專利名稱：：一種雜交免疫缺陷病毒株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種雜交免疫缺陷病毒，它衍生于人類免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)，它的特征是攜帶中國中部地區(qū)主要流行株HIV-1B’亞型的外膜基因(env)；具有R5嗜性；具有感染靶細(xì)胞及具有體外感染人和中國恒河猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)和復(fù)制的能力。同時還涉及到這種雜交病毒的應(yīng)用，用它感染恒河猴，能建立B’亞型的SHIV/猴模型；研究艾滋病病毒的體內(nèi)感染過程、病原特性、發(fā)病機(jī)理，免疫反應(yīng)等，檢測和篩選艾滋病疫苗、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物和殺微生物劑。
背景技術(shù)：
：人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬，它是引起人類免疫缺陷綜合癥(AIDS)的病原體(Marriott，D.J.E.，etal.，1997.HIVandadvancedimmunedeficiency.ManagingHIV，164，15-16)。HIV有兩種類型，即HIV-1和HIV-2。利用HIV-1的DNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹的方法將HIV-1分為三組，M組、O組和N組。大多數(shù)序列屬于M組，少部分序列為0組，N組的序列非常少。M組進(jìn)一步分為幾種亞型(A、B、C、D、F、G、H、J和K亞型)。中國存在兩個主要HIV-1流行株，一個是重組C亞型，另一個是B’亞型。HIV-1重組C亞型(CRF)07和08(也稱CB’重組HIV-1)主要在中國西南和西北地區(qū)流行，如新疆，四川，云南。CB’重組亞型是中國靜脈吸毒(IDU)人群中的主要致病株(Yu，X.F.，etal.，2002.MaintaininglowHIVtype1envgeneticdiversityamonginjectiondrugusersinfectedwithaB/CrecombinantandCRF01_AEHIVtype1insouthernChina.AIDSResHumRetroviruses，18(2)，167-70)。HIV-1B’亞型主要在中國中部部分地區(qū)流行，如河南省及其周邊省份(湖北，安徽，山西等)。造成HIV-1B’亞型流行的主要因素是有償獻(xiàn)血(PBD)(Wu，Z.，etal.，1995.HIV-1infectionincommercialplasmadonorsinChina，Lancet346，61-62)。從80年代末至90年代中期，河南省存在十分活躍的合法和非法的有償獻(xiàn)血活動。由于沒有對獻(xiàn)血員進(jìn)行HIV篩查并且沒有執(zhí)行正規(guī)的無菌超作，使許多有償獻(xiàn)血(漿)者在獻(xiàn)血過程中感染了HIV-1，導(dǎo)致HIV-1B’在華中地區(qū)廣泛傳播，造成艾滋病在PBDs中爆發(fā)流行。專家保守估計，在中國將近50萬人是由于不規(guī)范的獻(xiàn)血途徑而感染HIV病毒。通過分子流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在華中地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)最早在云南發(fā)現(xiàn)的嵌合式基因型，而且在此地區(qū)流行的HIV-1B’沒有與其它亞型發(fā)生交叉重組。因此，B’似乎是在華中不同地區(qū)的PBDs中唯一的HIV-1基因型，成為在中國中部地區(qū)流行的，具有代表性的毒株(Su，B.，etal.，2003.HIV-1subtypeB′dictatestheAIDSepidemicamongpaidblooddonorsintheHenanandHubeiprovincesofChina.AIDS，17(17)，2515-20；)。為了阻止HIV-1的進(jìn)一步傳播，申請人急需建立一種動物模型進(jìn)行HIV-1的基礎(chǔ)研究和評估各種防治措施。根據(jù)目前的研究，非靈長類動物是建立HIV動物模型最適當(dāng)?shù)倪x擇。引起猴免疫缺陷綜合癥(SAIDS)的病原體是猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiencyVirus，SIV)(Daniel，M.D.，etal.，1985.IsolationofT-celltropicHTLV-III-likeretrovirusfrommacaques.Science，228(4704)，1201-4)。通過分析HIV和SIV核苷酸序列發(fā)現(xiàn)兩者基因組有很高的相似性。HIV-1和SIVcpz(來自大猩猩)的基因組相似，而SIVs與HIV-2相似。除了HIV-1和SIVcpz有vpu而HIV-2和SIVs是vpx的區(qū)別以外，其它的基因組組成是一樣的。(Desrosiers，R.C.，1988.Simianimmunodeficiencyviruses.AnnuRevMicrobiol，42，607-25)。因此研究者利用HIV-1/大猩猩和SIV/恒河猴等靈長類動物模型研究HIV。但是它們也存在明顯的缺點。首先，黑猩猩是唯一能感染HIV-1的非人類的靈長類動物，但感染后的黑猩猩沒有任何疾病癥狀，而且作為即將滅種的種系，其使用是十分有限的。其次，HIV-1外膜基因env決定HIV的生物學(xué)功能，如細(xì)胞嗜性，共受體使用和致細(xì)胞病變等，但env存在高度變異性，而且HIV-1與SIV編碼的外膜糖蛋白截然不同，因此使用SIV/恒河猴模型研究HIV-1是不合適的。為了發(fā)展合適的動物模型，研究者通過突變分析和互補研究發(fā)現(xiàn)HIV-1和SIV的某些基因的功能相似，而且可以互換這些基因。因此，構(gòu)建出猴/人免疫缺陷雜交病毒(SHIV)(Shibata，R.，etal.，1991.Generationofachimerichumanandsimianimmunodeficiencyvirusinfectioustomonkeyperipheralbloodmononuclearcells.JVirol，65(7)，3514-20)。雜交病毒保留相應(yīng)的親本HIV-1env的生物學(xué)特性，因此可以用它們來揭示病毒包膜決定的SHIV的體內(nèi)復(fù)制能力和誘導(dǎo)多種病毒特異性免疫反應(yīng)的差異。SHIV感染猴后建立的SHIV/猴模型可以研究HIV-1的致病機(jī)制和傳播途徑等，評估HIV-1的疫苗和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(Mascola，J.R.，etal.，1999.ProtectionofMacaquesagainstpathogenicsimian/humanimmunodeficiencyvirus89.6PDbypassivetransferofneutralizingantibodies.JVirol，73，4009-18；Veazey，R.S.，etal.，2003.UseofasmallmoleculeCCR5inhibitorinmacaquestotreatsimianimmunodeficiencyvirusinfectionorpreventsimian-humanimmunodeficiencyvirusinfection.JExpMed，198，1551-62)。世界上已經(jīng)有數(shù)種SHIV毒株被構(gòu)建成功，并且評估了它們在非靈長類動物體內(nèi)的致病性。目前現(xiàn)有的SHIV株大多數(shù)利用來自HIV-1B亞型毒株的包膜基因，這些毒株既有來自實驗室構(gòu)建的病毒(HIV-1HXB2，HIV-1NL43)，也有來自原始的毒株(HIV-1162，HIV-133，HIV89.6，HIV-1DH12)(Luciw，P.A.，etal.，1995.PersistentinfectionofrhesusmacaqueswithT-cell-line-tropicandmacrophage-tropicclonesofsimian/humanimmunodeficiencyviruses(SHIV).ProcNatlAcadSciUSA，92(16)，7490-4)。還有少部分SHIV是針對HIV-1其它亞型的，如E亞型(SHIV9466.33，SHIV-E-CAR)，C亞型(SHIVCHN19、SHIV-XJ02170、SHIVMJ4)和F亞型(SHIVcmr304)(Chen，Z.W.，etal.，2000.EnhancedinfectivityofanR5-tropicsimian/humanimmunodeficiencyviruscarryinghumanimmunodeficiencyvirustype1subtypeCenvelopeafterserialpassagesinpig-tailedmacaques(Macacanemestrina).JVirol，74，6501-10)。針對不同亞型和地區(qū)流行的HIV-1毒株構(gòu)建的SHIV在功能和生物學(xué)特性上存在明顯的差異。由于華中地區(qū)的HIV-1流行株B’亞型與傳統(tǒng)歐美B亞型在基因序列上，尤其在高突變的env基因的V3loop區(qū)存在較明顯的差異，而V3loop環(huán)是刺激機(jī)體產(chǎn)生有效中和抗體的一個非常重要的免疫抗原決定簇。因此，B亞型的SHIV/猴模型并不適合B’亞型HIV-1毒株的研究。但到目前為止，世界上還沒有一種SHIV是針對HIV-1B’亞型構(gòu)建的。根據(jù)HIV-1株所利用的輔助受體，可將HIV-1將其分為X4株(利用CXCR4)、R5株(利用CCR5)和X4R5株(利用CXCR4和CCR5)等。X4毒株具有嗜T淋巴細(xì)胞、利用CXCR4輔助受體、快復(fù)制高滴度和合胞體誘導(dǎo)(SI)的特性，R5為嗜巨噬細(xì)胞、利用CCR5輔助受體、慢復(fù)制低滴度和非合胞體誘導(dǎo)(NSI)的特性。R5毒株比X4毒株更易傳播。許多研究發(fā)現(xiàn)，病毒對輔助受體的利用在感染過程期間是不斷變化的，使用不同的共受體可以導(dǎo)致病毒在體內(nèi)產(chǎn)生截然不同的致病結(jié)果。早期感染者體內(nèi)病毒以嗜巨噬細(xì)胞的R5毒株為主，其原因是感染HIV的巨噬細(xì)胞對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)較感染的T細(xì)胞不敏感，嗜巨噬細(xì)胞HIV克隆株能更有效地逃逸CTL的壓力而選擇性地生長(Schutten，M.，etal.，2001.MacrophageTropismofHumanImmunodeficiencyVirusType1FacilitatesInVivoEscapefromCytotoxicT-LymphocytePressure.JVirol，752706-09)。隨著病程的進(jìn)展、宿主細(xì)胞識別HIV-1能力的增強(qiáng)和HIV-1自身為在宿主細(xì)胞內(nèi)播散，病毒才會出現(xiàn)受體利用的轉(zhuǎn)移，如利用CXCR4等其它受體。感染宿主病毒的生物學(xué)特性也會隨著病程的進(jìn)展而改變，在病程早期病毒主要是NSI型，晚期才轉(zhuǎn)變成SI型。所以采取有效措施在早期階段就阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞及在感染早期阻斷病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散，延長病程是防治HIV-1的一個重要環(huán)節(jié)。目前世界上構(gòu)建的SHIV大部分是利用CXCR4受體，感染猴后，可以導(dǎo)致猴在很短的時間內(nèi)發(fā)病，這種動物模型不能很好地模擬HIV-1在人體內(nèi)自然感染狀態(tài)。因而構(gòu)建一種使用CCR5受體的SHIV，建立R5嗜性的，能模擬HIV-1早期感染的SHIV/猴模型對研究病毒早期感染機(jī)制，免疫和致病機(jī)制和篩選抗艾滋病疫苗、藥物以及殺微生物劑是具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雜交免疫缺陷病毒株(SHIV-B’WHU)，CCTCCNOV200510。該病毒的主要優(yōu)點是攜帶HIV-1B’亞型的外膜基因(env)；具有R5嗜性；能感染靶細(xì)胞及具有體外感染人和中國恒河猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)和復(fù)制的能力。一種用于構(gòu)建SHIV-B’WHU病毒的3’端嵌合質(zhì)粒(3’-p02HNSMX2-B’WHU)。本發(fā)明涉及一種雜交免疫缺陷病毒株，其特征在于使用3’端嵌合質(zhì)粒/3’-p02HNSMX2-B’WHU(含有質(zhì)粒的菌株是EscherichiacoliDH5α/3’-p02HNSMX2-B’WHU，CCTCCNOM205070)，構(gòu)建SHIV-B’WHU病毒。該質(zhì)粒的主要優(yōu)點是包含HIV-1B’tat/rev/vpu/env基因，能與5’端質(zhì)粒pVP-1共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中構(gòu)建出雜交病毒株SHIV-B’WHU。本發(fā)明還涉及一種雜交免疫缺陷病毒株(SHIV-B’WHU)在建立SHIV/猴模型中的應(yīng)用。一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測艾滋病的疫苗中的應(yīng)用。一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物中的應(yīng)用。一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測殺微生物劑中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是利用基因重組技術(shù)(分子生物學(xué)，第二版，科學(xué)出版社)。即在致病性的SIVmac239基因框架上將HIV-1B’的部分基因片斷(tat，rev，vpu和env)取代SIVmac239相應(yīng)基因而構(gòu)建的一種雜交病毒株。本發(fā)明提供的一種新的，B’亞型，R5嗜性SHIV，其HIV-1env基因是來自于一位河南HIV感染者體內(nèi)分離到早期的HIV-102HNsmx2毒株[基因序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(NaionalCenterForBiotechnologyInformation，NCBI)的HIV基因庫http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]。首先通過序列分析證明該毒株是HIV-1B’亞型，并且其tat/rev/vpu/env基因的開放閱讀框是完整的。將tat/rev/vpu/env基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX1(Invitrogen)上，而后轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過細(xì)胞融合實驗分析，證明病毒株為R5嗜性。本發(fā)明構(gòu)建的3’端嵌合質(zhì)粒(3’-p02HNSMX2-B’WHU)，是將HIV-102HNsmx2毒株的tat/rev/vpu/env基因克隆到一個3’端載體(Chen，Z.，etal.，2000.EnhancedInfectivityofanR5-TropicSimian/HumanImmunodeficiencyVirusCarryingHumanImmunodeficiencyVirusType1SubtypeCEnvelopeafterSerialPassagesinPig-TailedMacaques(Macacanemestrina).JVirol，746501-6510)上構(gòu)建而成。即使用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NestPCR)擴(kuò)增HIV-102HNsmx2tat/rev/vpu/env基因片斷，使用相同的限制性酶(MBI)酶切tat/rev/vpu/env基因片斷和3’端載體后，使用連接酶(Promega)連接。3’-p02HNSMX2-B’WHU包含了HIV-1B’的tat/rev/vpu/env和SIVmac239的3’端基因(nef和LTR)，從SphI限制性酶切位點開始一直到3’LTR(圖1)。該質(zhì)粒與5’端質(zhì)粒pVP-1(Luciw，P.A.，etal.，1995.PersistentinfectionofrhesusmacaqueswithT-cell-line-tropicandmacrophage-tropicclonesofsimian/humanimmunodeficiencyviruses(SHIV).ProcNatlAcadSciUSA，92(16)7490-4.)共轉(zhuǎn)然到細(xì)胞后可以產(chǎn)生B’亞型的SHIV病毒。質(zhì)粒pVP-1是在載體pGEM7(Promega)上攜帶SIV的5’端的LTR，gag，pol，vif，vpx，vpr，并在vpr末端有SphI的限制性酶切位點(圖1)。利用共轉(zhuǎn)染技術(shù)(分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社)獲得重組病毒。將線性3’-p02HNSMX2-B’WHU與pVP-1共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48小時后將細(xì)胞上清液感染PBMC，培養(yǎng)細(xì)胞收集病毒上清，獲得重組病毒SHIV-B’WHU。SHIV-B’WHU的基因組中包含SIV的3’LTR/gag/pol/vif/vpr/vpx和nef/5’LTR，HIV-1B’的tat/rev/vpu/env(圖1)。通過SHIV-B’WHU體外感染攜帶不同共受體的細(xì)胞，鑒定重組病毒的生物學(xué)特性，證明該病毒具有R5嗜性。通過在人和中國恒河猴PBMC細(xì)胞中培養(yǎng)獲得高滴度的重組病毒，證明病毒具有體外感染和復(fù)制能力?？傊景l(fā)明的內(nèi)容是針對華中地區(qū)的主要流行株HIV-1B’亞型，構(gòu)建了一個新的，R5嗜性的雜交病毒株(SHIV-B’WHU)，通過感染各種靶細(xì)胞證明SHIV-B’WHU具有R5嗜性的生物學(xué)特性，并能在人和中國恒河猴PBMC中高效復(fù)制。本發(fā)明的目的是SHIV-B’WHU在建立猴AIDS動物模型中的應(yīng)用。根據(jù)體外實驗結(jié)果，本發(fā)明的SHIV-B’WHU體內(nèi)感染恒河猴，病毒通過體內(nèi)系列傳代，增強(qiáng)病毒的毒力，建立SHIV/猴模型。這一模型的優(yōu)點是針對中國中部地區(qū)主要流行株HIV-1B’亞型的動物模型；由于病毒是R5嗜性，因此建立的模型能更好地模擬HIV-1自然早期感染狀態(tài)，該模型能應(yīng)用于研究HIV-1B’的傳播途徑，致病機(jī)制，猴體內(nèi)病毒動力學(xué)和HIV-1env介導(dǎo)的免疫機(jī)制以及檢測和篩選艾滋病疫苗、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、殺微生物劑。已將獲得的新的SHIV已保藏，保藏單位中國典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年7月11日，保藏編號V200510，分類命名人猴免疫缺陷病毒SHIV-B’WHU。包含3’端嵌合質(zhì)粒的菌株也已保藏，保藏單位中國典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年7月11日，保藏編號M205070，分類命名EscherichiacoliDH5α/3’-p02HNSMX2-B’WHU。本發(fā)明的SHIV-B’WHU具有如下特性和優(yōu)點，具體描述如下1.攜帶具有代表性的B’亞型HIV-1外膜基因(env)病毒外膜可以決定病毒的基因型，嗜性和表型。從一名因有償獻(xiàn)血感染HIV的河南病人體內(nèi)分離病毒后，分析其病毒的外膜。病人編號為02HNsmx2，從其體內(nèi)分離的病毒編號為HIV-102HNsmx2(基因序列在NCBI的HIV基因庫http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。首先對HIV-102HNsmx2的env基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析以確定用于構(gòu)建SHIV的HIV-1的基因型。通過鄰近連接方法對HIV-1的env基因序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇用于SHIV構(gòu)建的HIV-102HNsmx2毒株在B亞型簇內(nèi)，它與來自河南的其它HIV-1毒株，02HNsc11，02HNsq4，B’CNH24和B’CN.LTG0218(從NCBI中的GenBank中獲得)十分緊密地聚在一簇，與來自中國云南的B’亞型的HIV-1毒株YN.RL42(B’YN.RL42)(從NCBI中的GenBank中獲得)具有高度相似。這說明HIV-102HNsmx2毒株是B’亞型，而且在河南和云南省流行的B’亞型HIV-1毒株是相關(guān)聯(lián)的(圖3)。通過基因重組分析整個tat/rev/vpu/env基因序列以便能排除B’HIV-102HNsmx2與其它HIV-1基因型(包括目前在中國流行的HIV-1C/B’重組亞型)發(fā)生內(nèi)部亞型重組的可能。發(fā)現(xiàn)B’HIV-102HNsmx2僅僅與在中國分離的07-BC.CN.97.C54(從NCBI中的GenBank中獲得)毒株在env基因的5’端有交叉(圖4)，這主要是因為07-BC.CN.97.C54為B’亞型和C亞型的重組病毒，其env的5’末端是B’，因此兩者出現(xiàn)交叉。這些結(jié)果證明B’亞型HIV-102HNsmx2沒有與其它亞型的病毒發(fā)生交叉和重組，它是一個典型的，能代表華中地區(qū)的主要病毒基因型。通過分析B’HIV-102HNsmx2env和其它地區(qū)HIV-1流行株的遺傳距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIV-102HNsmx2與來自云南的B’YN.RL42遺傳距離非常接近，與泰國和馬來西亞的B’亞型遺傳距離也非常小，而與傳統(tǒng)的B亞型毒株如美國的B亞型之間有較遠(yuǎn)的遺傳距離(表1)。這提示在河南省流行的B’亞型HIV-1是在中國發(fā)現(xiàn)的原型毒株，并且能成為東南亞的代表性B’亞型病毒。表1.HIV-102HNsmx2與其它HIV-1的遺傳距離分析以上結(jié)果證明HIV-102HNsmx2毒株可以被認(rèn)為是在中國發(fā)現(xiàn)的一個非常典型的原型毒株，它能成為東南亞的代表性B’病毒。因此使用這種極具有代表性的毒株構(gòu)建B’亞型SHIV。2.具有R5嗜性和感染靶細(xì)胞的能力通過細(xì)胞融合形成實驗分析HIV-102HNsmx2的env基因是否能表達(dá)功能性蛋白及其利用哪一種共受體。將沒有經(jīng)過任何體外修改的病毒tat/rev/vpu/env基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)構(gòu)建重組質(zhì)粒p2’ENV-VAX，將其轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC，編號GDC187)。24小時后293T細(xì)胞分別與表達(dá)CCR5共受體的GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，編號3944)和表達(dá)CXCR4共受體的GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，編號3685)共培養(yǎng)，12-24小時后觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞能與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞融合，產(chǎn)生巨大的合胞體(圖5A，B)，但與GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞沒有形成任何細(xì)胞融合(圖5C，D)。這證明用于構(gòu)建SHIV的HIV-102HNsmx2env使用的共受體是CCR5，并且具有調(diào)節(jié)R5/CD4-細(xì)胞融合的功能。為了產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒，質(zhì)粒5’-PVP-1(Luciw，P.A.，etal.，1995.PersistentinfectionofrhesusmacaqueswithT-cell-line-tropicandmacrophage-tropicclonesofsimian/humanimmunodeficiencyviruses(SHIV).ProcNatlAcadSciUSA，92(16)7490-4.)和構(gòu)建的嵌合質(zhì)粒3’-p02HNsmx2-B’WHU經(jīng)限制性酶SphI(MBIFermentas)酶切成線形，兩個線性質(zhì)粒通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞分別與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞和GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞共培養(yǎng)48小時。轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞之間能形成巨大的細(xì)胞融合(圖6A，C)，融合的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的綠色熒光(圖6B，D)。而293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞之間沒有出現(xiàn)任何細(xì)胞融合及綠色熒光(圖6E，F(xiàn))。結(jié)果證明線形的5’-PVP-1和3’-p02HNsmx2共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后構(gòu)建出一種SHIV病毒，該病毒能有效地將HIV-1外膜蛋白表達(dá)到細(xì)胞表面，并表現(xiàn)出R5嗜性。為了確定新構(gòu)建的SHIV-B’WHU是否具有感染性和復(fù)制能力，將轉(zhuǎn)染后得到的病毒上清液分別感染GHOS.CD4.Hu-CCR5和GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞中出現(xiàn)合胞體(圖7A，C)，并且合胞體產(chǎn)生綠色熒光(圖7B，D)，而在GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)合胞體和綠色熒光(圖7E，F(xiàn))。系列兩倍稀釋的SHIV-B’WHU上清液感染TZM-b1細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，編號8129)48小時后，使用熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測感染病毒的細(xì)胞的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)顯示SHIV-B’WHU能感染TZM-b1細(xì)胞，表達(dá)功能性Tat蛋白激活熒光素酶報告基因的表達(dá)，并且感染細(xì)胞的病毒量與細(xì)胞產(chǎn)生的熒光素酶活性成正比，而沒感染病毒的細(xì)胞，其熒光素酶活性很差(圖8)。結(jié)果證明SHIV-B’WHU利用的輔助受體是CCR5及具有感染靶細(xì)胞的能力。以上結(jié)果證明SHIV-B’WHU與親本HIV-1毒株02HNsmx2具有相似的生物學(xué)特性，即使用的同樣的輔助受體CCR5，即R5嗜性的毒株。而且SHIV-B’WHU具有體外感染靶細(xì)胞的能力。3.具有在人PBMC中有效復(fù)制的能力線形質(zhì)粒5’-PVP-1和3’-p02HNSMX2-B’WHU共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，48小時后，將植物血凝素(PHA-P，Sigma)刺激三天的健康人PBMC與轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞共培養(yǎng)。24小時后收集PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS0.02M磷酸鹽，0.05MNaCl，PH7.4)洗滌兩次后，加入PBMC生長培養(yǎng)基(GIBCOTMRPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)，10％胎牛血清(Invitrogen)，20U/ml白細(xì)胞介素-2(hIL-2，Roche)和1％氨芐青霉素和硫酸鏈霉素(Amersco))培養(yǎng)細(xì)胞，每7天收集病毒上清液，監(jiān)測病毒p27抗原產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHIV-B’WHU在人PBMC中復(fù)制產(chǎn)生較高滴度的病毒，在感染第14天病毒p27產(chǎn)量達(dá)16ng/ml。陰性對照中均沒有監(jiān)測到p27抗原。陰性對照是沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞與人PBMC共培養(yǎng)(圖9A)。將以上感染病毒的PBMC與2×106的健康人PBMC(PHA-P刺激三天)共培養(yǎng)，每3～4天收集病毒上清液，監(jiān)測病毒p27抗原產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞共培養(yǎng)的方式可以使病毒的產(chǎn)量明顯增高，在共培養(yǎng)第17天，病毒產(chǎn)量已達(dá)到79ng/ml，并且仍在增長。陰性對照中均沒有監(jiān)測到p27抗原。陰性對照是沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞與人PBMC共培養(yǎng)(圖9B)。以上結(jié)果證明，SHIV-B’WHU具有體外感染人PBMC并高效復(fù)制的能力。4.具有在中國恒河猴PBMC中有效復(fù)制的能力轉(zhuǎn)染后獲得的病毒上清液感染2×106PHA-P刺激三天的中國恒河猴PBMC(猴子編號990011和00031)，每3～4天收集病毒上清液，監(jiān)測病毒p27抗原產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHIV-B’WHU病毒上清液能感染中國恒河猴的PBMC，并獲得一定滴度的病毒(圖10)。而在對照組(沒有感染病毒上清液的恒河猴PBMC)中沒有檢測到病毒的p27抗原。以上結(jié)果證明，SHIV-B’WHU具有體外感染中國恒河猴PBMC并高效復(fù)制的能力。通過分子水平進(jìn)一步分析鑒定SHV-B’WHU為活病毒，即分析前病毒和病毒在細(xì)胞中合成總mRNA的其中一部分。通過擴(kuò)增感染病毒的細(xì)胞基因組中前病毒env基因片段，測序結(jié)果證明，SHIV-B’WHU能將自己的病毒基因整合到PBMC中形成前病毒。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄感染病毒細(xì)胞中的總mRNA，而后用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NestPCR)擴(kuò)增拼接的Rev序列，測序結(jié)果證明SHIV-B’WHU感染PBMC后產(chǎn)生的Rev與親本毒株02HNsmx2上的Rev序列是完全一致的。這說明SHIV-B’WHU是一個具有逆轉(zhuǎn)錄，整合活性的活病毒。本文中所用的術(shù)語“載體”，是指運載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。根據(jù)載體用途，可將載體分為克隆載體和表達(dá)載體。前者是克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖，使克隆的DNA片段在數(shù)量上大大擴(kuò)增。后者是將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。常用的載體包括質(zhì)粒，噬菌體，病毒等，但最常見的首選質(zhì)粒。本文中所用的術(shù)語“質(zhì)粒”，是多數(shù)細(xì)胞和某些真核生物細(xì)胞的染色體以外的，能自主增殖的一類遺傳因子，為閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1kb直到200kb以上。本文中所用的術(shù)語“雜交病毒”，是指病毒基因組中含有多于兩種不同來源的核酸序列，即通過基因工程人為拼接來源于不同的病毒基因序列而成為一種DNA雜交體，這種雜交DNA產(chǎn)生的病毒就是一種雜交病毒。本文中所用的術(shù)語“細(xì)胞受體”，HIV-1感染需要病毒與靶細(xì)胞表面受體的相互作用，這種受體被稱為CD4分子，它主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面，其它有CD4受體的細(xì)胞也是HIV-1的靶細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、星狀細(xì)胞。但單純CD4受體對病毒進(jìn)入細(xì)胞既是不充分的，也不是唯一途徑，病毒還需要第二個受體，即輔助受體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了10余種HIV-1的輔助受體，其中最主要的是CCR-5和CXCR-4(表2)。本文中所用的術(shù)語“細(xì)胞嗜性”，不同來源的病毒感染不同類型細(xì)胞的能力是不相同的。根據(jù)HIV-1感染不同的細(xì)胞系，可以將其分為嗜T細(xì)胞病毒株和嗜巨噬細(xì)胞病毒株兩大類。嗜T細(xì)胞病毒株也稱X4毒株，利用CXCR4輔助受體，具有嗜T淋巴細(xì)胞、快復(fù)制高滴度、合胞體誘導(dǎo)(SI)特性。嗜巨噬細(xì)胞病毒株也稱R5毒株，利用CCR5輔助受體，具有嗜巨噬細(xì)胞、慢復(fù)制低滴度、非合胞體誘導(dǎo)(NSI)的特性。雙嗜性HIV-1毒株，是具有巨噬細(xì)胞性又具有T細(xì)胞嗜性，能夠使用兩個輔助受體的任何一個的毒株(表2)。研究發(fā)現(xiàn)嗜巨噬細(xì)胞毒株比嗜T淋巴細(xì)胞毒株更易傳播，它是早期感染者體內(nèi)的主要病毒株，在性傳播的HIV-1中約有90％以上都是R5毒株。但是，嗜T細(xì)胞病毒株的HIV-1一旦在體內(nèi)繁殖，其毒力特別強(qiáng)，并可促使病程加快。本文中所用的術(shù)語“表型”，是病毒具有感染性的重要因素。HIV-1毒株根據(jù)其是否具有合胞體誘導(dǎo)(SyncytiumInducing)可分為合胞體誘導(dǎo)株(SI株)和非合胞體誘導(dǎo)株(NSI株)(表2)。通常嗜T細(xì)胞病毒株是SI株，而嗜巨噬細(xì)胞病毒株一般為NSI株。兩種毒株在機(jī)體的復(fù)制能力是不一致的，一般SI株復(fù)制迅速，而NSI株復(fù)制緩慢。表2.HIV感染CD4+淋巴細(xì)胞的輔助受體本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點本SHIV毒株是針對中國中部地區(qū)的主要流行株HIV-1B’亞型構(gòu)建而成的，因此攜帶具有代表性的B’亞型HIV-1的外膜基因(env)，使用該毒株研究HIV-1B’亞型毒株更具有特異性。本SHIV毒株具有R5嗜性，與早期HIV-1病毒具有相同的生物學(xué)特性，因此使用該毒株模擬早期病毒，在分子水平上研究早期病毒的感染機(jī)制和傳播途徑。本SHIV毒株能感染各種靶細(xì)胞，尤其是具有體外感染人和中國恒河猴PBMC，并具有高效復(fù)制的能力。因此該毒株可用于建立一個B’亞型，R5嗜性的SHIV/猴模型，該模型可應(yīng)用于研究HIV-1傳播途徑，致病機(jī)制，猴體內(nèi)病毒動力學(xué)和HIV-1env介導(dǎo)的免疫機(jī)制，檢測和篩選艾滋病疫苗、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、殺微生物劑?？傊景l(fā)明的SHIV-B’WHU具有下述特性和優(yōu)點1)攜帶具有代表性的B’亞型HIV-1外膜基因(env)；2)具有R5嗜性；3)具有感染靶細(xì)胞的能力；4)具有體外感染人PBMC和高效復(fù)制的能力；5)具有體外感染中國恒河猴PBMC和高效復(fù)制的能力。圖1SHIV-B’WHU基因結(jié)構(gòu)示意圖。SHIV-B’WHU的基因結(jié)構(gòu)是在SIVmac239的基因組框架上，以HIV-102HNsmx2的部分基因片斷取代SIVmac239的相應(yīng)基因。圖2pVP-1基因結(jié)構(gòu)示意圖。質(zhì)粒pVP-1是在載體pGEM7(Promega)上攜帶SIV的5’端的LTR，gag，pol，vif，vpx，vpr，并在vpr末端有SphI的限制性酶切位點。圖3系統(tǒng)進(jìn)化分析HIV-102HNsmx2的tat/rev/vpu/env基因(▲)。HIV-102HNsmx2的tat/rev/vpu/env基因與從NCBI的GenBank中獲得參考序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)02HNsmx2毒株與來自河南的其它HIV-1毒株(02HNsc11，02HNsq4，B’CNH24和B’CN.LTG0218)十分緊密地聚在一簇，與來自中國云南的B’亞型HIV-1毒株YN.RL42(B’YN.RL42)具有高度相似性，證明HIV-102HNsmx2毒株是B’亞型。圖4HIV-102HNsmx2(tat/rev/vpu/env)內(nèi)部亞型重組分析。B’亞型HIV-102HNsmx2沒有與其它亞型的病毒株發(fā)生交叉和重組，僅與B’亞型和C亞型的重組病毒株07-BC.CN.97.C54(env5’末端為B’)在env基因5’端有交叉。圖5細(xì)胞融合實驗分析HIV-102HNsmx2env的功能。重組質(zhì)粒p2’ENV-VAX轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后，293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞融合，產(chǎn)生巨大的合胞體(A，B)，而沒有與GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞形成任何細(xì)胞融合(C，D)。圖6細(xì)胞融合試驗和綠色熒光檢測結(jié)果。共轉(zhuǎn)染線性質(zhì)粒5’-PVP-1和3’-p02HNsmx2-B’WHU的293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞共培養(yǎng)后，形成巨大的細(xì)胞融合(A，C)，并產(chǎn)生明顯的綠色熒光(B，D)，而轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞之間沒有出現(xiàn)任何細(xì)胞融合及綠色熒光(E，F(xiàn))。圖7SHIV-B’WHU感染GHOST.CD4細(xì)胞的實驗結(jié)果。SHIV-B’WHU病毒上清液分別感染GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞出現(xiàn)合胞體(A，C)，并產(chǎn)生綠色熒光(B，D)，而GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞沒有合胞體和綠色熒光的產(chǎn)生(E，F(xiàn))。圖8兩倍稀釋的SHIV-B’WHU感染TZM-b1細(xì)胞的實驗結(jié)果。系列兩倍稀釋的SHIV-B’WHU病毒上清液感染TZM-b1細(xì)胞48小時后，感染SHIV-B’WHU的TZM-b1細(xì)胞表達(dá)功能性Tat蛋白激活熒光素酶報告基因的表達(dá)，而且感染細(xì)胞的病毒量與細(xì)胞產(chǎn)生的熒光素酶活性成正比，而沒感染病毒的細(xì)胞熒光素酶活性很低。圖9SHIV-B’WHU在人PBMC中的復(fù)制能力。A共轉(zhuǎn)染線形質(zhì)粒5’-PVP-1和3’-p02HNSMX2-B’WHU的293T細(xì)胞與健康人PBMC共培養(yǎng)24小時，收集和培養(yǎng)PBMC，并監(jiān)測病毒p27抗原產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)SHIV-B’WHU在人PBMC中復(fù)制并產(chǎn)生較高病毒滴度。B感染SHIV-B’WHU的人PBMC與健康人PBMC(2×106)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的方式可以使病毒的產(chǎn)量明顯增高，共培養(yǎng)第17天，病毒產(chǎn)量達(dá)到79ug/ml，并且仍在增長。陰性對照均沒有監(jiān)測到p27抗原圖10SHIV-B’WHU在中國恒河猴PBMC中的復(fù)制能力。SHIV-B’WHU病毒上清液分別感染2×106中國恒河猴PBMC(990011和00031)，每3～4天收集病毒上清液監(jiān)測病毒p27抗原產(chǎn)量，SHIV-B’WHU能感染中國恒河猴PBMC，并獲得一定的病毒滴度，陰性對照均沒有監(jiān)測到p27抗原。圖11SHIV-BWHU在中國恒河猴體內(nèi)系列傳代的病毒載量。SHIV-B’WHU病毒在4只中國恒河猴(編號為P10002，P20296，P31032，P41050)體內(nèi)系列傳代，分別在感染后第0，3，7，12，14天取血監(jiān)測病毒載量，發(fā)現(xiàn)病毒載量隨感染時間而增高，并且傳代提高病毒在中國恒河猴的初始病毒血癥。圖12感染SHIV-B’WHU的中國恒河猴的淋巴結(jié)，肝臟，脾臟和肺臟的病理組織變化。4只感染病毒的中國恒河猴的常規(guī)病理切片在鏡下觀察都有肺組織間隔增寬，類似間質(zhì)性肺炎的病理改變；肝、脾、淋巴結(jié)組織可見單核吞噬細(xì)胞的免疫性增生。具體實施例方式以下是描述的是如何構(gòu)建雜交病毒株SHIV-B’WHU的具體方案。實施例1針對華中地區(qū)的主要流行株HIV-1B’亞型構(gòu)建SHIV，SHIV-B’WHU應(yīng)攜帶具有代表性的B’亞型HIV-1的外膜基因(env)。為了了解選擇用于SHIV構(gòu)建的HIV-1是B’亞型毒株，從一位河南HIV感染者體內(nèi)分離到早期的HIV-102HNsmx2，通過PCR從細(xì)胞基因組中擴(kuò)增HIV-102HNsmx2的tat/rev/vpu/env基因序列，對其測序。在分子水平上分析HIV-102HNsmx2的tat/rev/vpu/env的基因型以及它與其它HIV-1毒株的區(qū)別。HIV-1感染者和健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)1.獲得HIV-1感染者(02HNsmx2)和健康人全血(肝素抗凝)，對已經(jīng)脫離人體或生物體的組織、體液或排泄物進(jìn)行處理或檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息，將全血與磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶1的體積比混合。2.在50ml離心管中加入20ml淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物技術(shù)有限公司)，將稀釋的血液沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液面上，2000rpm/400g，離心20分鐘。離心后管內(nèi)分三層上層為血漿和PBS，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中間層為淋巴細(xì)胞，呈白色云霧層狹窄帶。3.吸取云霧層單核細(xì)胞，置入50ml離心管，加入5倍以上PBS，1500rpm/400g離心10分鐘，重復(fù)三次。棄上清，加入20mlPBMC生長培養(yǎng)基(GIBCOTMRPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)，10％胎牛血清(Invitrogen)，20U/ml白細(xì)胞介素-2(hIL-2，Roche)和重懸細(xì)胞。4.使用0.4％胎盤蘭(TrypanBlue，Sigma)計數(shù)活細(xì)胞，即10ul細(xì)胞懸液加入90ul0.4％胎盤蘭染液混合，取10ul混合液于血球計數(shù)板上，計4個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞濃度＝4格細(xì)胞數(shù)/4×105。5.2×106-8×107/mlPBMC接入75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加40-120ml刺激培養(yǎng)基(GIBCOTMRPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)，10％胎牛血清(Invitrogen)，10ug/ml植物血凝素(PHA-p，Sigma)，20U/ml白細(xì)胞介素-2(hIL-2，Roche)和1％氨芐青霉素和硫酸鏈霉素(Amersco)，37℃，5％CO2培養(yǎng)2-3天，刺激PBMC增殖。HIV-1感染者和健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)及細(xì)胞基因組提取1.經(jīng)過PHA-P(Sigma)刺激三天的健康人PBMC與相同數(shù)目的HIV-1感染者的PBMC(1×106)共同培養(yǎng)14天。分別在培養(yǎng)的第3、7、10天取出一半上清液分裝凍存至-70℃，補充等量的新鮮生長培養(yǎng)基(GIBCOTMRPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)，10％胎牛血清(Invitrogen)，20U/ml白細(xì)胞介素-2(hIL-2，Roche)。第14天收集所有的上清液和細(xì)胞，-70℃凍存。2.使用細(xì)胞和組織DNA提取試劑盒(GenomicPrepCellsandtheTissueDNAIsolationKit，Gentra)提取PBMC的基因組DNA。即在共培養(yǎng)14天的PBMC中加入600ul的細(xì)胞裂解液(CellLysisSolution)，室溫(15-25℃)放置直到溶液變透明，再加入200ul蛋白質(zhì)沉淀液(ProteinPrecipitationSolution)，劇烈震蕩20秒，13000rpm離心3分鐘，取1.5ml上清液并加入600ul異丙醇，輕柔顛倒50次，13000rpm離心1分鐘，去上清，置室溫15分鐘晾干，加入100ul無菌水溶解DNA，4℃冰箱保存。巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NestPCR)擴(kuò)增HIV-1tat/rev/vpu/env基因片斷1.引物的設(shè)計第一輪引物4795F1(5’-GTTTTTCAGAATCTGCTATAAGAAATGCC-3’)和BUR5(5’-GACGGGCACACACTACTTGAAGCACTCAAGG-3’)。第二輪引物VprA(5’-TGCCGAATTCGCATGCTATAGATAGAGGAGAGCAAGAAATGGAG-3’)和EnvB(5’-TGCCCTCGAGCTTATAGTAAAGCCCTTTCGAGG-3’)。引物VprA和EnvB引入酶切位點EcoRI(GAATTC)、SphI(GCATGC)和XhoI(CTCGAG)以及終止子(TAG)2.反應(yīng)體系和反應(yīng)條件第一輪的反應(yīng)體系為總體積50ul中含10×緩沖液(buffer，含NH4SO4)5.0ul，二甲基亞砜(DMSO)1.0ul，穩(wěn)定液(StableSolution)1.0ul，25mMdNTP(Promega)1.0ul，引物4795F1(20pmol/ul)1.0ul，引物BUR5(20pmol/ul)1.0ul，H2O34ul，1.0ulEXLDNA聚合酶(Stratagene)，病毒基因組DNA5.0ul。第一輪的PCR反應(yīng)條件為92℃5min，1個循環(huán)；92℃20sec，45℃45sec，68℃9min，10個循環(huán)；92℃20sec，50℃45sec，68℃10min，25個循環(huán)，68℃15min。第二輪的反應(yīng)體系為總體積50ul中含10×緩沖液(buffer，含NH4SO4)5.0ul，25mM氯化鎂(MgCl2)4.5ul，25mMdNTP(Promega)1.0ul，引物VprA(20pmol/ul)1.0ul，引物EnvB(20pmol/ul)1.0ul，H2O33ul，1u/ulTaq酶(MBIFermentas)3.5ul，第一輪PCR產(chǎn)物1.0ul。第二輪的反應(yīng)條件為92℃2min，1個循環(huán)；92℃20sec，50℃45sec，72℃4min，35個循環(huán)；72℃15min?？寺IV-102HNsmx2的tat/rev/vpu/env基因片斷到表達(dá)載體中構(gòu)建能在真核系統(tǒng)中表達(dá)蛋白的質(zhì)粒1.用限制性酶EcoRI(MBIFermentas)和XhoI(MBIFermentas)酶切PCR的擴(kuò)增基因片斷HIV-1tat/rev/vpu/env和表達(dá)載體pVAX-1/kana(Invitrogen)。pVAX-1/kana是一個大小為3Kb的DNA質(zhì)粒，含有CMV啟動子和卡那霉素抗性基因的真核表達(dá)載體。回收酶切后的HIV-1基因片斷和載體，而后對載體pVAX-1/kana去磷酸化，并回收。2.將上訴HIV-1基因片斷和載體pVAX-1/kana按3∶1的摩爾濃度比混合，加入T4DNA連接酶(Promega)和連接緩沖液，使反應(yīng)終體積為10μl，16℃連接過夜。3.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(分子克隆，第三版)。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布至LB/Kana+平板上(10g/L用于細(xì)菌培養(yǎng)的胰化蛋白胨，5g/L用于細(xì)菌培養(yǎng)的酵母提取物，10g/LNaCl，調(diào)pH值至7.0，高壓蒸汽滅菌。卡那霉素(Kana+)分別溶于無菌水中，加入Kana+使終濃度為50μg/ml)。37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至5mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)(加入Kana+)，37℃，220rpm，16小時。4.從每個菌液中提取質(zhì)粒，使用限制性酶EcoRI和XhoI酶切鑒定，酶切后的外源基因和載體pVAX-1的大小均是3Kb，挑選正確的克隆，用30％的甘油保藏克隆的菌種(用于保存的細(xì)菌)，提取質(zhì)粒p2’ENV-VAX的質(zhì)粒置于-20℃保存。分析HIV-1tat/rev/vpu/env基因的序列1.對質(zhì)粒p2’ENV-VAX的HIV-1tat/rev/vpu/env基因測序，對所有測序結(jié)果比對后拼接成一個完整的tat/rev/vpu/env基因(從ATG到TAA)，隨后通過分子進(jìn)化遺傳分析軟件(Mega)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹和遺傳距離分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株在B亞型簇內(nèi)，并與B’亞型HIV-1毒株YN.RL42，B’CNHN24和B’CN.LTG0218(從美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterForBiotechnologyInformation，NCBI)中的GenBank中獲得)十分緊密地聚在一起，這證明選擇用于SHIV構(gòu)建的HIV-1是B’亞型(圖3和5)。2.進(jìn)一步通過BootScan分析HIV-102HNsmx2的整個tat/rev/vpu/env基因序列，以排除它與在中國流行的其它HIV-1基因型發(fā)生內(nèi)部亞型重組的可能，這包括目前在中國流行的HIV-1C/B’重組亞型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B’亞型HIV-102HNsmx2沒有與其它亞型的病毒發(fā)生交叉和重組(圖4)。以上結(jié)果證明HIV-102HNsmx2毒株(基因序列在NCBI的HIV基因庫http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以被認(rèn)為是在中國發(fā)現(xiàn)的一個非常典型的原型毒株，它能成為東南亞的代表性HIV-1B’病毒。因此申請人使用這種極具有代表性的毒株構(gòu)建B’亞型SHIV。實施例2HIV-102HNsmx2tat/rev/vpu/env閱讀框的完整性和R5嗜性的基因表型。為了證明HIV-102HNsmx2tat/rev/vpu/env的每個基因的開放閱讀框是完整的，具有體內(nèi)外表達(dá)蛋白的能力，對其基因序列進(jìn)行分析，排除沒有完整閱讀框的可能。需要構(gòu)建一個R5嗜性的SHIV，因此在構(gòu)建SHIV之前必須證明HIV-102HNsmx2env的表型為R5嗜性。分析HIV-102HNsmx2tat/rev/vpu/env基因閱讀框使用ClustalX1.81程序?qū)IV-102HNsmx2的整個tat/rev/vpu/env基因序列與標(biāo)準(zhǔn)株HIV-1HXB2相應(yīng)序列進(jìn)行比對，比對后的序列提交到HIVDatabases網(wǎng)站上(www.hiv-web.lanl.gov/content/index)。點擊Tool的GeneCutter后，網(wǎng)站分別對tat、rev、vpu和env基因的開放閱讀框進(jìn)行分析。結(jié)果證明每個基因的開放閱讀框均是完整的。細(xì)胞融合實驗分析HIV-1的表型1.使用Qiagen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p2’ENV-VAX轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞(具體方法見轉(zhuǎn)染試劑盒說明書)。293T細(xì)胞(CCTCC，編號GDC187)是由293細(xì)胞派生，表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點與啟動子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。2.24小時后，轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞(2×104)被混合到預(yù)先用同等數(shù)目的GHOS.CD4細(xì)胞共培養(yǎng)。GHOST.CD4細(xì)胞系(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)由HOS細(xì)胞派生，能在HIV-2長末端重復(fù)序列(LTR)誘導(dǎo)下穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(hGFP)可作為HIV-1/2，SIV感染的指示細(xì)胞。當(dāng)HIV感染細(xì)胞后，表達(dá)的功能性Tat蛋白激活細(xì)胞中的HIV-LTR，從而介導(dǎo)hGFP基因表達(dá)綠色熒光蛋白產(chǎn)生綠色熒光。分別轉(zhuǎn)入CCR5基因和CXCR4基因(能表達(dá)CCR5受體和CXCR4受體的基因)到GHOST.CD4細(xì)胞構(gòu)建成GHOST.CD4.CCR5細(xì)胞和GHOST.CD4.CXCR4細(xì)胞，它們分別穩(wěn)定表達(dá)CCR5和CXCR4受體表達(dá)到細(xì)胞表面。GHOST.CD4.CCR5/CXCR4細(xì)胞培養(yǎng)基GIBCOTMDMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，10％胎牛血清(FetalBovineSerum，Invitrogen)，500μg/mlG418(Invitrogen)，100μg/ml潮霉素B(hygromycinBTM，InvivoGen)，1μg/ml嘌呤霉素(Puromycin，InvivoGen)和1％氨芐青霉素和硫酸鏈霉素(Amersco)。轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞分別于表達(dá)CCR5共受體的GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞和表達(dá)CXCR4共受體的GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞混合。12-24小時后，用相差顯微鏡對培養(yǎng)物拍照觀察細(xì)胞合胞體形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)然的293T細(xì)胞與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞融合，形成較大的合胞體。因此HIV-102HNsmx2env使用的共受體是CCR5，并且具有最大調(diào)節(jié)R5/CD4-細(xì)胞融合的功能。實施例3構(gòu)建雜交病毒株SHIV-B’WHU。為了獲得雜交病毒株SHIV-B’WHU，申請人首先克隆攜帶HIV-1B’tat/rev/vpu/env基因的3’端載體，該載體與5’端質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中構(gòu)建雜交病毒。構(gòu)建3’嵌合載體(3’-p02HNSMX2-B’WHU)1.用限制性酶SphI和XhoI將HIV-1tat/rev/vpu/env基因片斷從p2’ENV-VAX上酶切下來，使用膠回收試劑盒回收外源HIV-1tat/rev/vpu/env基因(3Kb)。3’端載體(3’-pvpu+)是一個包含猴免疫缺陷病毒SIVmac239的3’端基因(nef和LTR)以及多個限制性內(nèi)切酶多克隆位點的非表達(dá)載體(Chen，Z.，etal.，2000.EnhancedInfectivityofanR5-TropicSimian/HumanImmunodeficiencyVirusCarryingHumanImmunodeficiencyVirusType1SubtypeCEnvelopeafterSerialPassagesinPig-TailedMacaques(Macacanemestrina).JVirol，746501-6510)。用限制性酶SphI和XhoI酶切載體3’-pvpu+并去磷酸化。2.將上述處理后的HIV-1tat/rev/vpu/env基因片斷和載體3’-pvpu+按3∶1的摩爾濃度比混合，加入T4DNA連接酶(Promega)和連接緩沖液，使反應(yīng)終體積為10μl，16℃連接過夜。3.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布至LB/Amp+平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至5mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，220rpm，16小時。4.從每個菌液中提取質(zhì)粒，使用限制性酶SphI和XhoI(MBIFermentas)酶切鑒定，挑選正確的克隆3’-p02HNSMX2-B’WHU，用30％的甘油保藏克隆的菌種，提取克隆的質(zhì)粒置于-20℃保存。3’-p02HNSMX2-B’WHU包含了HIV-1B’的tat/rev/vpu/env和SIVmac239的3’端基因，從SphI酶切位點開始一直到3’LTR(圖1)。構(gòu)建雜交病毒株SHIV-B’WHU1.限制性酶SphI酶切質(zhì)粒PVP-1和3’-p02HNSMX2-B’WHU使其成線形，將兩個線形質(zhì)粒共轉(zhuǎn)然到293T細(xì)胞。質(zhì)粒PVP-1是大小為9.4Kb的DNA，包含了SIVmac239的5’端基因，即5’長末端重復(fù)序列(LTR)，gag和pol，從5’LTR到SphI酶切位點(圖1)(Luciw，P.A.，etal.，1995.PersistentinfectionofrhesusmacaqueswithT-cell-line-tropicandmacrophage-tropicclonesofsimian/humanimmunodeficiencyviruses(SHIV).ProcNatlAcadSciUSA，92(16)7490-4.)。2.轉(zhuǎn)染的具體方法使用Qiagen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體方法轉(zhuǎn)染前1天，在60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2-8×105293T細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前長至40-80％。BufferEC稀釋2ug線性質(zhì)粒(1ugPVP-1和1ug3’-p02HNSMX2-B’WHU)至總體積150ul，充分混合后加入16ulEnhancer，在振蕩器上振蕩1秒混勻，室溫(15-25℃)下放置2-5min。DNA-Enhancer混合物中加入20ul的EffecteneTransfectionReagent，上下顛倒5次混勻。在室溫中放置20分鐘形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。轉(zhuǎn)染復(fù)合體形成后，輕輕吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)液，用8ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌293T細(xì)胞，加入4ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。1ml培養(yǎng)液加入含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管，顛倒2次混勻后，立即把復(fù)合體溶液以點陣形狀滴入含有293T細(xì)胞的60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿后將培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3.轉(zhuǎn)染48小時后，在轉(zhuǎn)然的293T細(xì)胞中加入PHA-P(Sigma)刺激三天的5×106健康人PBMC共培養(yǎng)。24小時后，輕輕晃動轉(zhuǎn)染平皿，重懸PBMC，收集細(xì)胞重懸液，離心(1500rpm，10分鐘)，收集上清液并分裝凍存-70℃，。用PBS洗滌PBMC兩次，用PBMC生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每3-4天收集培養(yǎng)上清液，使用SIVp27抗原ELISA試劑盒(ZeptoMetrix)監(jiān)測上清液中p27抗原產(chǎn)量。結(jié)果監(jiān)測到SIVp27抗原產(chǎn)量，證明構(gòu)建出雜交病毒株SHIV-B’WHU。實施例4雜交病毒株SHIV-B’WHU的表型和感染性為了證明構(gòu)建的雜交病毒株SHIV-B’WHU具有感染性，并且與親本的HIV-102HNsmx2毒株具有相似其生物學(xué)特性。通過感染多種表達(dá)不同共受體的細(xì)胞鑒定病毒的表型特征和感染能力。通過感染GHOST.CD4細(xì)胞鑒定病毒株的表型和感染性1.線形質(zhì)粒PVP-1和3’-p02HNSMX2-B’WHU轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞分別與GHOS.CD4.Hu-CCR5細(xì)胞和GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞共培養(yǎng)24小時，進(jìn)行細(xì)胞融合實驗(具體方法見實施例2)。12-24小時后，用相差顯微鏡對培養(yǎng)物拍照觀察細(xì)胞合胞體形成情況。2.在24孔板中分別接種GHOS.CD4.Hu-CCR5和GHOS.CD4.Hu-CXCR4細(xì)胞，培養(yǎng)24小時。500ul(1.5ng)/孔的病毒上清液加入細(xì)胞中，再加入500ul培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育過夜。移去病毒上清液，用300ul/空的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，加入1ml培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24-48小時后觀察結(jié)果，用相差顯微鏡對培養(yǎng)物拍照觀察細(xì)胞合胞體形成情況。結(jié)果出現(xiàn)細(xì)胞融合形成的合胞體和綠色熒光，因而證明SHIV-B’WHU使用的共受體是CCR5，并具有感染靶細(xì)胞和在靶細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力?；赥ZM-b1細(xì)胞的熒光素酶反應(yīng)測定病毒株的表型和感染性1.感染前24小時，在96孔板的每孔中接種100ul含有2×104的TZM-b1細(xì)胞，使細(xì)胞長到40-80％面積。TZM-b1細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)來自HeLa細(xì)胞，能在細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)大量CD4和CCR5受體，包含HIV-LTR介導(dǎo)的熒光素酶和β牛乳糖報告基因，LTR被HIVTat蛋白激活后誘導(dǎo)報告基因的表達(dá)，它對各種HIV-1毒株高度敏感。2.兩倍稀釋的SHIV-B’WHU病毒(300pg，150pg，75pg)分別感染TZM-b1細(xì)胞(50ul/孔)，每孔加入DEAE-dextran(Sigma)至終濃度為20ug/ml，不加病毒的孔作為陰性對照以便測定發(fā)光背景，每孔重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)3小時。每孔補加培養(yǎng)基50ul，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。3.使用熒光素分析試劑盒(LuciferaseAssaySystem，Promega)檢測感染SHIV-B’WHU病毒的TZM-b1細(xì)胞的熒光素值，具體方法用加樣器吸出培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗細(xì)胞一次，吸出PBS緩沖液，加入20ul1×熒光素細(xì)胞培養(yǎng)裂解液(LuciferaseCellCultureLysis)，室溫放置1小時以上，轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液入96孔白板。每孔各加入熒光素分析底物(LuciferaseAssaySubstrate)和熒光素分析緩沖液(LuciferaseAssayBuffer)混合液100ul，注意使此混合液和室溫保持在22℃，立即使用酶標(biāo)儀測定每孔的熒光素值。數(shù)據(jù)顯示SHIV-B’WHU能感染TZM-b1細(xì)胞，表達(dá)功能性Tat蛋白激活熒光素酶報告基因的表達(dá)，并且感染細(xì)胞的病毒量與細(xì)胞產(chǎn)生的熒光素酶活性與成正比，而沒感染病毒的細(xì)胞的熒光素酶活性很差。因此新構(gòu)建的SHIV-B’WHU株使用的共受體是CCR5，并且是一個具有感染靶細(xì)胞能力的病毒。實施例5SHIV-B’WHU具有在人和中國恒河猴PBMC上的復(fù)制能力為了證明SHIV-B’WHU具有在人和中國恒河猴PBMC上的體外復(fù)制能力并能產(chǎn)生一定的病毒量，申請人將SHIV-B’WHU感染健康人或者中國恒河的PBMC，通過測定病毒的滴度鑒定病毒的體外復(fù)制動力學(xué)。SHIV-B’WHU在健康人PBMC中的復(fù)制能力轉(zhuǎn)染病毒上清液感染健康人PBMC1.線性質(zhì)粒PVP-1和3’-p02HNSMX2-B’WHU共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后28小時，將PHA刺激三天的健康人PBMC與其共培養(yǎng)，24小時后，輕輕晃動轉(zhuǎn)染平皿，重懸PBMC，收集細(xì)胞重懸液，離心后得到PBMC細(xì)胞沉淀，用PBS洗滌PBMC兩次，加入5mlPBMC生長培養(yǎng)基。2.每3～4天收集一半病毒上清液，補充等量的PBMC生長培養(yǎng)基。每周補充一次新鮮的、植物血凝素(PHA-P)刺激三天的健康人PBMC(即三天前從健康人全血中提取的PBMC，具體方法見實施例1)。3.使用SIVp27抗原ELISA試劑盒(ZeptoMetrix)監(jiān)測病毒上清液中p27抗原產(chǎn)量。感染SHIV-B’WHU的人PBMC和健康人PBMC共培養(yǎng)將上述感染病毒的人PBMC與2×106的健康人PBMC(PHA-P刺激三天)共培養(yǎng)，每3～4天收集一半病毒上清液，補充等量的PBMC生長培養(yǎng)基。每周補充一次新鮮的、PHA-P刺激三天的健康人PBMC。使用SIVp27抗原ELISA試劑盒(ZeptoMetrix)監(jiān)測病毒上清液中p27抗原產(chǎn)量。SHIV-B’WHU在健康中國恒河猴PBMC中的復(fù)制能力取500ul轉(zhuǎn)染病毒上清液感染2×106PHA-P刺激三天的中國恒河猴PBMC(990011和00031)，補充500ulPBMC生長培養(yǎng)基。每3～4天收集病毒上清液，補充等量的細(xì)胞培養(yǎng)基；每周補充一次新鮮的、PHA-P刺激三天的猴PBMC。使用SIVp27抗原ELISA試劑盒(ZeptoMetrix)監(jiān)測病毒上清液中p27抗原產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHIV-B’WHU能在人和中國恒河猴PBMC中復(fù)制產(chǎn)生較高滴度的病毒，因此證明SHIV-B’WHU具有體外感染人和中國恒河猴PPBMC并高效復(fù)制的能力。實施例6分子水平分析SHIV-B’WHU病毒株是具有復(fù)制能力的活病毒為了進(jìn)一步證明逆轉(zhuǎn)錄病毒株SHIV-B’WHU能在PBMC中將自身的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA整合到細(xì)胞基因組中并逆轉(zhuǎn)錄形成病毒mRNA。申請人在分子水平上分析病毒的活性。通過分析前病毒基因組DNA證明病毒為活病毒1.從細(xì)胞中提取SHIV-B’WHU前病毒基因組收集感染病毒的PBMC，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。使用DNA提取試劑盒(PuregeneDNAIsolationKit，Gentra)從感染病毒的細(xì)胞中提取前病毒基因組。2.擴(kuò)增前病毒基因組env序列以前病毒基因組DNA為模板，用引物VprA和EnvB擴(kuò)增雜交病毒env基因片斷。具體反應(yīng)體系和條件總體積50ul中含10×buffer(NH4SO4)5.0ul，MgCl2(25mM)4.5ul，25mMdNTP(Amersco)1.0ul，引物VprA(20pmol/ul)1.0ul，引物EnvB(20pmol/ul)1.0ul，H2O29ul，1u/ulTaqDNA聚合酶(MBI)3.5ul，病毒基因組DNA5.0ul。92℃2min，1個循環(huán)；92℃20sec，50℃45sec，72℃4min，35個循環(huán)；72℃15min。結(jié)果有一條大約3.0Kb的特異性DNA帶，膠回收該DNA。將該DNA連接到pMD18-T載體(Takara)上，送到測序公司測序。通過分析病毒RNA證明病毒為活病毒1.從感染病毒的PBMC中提取病毒總mRNA在1.5mlEP管中收集5×106感染病毒的PBMC細(xì)胞(PBS洗滌兩次)。加入1ml的RNA提取試劑(TRIZOLLSReagent，Invitrogen)，15-30℃溫度下孵育5分鐘，使核蛋白復(fù)合物徹底裂解。加入0.2ml的氯仿，蓋緊EP管蓋，用手使勁搖動15秒，在15-30℃溫度下孵育2-3分鐘，12,000×g，4℃離心15分鐘，病毒RNA應(yīng)在上清液中。上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈EP管中與0.5ml異丙醇混合，15-30℃孵育10分鐘后，4℃，12,000×g離心10分鐘，沉淀RNA。移去上清液，加入1ml75％的酒精與沉淀充分混合，洗滌沉淀。4℃，7,500×g離心5分鐘。在室溫下干燥RNA沉淀(注意不能使用真空干燥)，加入RNase-free水，55-60℃孵育十分鐘，充分溶解RNA沉淀。2.RT-PCR和巢式PCR擴(kuò)增出病毒cDNA的rev片斷在含有20μl病毒RNA的0.2mlPCR管中加入500ug/ul隨機(jī)引物(RandomPrimers，Promega)2μl，70℃10分鐘，然后置于冰上10分鐘。隨后再向管中加入5×buffer10μl，40u/ulRnasin(Promega)1.5ul，10mMdNTP(Amersco)5.0μl，9.5μlNuclease-freeH2O(Minipore)，200u/μlM-MLVRT(Promega)2.0μl，使總體積達(dá)50μl。在37℃水浴中反應(yīng)1小時。針對HIV-1Rev兩處外顯子區(qū)域設(shè)計兩對引物，第一輪引物為Rev1(5’-AGAAGAGAAGACAGCGACGAAGA-3’)和Rev2(5’-TCCAATACTGCAGGAGATTCCACC-3’)，第二輪引物為Rev1-2(5’-GAAGACAGCGACGAAGAGCTCCTCAAG-3’)和Rev2-2(5’-ACTGCAGGAGATTCCACCAATATCTGAGGG-3’)。使用巢式PCR擴(kuò)增rev片段。第一輪反應(yīng)體系的總體積為50ul，包含有10×buffer(NH4SO4)5.0μl，MgCl2(25mM)4.5μl，10mMdNTP(Amersco)2.5μl，引物Rev1(20pmol/μl)1.0μl，引物Rev2(20pmol/μl)1.0μl，H2O32μl，1u/ulTaqDNA聚合酶(MBI)2.0μl，RT產(chǎn)物(cDNA)2.0μl。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，一個循環(huán)；95℃15秒，52℃45秒，72℃1分鐘，35個循環(huán)；72℃10分鐘。第二輪50ul反應(yīng)體系中包含10×buffer(NH4SO4)5.0μl，MgCl2(25mM)4.5μl，dNTP(10mM)2.5μl，引物Rev1-2(20pmol/μl)1.0μl，引物Rev2-2(20pmol/μl)1.0μl，H2O32μl，1u/μlTaqDNA聚合酶(MBI)2.0μl，第一輪PCR產(chǎn)物2.0μl。反應(yīng)條件為95℃5分鐘，一個循環(huán)；95℃15秒，52℃45秒，72℃45秒，35個循環(huán)；72℃10分鐘。PCR擴(kuò)增出大約310bp擴(kuò)增帶，其大小與預(yù)期的結(jié)果一致，而陰性對照中沒有相應(yīng)的特異帶。將PCR產(chǎn)物回收，回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(Takara)后測序。測序結(jié)果證明，SHIV-B’WHU能將自己的病毒基因整合到PBMC中形成前病毒。SHIV-B’WHU感染PBMC后產(chǎn)生的Rev與親本毒株02HNsmx2上的Rev序列是完全一致的。這說明SHIV-B’WHU是一個具有逆轉(zhuǎn)錄，整合活性的活病毒。實施例7SHIV-B’WHU在建立B’亞型，R5嗜性SHIV/猴模型中的應(yīng)用本構(gòu)建的雜交病毒株SHIV-B’WHU具有其特殊的生物學(xué)特性和優(yōu)點，利用該病毒建立一種新型的SHIV/猴模型。1.動物選擇選擇20只年齡為24個月的雌性恒河猴。經(jīng)血清學(xué)檢測猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiencyVirus，SIV)，猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(SimiantypeDretrovirus，SRV-1)，猴T淋巴細(xì)胞I型病毒(SimianT-celllymphotropicvirustypeI，STLV-1)，猴泡沫病毒(Simianfoamyvirus，SFV)和肺結(jié)核(Tuberculosis，TB)。2.建立SHIV-B’WHU/猴模型第一階段實驗(4只幼年中國恒河猴，編號為P10002，P20296，P31032，P41050)目的SHIV-B’WHU感染恒河猴后，通過系列傳代(P)獲得具有致病性的病毒株SHIV-B’WHUP4。具體方法從一只健康的恒河猴(P1)靜脈中抽取3-5ml全血(肝素抗凝)，分離PBMC，PHA-P刺激細(xì)胞三天。用3000半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)的SHIV-B’WHU病毒上清液體外感染該PBMC。12小時后將3×104TCID50病毒上清液和經(jīng)感染的猴自體PBMC(2×108)，總共1ml的體積，通過靜脈途徑回輸給恒河猴(P1)。2周后取P1恒河猴5ml全血和2ml骨髓靜脈輸入到另外兩個健康恒河猴體內(nèi)，作為P2動物。以同樣的方法從P2動物傳代形成P3和P4動物。收集標(biāo)本的時間和內(nèi)容攻毒前1天(第0天)，攻毒后第3，7，12，14天收集全血，收集猴腸系膜淋巴結(jié)，脾，肺，肝和腎臟。在無菌環(huán)境下收集所有組織標(biāo)本，將部分組織浸泡在福爾馬林中固定，部分組織立刻存放到液氮中保存。第二階段實驗(16只幼年恒河猴)目的建立SHIV-B’WHUP4/猴模型。具體方法從第一階段實驗中選擇具有最高感染毒力的病毒株SHIV-B’WHU。倍比稀釋的病毒劑量(102，103，104和105TCID50)通過陰道粘膜途徑輸入另外16只健康恒河猴體內(nèi)(4只/組，共4組)，建立感染，輸入病毒的總體積為1ml。根據(jù)感染SHIV-B’WHU恒河猴的CD4和CD8細(xì)胞計數(shù)，體內(nèi)病毒載量，免疫缺陷癥狀等臨床和實驗室檢測指標(biāo)確定病毒感染恒河猴的感染劑量，建立一種模擬HIV-1性傳播途徑的SHIV/猴模型。收集標(biāo)本的時間和內(nèi)容攻毒前1天(第0天)，攻毒后第1，2，3，5，7，12，14天收集全血，以后每1-2周收集全血1次，收集猴猴腸系膜淋巴結(jié)，腸道的各個部分，脾，肺，肝和腎臟。標(biāo)本的處理和存放同上。3.檢測指標(biāo)第一和第二階段實驗都要進(jìn)行如下的檢測1)病毒體內(nèi)、外生長動力學(xué)(SIVp27分析)提取每只感染病毒的猴血漿，使用SIVp27抗原酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(ZeptoMetrix)分析病毒在猴體內(nèi)的生長動力學(xué)。將106感染病毒猴的PBMC與2×106健康猴的PBMC共培養(yǎng)(PHA-P刺激三天)，每3-4天收集病毒上清液，補充新鮮培養(yǎng)基，每周補充新鮮的健康猴PBMC。通過檢測上清液的SIVP27產(chǎn)量，了解SHIV-B’WHU的體外生長動力學(xué)。2)病毒誘導(dǎo)猴體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體使用免疫印跡法(WesternBlot)監(jiān)測感染SHIV-B’WHU的恒河猴體內(nèi)是否產(chǎn)生了特異性抗體。SHIV-B’WHU通過體外感染CEM×174.Hu-CCR5細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，編號272)，大量增殖病毒。當(dāng)p27產(chǎn)量達(dá)到峰值時收獲病毒上清液，而后濃縮病毒，并用蔗糖梯度離心純化病毒。將純化的病毒重懸在50ul病毒裂解緩沖液(O.15MNaCl，0.05MTris-HCl[pH7.2]，1％TritonX-100，1％sodiumdeoxycholate，and0.1％sodiumdodecylsulfate)，而后在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳和免疫印跡(WesternBlot)。使用接種病毒SHIV-B’WHU的猴血清作為一抗(PBS稀釋1∶200)，以堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗猴IgG為二抗(PBS稀釋1∶500)，催化底物為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)，用數(shù)碼相機(jī)對硝酸纖維素薄膜拍照作永久實驗記錄。3)接種SHIV-B’WHU猴血漿中的RNA病毒載量使用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)方法監(jiān)測猴血漿中RNA病毒載量。將EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝的猴血漿離心(5000rpm，10分鐘)去除殘留的細(xì)胞。500ul血漿/猴進(jìn)行超離心(13000rpm，60分鐘，4℃)，去除上清液，留下病毒沉淀和140ul血漿。使用病毒RNA提取試劑盒(QIAampViralRNAKit，QIAGEN)提取病毒RNA。提取的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，即在含有20μl病毒RNA的0.2mlPCR管中加入500ug/ul隨機(jī)引物(RandomPrimers，Promega)2μl，5×buffer10μl，40u/ulRnasin1.5μl(Promega)，10mMdNTP(Amersco)5.0μl，9.5μlNuclease-freeH2O(Minipore)，200u/μlM-MLVRT(Promega)2.0μl，使總體積達(dá)50μl。RT-PCR反應(yīng)條件25℃15分鐘，42℃40分鐘，75℃5分鐘。針對SIVgag區(qū)域設(shè)計引物和分子探針，引物SL03序列為5′-AGGGAAGAAAGCAGATGAATTA-3′；引物SL04為5′-GTTTCACTTTCTCTTCTGCGT-3′；分子探針beacon為5′-FAM-CGCTGGAGAACAAAGAAGGATGTCACAGCG-DABCYL-3′，F(xiàn)AM(6-carboxyfluorescein)是一種報告熒光染料，DABCYL(4′dimethylaminophenylazobenzoicacid)是一種猝滅劑。PCR反應(yīng)體系和條件10×buffer10μl2.0ul，25mMMgCl21.0ul，20pmol/ulSL031.0ul，20pmol/ulSL041.0ul，20pmol/ulBeaconSL070.5ul，1u/μlTaqDNA聚合酶(MBI)0.5ul，H2O14ul，30ulcDNA，總體積為50ul。95℃10min，1個循環(huán)；95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec，45個循環(huán)，在熒光定量PCR儀上完成PCR反應(yīng)。4)熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分析使用FACS分析SHIV-B’WHU感染猴的外周血CD4+和絕對計數(shù)和CD4+/CD8+比值。具體方法50ul全血加入到TruCount管(BectonDickinson，SanJose，Calif.)，而后加入10ulleu-3a-PE抗CD4的抗體(BectonDickinson)，10ulleu-2a-PerCP抗CD8的抗體(BectonDickinson)和10ul熒光素異硫氰酸鹽(fluoresceinisothiocyanate)抗CD3e抗體(Pharmingen，SanDiego，Calif.)?；旌衔镌诎凳遥覝?15-25℃)條件下孵育20分鐘，加入450ul的1×FACS裂解液(BectonDickinson)，室溫下孵育15分鐘以確保紅細(xì)胞完全裂解。標(biāo)本進(jìn)入流式細(xì)胞儀進(jìn)行FACS分析。根據(jù)軟件的產(chǎn)商說明對CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)。5)免疫組化福爾馬林固定的各種組織與單克隆抗體FA2(anti-SIVmacp27；NationalInstitutesofHealthAIDSReferenceandReagentProgram，Bethesda，Md.)反應(yīng)，隨后加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(DakoLaboratory，Carpinteria，Calif.)，ABC過氧(化)物酶(VectorLaboratories，Burlingame，Calif.)，和AEC底物(BiomedaCorp.，F(xiàn)osterCity，Calif.)，最后產(chǎn)生一種紅色陽性產(chǎn)物。組織切片使用蘇木精復(fù)染。使用來自SIV感染猴的組織切片為陽性對照，未感染病毒的組織為陰性對照。6)原位雜交使用生物素標(biāo)記的SHIVgagcDNA探針(SVJoag，etal，1997.AnimalModelofMucosallyTransmittedHumanImmunodeficiencyVirusType1DiseaseIntravaginalandOralDepositionofSimian/HumanImmunodeficiencyVirusinMacaquesResultsinSystemicInfection，EliminationofCD4+TCells，andAIDS.JournalofVirology，714016-4023.)與福爾馬林固定的各種組織進(jìn)行原位雜交，而后與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體和BCIP底物反應(yīng)，產(chǎn)生的陽性結(jié)果呈紫藍(lán)色。用核堅牢紅(NuclearFastRed)對組織切片進(jìn)行復(fù)染。第一階段實驗數(shù)據(jù)證明SHIV-B’WHU病毒能在中國恒河猴體內(nèi)生長繁殖，病毒載量隨感染時間而增高，并且傳代提高病毒在中國恒河猴的初始病毒血癥(圖11)。恒河猴的淋巴結(jié)，肝，脾和肺組織的常規(guī)病理切片發(fā)現(xiàn)肺組織間隔增寬，類似間質(zhì)性肺炎的病理改變；肝、脾、淋巴結(jié)組織可見單核吞噬細(xì)胞的免疫性增生(圖12)。實施例8SHIV-B’WHU在檢測和篩選艾滋病疫苗、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、殺微生物劑中的應(yīng)用。1、SHIV-B’WHU在檢測或篩選和評估艾滋病疫苗中的應(yīng)用使用致病的SHIV-B’WHU攻擊經(jīng)HIV-1疫苗接種的恒河猴，評估疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)和保護(hù)作用。評估的HIV-1疫苗應(yīng)該是基于其env設(shè)計的，SHIV-B’WHU與疫苗的env來源可以是同源或異源的。1)將待評估的HIV-1疫苗接種到4只恒河猴體內(nèi)，第3周和第10周時再用該疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫。陰性對照組的4只恒河猴不進(jìn)行接種免疫。第22周時用100TCID50的SHIV-B’WHU攻擊每只恒河猴。攻毒后，通過觀察每只恒河猴的臨床表現(xiàn)，檢測每只恒河猴體內(nèi)的各項指標(biāo)來觀察疫苗對恒河猴的保護(hù)作用。2)具體檢測指標(biāo)如下①通過酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISOPT)監(jiān)測接種病毒猴體內(nèi)HIV-1特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL)將鼠抗人γ干擾素單克隆抗體B27(BDPharMingen，SanDiego，California)以10ug/ml的濃度溶于Dulbecco’sPBS(D-PBS，LifeTechnologies，Gaithersburg，Maryland)，然后按100ul/孔包被96孔MultiscreenHA板(Millipore，Bedford，Massachusetts)，4℃過夜。第二天，用含0.25％Tween-20的D-PBS(D-PBS/Tween)洗板3次，然后用含5％胎牛血清(Invitrogen)的D-PBS于37℃封閉2小時(100ul/孔)。用含10％胎牛血清的RPMI1640(Invitrogen)洗板以除去Tween-20后，將100ul含2×105個猴外周血單核細(xì)胞接入每個孔，再將終濃度為2ug/ml的ENV或GAG或POL的肽庫接入相應(yīng)的孔，37℃孵育18小時。陰性對照孔不加多肽刺激物。孵育完成后用D-PBS/Tween洗板9次，用蒸餾水洗板1次。然后每孔加入2ug/ml生物素標(biāo)記的兔抗人γ干擾素抗體(Biosource，Camarillo，California)，室溫孵育2小時。孵育完成后用Coulter洗滌液(BeckmanCoulter，Miami，F(xiàn)lorida)洗板6次，再用1∶500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SouthernBiotechnology，Birmingham，Alabama)孵育2小時。孵育完成后用Coulter洗滌液洗板5次，用D-PBS洗板1次，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)顯色。顯色完成后用自來水中止反應(yīng)，干燥后用ELISPOT讀板機(jī)(HitechInstruments，Edgement，Pennsylvania)分析結(jié)果。②通過熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分析恒河猴體內(nèi)的CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目方法與具體實施例子7中4)相同。③使用實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)監(jiān)測猴血漿中RNA病毒載量方法與具體實施例子7中3)相同。④中和抗體效價將待測血清用新鮮培養(yǎng)基(RPMI1640/12％fetalbovineserum/50uggentamicin)梯度稀釋致終體積100ul，再將50ul含有500TCID50的SHIV-B’WHU與其混合一起加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃孵育1小時，然后每孔加入100ul含有5×104的MT-2細(xì)胞(美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃，NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)細(xì)胞。4-6天后用中性紅(Finter’sneutralred，ICN，Cat.No.1691149)染色，活細(xì)胞將被染色而被病毒殺死的細(xì)胞將不被染色。中和抗體滴度計算為50％細(xì)胞被保護(hù)時的血清稀釋度的倒數(shù)。有效的艾滋病疫苗能保護(hù)恒河猴感染SHIV-B’WHU，即監(jiān)測不到恒河猴體內(nèi)的病毒；或者感染病毒后各種指標(biāo)接近正常值，具體表現(xiàn)為在接種疫苗的恒河猴體內(nèi)能檢測到病毒的DNA和RNA，但是病毒載量監(jiān)測不到或維持在較低的水平，CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目基本不變，能監(jiān)測到恒河猴體內(nèi)產(chǎn)生的HIV-1特異性CTL反應(yīng)和較高的中和抗體效價。而對照組的恒河猴均感染病毒，并且出現(xiàn)各種臨床癥狀(如發(fā)熱，體重下降，腹瀉，肺部感染等)，病毒載量高和CD4，CD8細(xì)胞數(shù)目下降。2.SHIV-B’WHU在檢測或篩選和評估抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物中的應(yīng)用使用致病的SHIV-B’WHU攻擊恒河猴，導(dǎo)致感染病毒的猴出現(xiàn)與AIDS相關(guān)的綜合癥，再給予待檢測的逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，篩選具有抗病毒活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，并評估藥物的療效。1)使用100TCID50SHIV-B’WHU攻擊8只恒河猴。2周后，實驗組的4只恒河猴給予待測的逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物進(jìn)行連續(xù)治療57天，按30mg/kg猴體重注射，而對照組的4只猴不給與任何藥物治療。2)通過觀察所有恒河猴的臨床表現(xiàn)和檢測每只恒河猴的CTL反應(yīng)，CD4和CD8細(xì)胞計數(shù)，病毒RNA載量等，了解待檢測的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的保護(hù)作用。同時通過分析猴體內(nèi)病毒序列，監(jiān)測病毒在藥物壓力下的突變和耐藥毒株產(chǎn)生的情況。有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物使感染SHIV-B’WHU的恒河猴臨床癥狀出現(xiàn)晚或者沒有，各項指標(biāo)接近正常，即感染病毒恒河猴使用有效的抗病毒藥物猴，體內(nèi)的病毒病毒載量下降或監(jiān)測不到，CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目升高。對照組中的恒河猴出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，病毒載量持續(xù)增高，CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目持續(xù)下降。3.SHIV-B’WHU在檢測或篩選和評估殺微生物劑中的應(yīng)用殺微生物劑(Microbicides)是一些化合物，當(dāng)局部使用時，具有預(yù)防HIV感染和一些其它性傳播感染的潛力。使用SHIV-B’WHU建立一種通過陰道粘膜途徑感然的AIDS模型，這種模型可用于檢測和篩選殺微生物劑。1)將恒河猴麻醉后經(jīng)陰道灌注以上的殺微生物劑，15分鐘后以類似的方式陰道灌注SHIV-B’WHU并且保持恒河猴靜止?fàn)顟B(tài)30-45分鐘。3h后重復(fù)剛才的操作。陰性對照組不給予任何殺微生物劑。2)通過觀察所有恒河猴的臨床表現(xiàn)和檢測每只恒河猴的臨床表現(xiàn)，CTL反應(yīng)，CD4和CD8細(xì)胞計數(shù)，病毒RNA載量，組織中病毒含量等，篩選和評估有效的殺微生物劑。有效的殺微生物劑能保護(hù)恒河猴感染SHIV-B’WHU，即監(jiān)測不到恒河猴體內(nèi)的病毒；或者感染病毒后各種指標(biāo)接近正常值，具體表現(xiàn)為在接種疫苗的恒河猴體內(nèi)能檢測到病毒的DNA和RNA，但是病毒載量監(jiān)測不到或維持在較低的水平，CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目基本不變，能監(jiān)測到恒河猴體內(nèi)產(chǎn)生的HIV-1特異性CTL反應(yīng)，猴組織中的病毒含量較低。而對照組的恒河猴均感染病毒，并且出現(xiàn)各種臨床癥狀(如發(fā)熱，體重下降，腹瀉，肺部感染等)，病毒載量高，CD4和CD8細(xì)胞數(shù)目下降，猴組織中的病毒含量較高。權(quán)利要求1.一種雜交免疫缺陷病毒株，其特征在于人猴免疫缺陷病毒(SHIV-B’WHU)，CCTCCNOV200510。2.一種雜交免疫缺陷病毒株，其特征在于含有質(zhì)粒的菌株為EscherichiacoliDH5α/3’-p02HNSMX2-B’WHU，CCTCCNOM205070。3.一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在建立SHIV/猴模型中的應(yīng)用。4.一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測艾滋病的疫苗中的應(yīng)用。5.一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物中的應(yīng)用。6.一種雜交免疫缺陷病毒株/SHIV-B’WHU在檢測殺微生物劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種雜交免疫缺陷病毒株及應(yīng)用，人免疫缺陷病毒(HIV－1)B’亞型、R5嗜性、雜交的人/猴免疫缺陷病毒株(SHIV－B’文檔編號C12N1/21GK1948468SQ20061012496公開日2007年4月18日申請日期2006年11月8日優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日發(fā)明者張林琦,陳志偉,莊柯,田波申請人:武漢大學(xué)