的70.0％-80.0％。然而，長期以來，這些富含膠原蛋白的動(dòng)物組織多做為工業(yè)生產(chǎn)中的下腳料而被廢棄，或利用率極低。如，畜產(chǎn)品加工后得到的骨頭常制成骨粉作為飼料廉價(jià)出售，而一般水產(chǎn)加工中則將魚鱗、魚皮作為廢棄物扔掉的，尤其是魚鱗；一些水溶性膠原蛋白甚至直接隨加工廢液排走，不僅污染環(huán)境，而且造成了極大的資源浪費(fèi)，因此，有必要對其進(jìn)行深加工的研究，以期提高此類廢棄物的附加值，化廢為寶、減少環(huán)境污染。膠原蛋白肽是膠原蛋白水解后的產(chǎn)物，具有較高的消化吸收性，擁有極強(qiáng)的吸收性。近年來國內(nèi)外的研究還表明，膠原多肽除了具有很高的營養(yǎng)特性外，依其結(jié)構(gòu)和分子量的不同還具有許多特殊的生理功能，如保護(hù)胃粘膜和抗?jié)冏饔?，抗過敏作用，抑制血壓上升作用，促進(jìn)骨形成作用、促進(jìn)皮膚膠原代謝等作用，有些特殊氨基酸還具有防癌、防關(guān)節(jié)炎等功效。此外，膠原蛋白肽還具有良好的加工特性和保濕性。因而，它們在皮革業(yè)、影像業(yè)、制藥業(yè)、糖果生產(chǎn)、生物醫(yī)學(xué)原料、化妝品業(yè)和食品工業(yè)中有均有著良好的應(yīng)用前景。
目前國內(nèi)外制備膠原蛋白肽主要采用酶法，一般用堿性水溶液作為反應(yīng)介質(zhì)，酶粉、液體酶形式的單酶或者多種酶作為催化劑水解。這些方法目前普遍存在如下缺點(diǎn)(1)步驟繁多，水解率低、能耗大、產(chǎn)物難分離；(2)反應(yīng)中常采用鹽浸泡、堿液浸泡、化學(xué)試劑處理、脂肪酶酶解—表面活性劑聯(lián)合等方式來脫去組織中的脂肪，增加了后續(xù)產(chǎn)物提純步驟的困難；(3)反應(yīng)后多采用高溫滅酶來中止反應(yīng)，不僅增加能耗，且滅酶后難以分離去酶、酶利用率低，大大增加了該方法的經(jīng)濟(jì)成本和產(chǎn)物分離純化的難度；(4)反應(yīng)后大量堿廢液的排放，會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。因此，研究開發(fā)膠原蛋白肽制備新工藝具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低、反應(yīng)過程簡單可控、產(chǎn)物易分離的水/有機(jī)溶劑雙相體系中生物催化制備膠原蛋白肽的新方法。
本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種在水/有機(jī)溶劑雙相體系中生物催化制備膠原蛋白肽的方法在反應(yīng)器中按有機(jī)溶劑與水的體積比為0.01～1∶1的比例配成水/有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)介質(zhì)，按膠原蛋白粉與反應(yīng)介質(zhì)的用量之比為0.01～10g∶1ml加入生物催化劑膠原蛋白粉，按生物催化劑與膠原蛋白的重量比為0.001～10∶1的比例加入固定化水解酶，在溫度為50～70℃、振蕩速度為100～300rpm、常壓下反應(yīng)0.5～48小時(shí)后，分離得到膠原蛋白肽。
所述固定化水解酶包括固定化蛋白酶，固定化脂肪酶和固定化酯酶，來源于Bacillus lichemiforms、Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis，Rhizomucormiehei Mucor miehei，Candida antarctica，Burkholderia cepacia，Thermomyceslanuginosus，papaya latex，fig，liver，stomach或pancreas。
所述水不溶性有機(jī)溶劑選自飽和脂肪烴類、芳烴類、酯類、醚類和含4個(gè)以上碳原子醇類。具體是，所述飽和脂肪烴類溶劑包括丁烷溶劑；所述芳烴類溶劑包括甲苯溶劑；所述酯類溶劑包括辛酸乙酯溶劑；所述醇類溶劑包括辛醇溶劑；所述醚類溶劑包括石油醚溶劑。
分離膠原蛋白肽方法如下反應(yīng)混合物經(jīng)過濾除去固定化水解酶，離心去除有機(jī)相，剩余溶液在50～70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得的沉淀物用不同截留量的超濾膜或者納濾膜分級(jí)分離可以得到具有不同分子量的膠原蛋白肽。
本發(fā)明的原理采用水/有機(jī)溶劑雙相體系，以固定化水解酶作為催化劑，催化膠原蛋白粉進(jìn)行水解反應(yīng)，得到膠原蛋白肽。
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)采用高效、高穩(wěn)定性的生物催化劑固定化水解酶來催化膠原蛋白肽合成，克服了現(xiàn)有技術(shù)中酶容易失活，反應(yīng)效率低的缺點(diǎn)；反應(yīng)過程簡單可控、產(chǎn)物易分離；(2)反應(yīng)終止采用過濾除酶的方法，簡便迅速，克服了現(xiàn)有技術(shù)中高溫滅酶能耗大、酶蛋白易殘留等缺點(diǎn)；且固定化酶可反復(fù)使用，降低生產(chǎn)成本；(3)利用了非水相酶催化的新技術(shù)，采用水/有機(jī)溶劑反應(yīng)介質(zhì)作為反應(yīng)介質(zhì)，酶促脫脂后的脂肪酸、甘油等物質(zhì)可在反應(yīng)過程中被萃取于有機(jī)相里，反應(yīng)后可與有機(jī)溶劑一起經(jīng)離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，簡化了產(chǎn)物分離步驟，得到的產(chǎn)品雜質(zhì)少；經(jīng)蒸發(fā)除去的有機(jī)溶劑可以回收重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本；(4)反應(yīng)條件溫和，無含堿廢液排放，環(huán)境友好。
具體實(shí)施例方式
為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。
實(shí)施例1把0.5g膠原蛋白粉、0.5mg來源于papaya latex的固定化蛋白酶和50ml水/丁烷(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于30℃、100rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)3h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用超濾膜6000膜和5000膜分級(jí)分離可以得到分子量在6000～5000Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例2把0.5g膠原蛋白粉、0.5mg來源于Bacillus lichemiforms的固定化脂肪酶和50ml水/辛醇(1∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)12h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用不同截留量的超濾膜5000膜和2000膜分級(jí)分離可以得到分子量在5000～2000Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例3把0.5g膠原蛋白粉、5mg來源于Bacillus amyloliquefaciens的固定化蛋白酶和10ml水/甲苯(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于50℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)0.5h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用超濾膜2000膜和1000膜分級(jí)分離可以得到分子量在2000～1000Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例4把0.5g膠原蛋白粉、5mg來源于Bacillus subtilis的固定化酯酶和10ml水/辛酸乙酯(10∶1)兩相介質(zhì)中，置于70℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)0.5h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為800和1000的納濾膜分級(jí)分離可以得到分子量在800～1000Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例5把0.5g膠原蛋白粉、50mg來源于Rhizomucor miehei的和5ml水/丁醇(1∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于50℃、150rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為700～800的納濾膜分離可以得到分子量在700～800Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例6把0.5g膠原蛋白粉、50mg來源于Mucor miehei的固定化脂肪酶和5ml水/甲苯(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于40℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)30h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為400～500的納濾膜分級(jí)分離可以得到分子量在400～500Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例7把0.5g膠原蛋白粉、100mg來源于pancreas的固定化蛋白酶和1ml水/石油醚(50∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于50℃、150rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為150～200的納濾膜分離可以得到分子量在150～200Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例8把0.5g膠原蛋白粉、100mg來源于stomach的固定化蛋白酶和1ml水/庚醇(1∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于70℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)0.5h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例9把0.5g膠原蛋白粉、1000mg來源于fig的固定化蛋白酶和0.5ml水/辛酸乙酯(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例10把0.5g膠原蛋白粉、1000mg來源于Pig liver的固定化酯酶和0.5ml水/己烷(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例11把0.5g膠原蛋白粉、5000mg來源于Candida antarctica的固定化脂肪酶和0.1ml水/辛烷(50∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例12把0.5g膠原蛋白粉、5000mg來源于Burkholderia cepacia的固定化脂肪酶和0.1ml水/戊烷(100∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
實(shí)施例13把0.5g膠原蛋白粉、100mg來源于Thermomyces lanuginosus cepacia的固定化脂肪酶和0.05ml水/丁醇(50∶1)兩相介質(zhì)放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)48h后，過濾除去固定化蛋白酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用截留分子量為80～100的納濾膜分離可以得到分子量在80～100Da的膠原蛋白肽。
權(quán)利要求
1.一種生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于在反應(yīng)器中，按有機(jī)溶劑與水的體積比為0.01～1∶1的比例配成水/有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)介質(zhì)，按膠原蛋白粉與反應(yīng)介質(zhì)的用量之比為0.01～10g∶1ml加入膠原蛋白粉，按生物催化劑與膠原蛋白粉的重量比為0.001～10∶1的比例加入生物催化劑固定化水解酶，在溫度為50～70℃、振蕩速度為100～300rpm、常壓下反應(yīng)0.5～48小時(shí)后，分離得到膠原蛋白肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于所述固定化水解酶為來源于微生物的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶以及固定化酯酶，包括Bacillus lichemiforms、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Rhizomucor miehei、Mucor miehei、Candida antarctica、Burkholderia cepacia或Thermomyces lanuginosus。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于所述固定化水解酶為來源于植物的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶以及固定化酯酶，包括papaya latex或fig。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于固定化水解酶為來源于動(dòng)物的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶以及固定化酯酶，包括stomach、liver或pancreas。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為水不互溶有機(jī)溶劑，選自飽和脂肪烴類、芳烴類、酯類、醚類和含4個(gè)以上碳原子醇類。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于所述飽和脂肪烴類溶劑包括丁烷溶劑；所述芳烴類溶劑包括甲苯溶劑；所述酯類溶劑包括辛酸乙酯溶劑；所述醇類溶劑包括正辛醇溶劑；所述醚類溶劑包括石油醚溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化制備膠原蛋白肽的方法，其特征在于所述的分離為反應(yīng)混合物經(jīng)過濾除去固定化水解酶，離心后去除有機(jī)相，剩余溶液在50～70℃下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得到的沉淀物用不同截留量的超濾膜或者納濾膜分級(jí)分離可以得到具有不同分子量的膠原蛋白肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化制備膠原蛋白肽的方法，該方法是在反應(yīng)器中按有機(jī)溶劑與水的體積比為0.01～1∶1的比例配成水/有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)介質(zhì)，按膠原蛋白粉與反應(yīng)介質(zhì)的用量之比為0.01～10g∶1ml加入膠原蛋白粉，按生物催化劑與膠原蛋白粉的重量比為0.001～10∶1的比例加入固定化水解酶，在溫度為50～70℃、振蕩速度為100～300rpm、常壓下反應(yīng)0.5～48小時(shí)后，分離得到膠原蛋白肽。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中步驟繁瑣、酶容易失活、反應(yīng)效率低、高溫滅酶能耗大、酶蛋白易殘留的缺點(diǎn)；具有成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、反應(yīng)過程簡單可控、產(chǎn)物易從反應(yīng)混合體系中分離的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/125GK1974783SQ20061012410
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者吳暉, 李曉鳳, 余以剛, 劉冬梅, 許喜林 申請人:華南理工大學(xué)