專利名稱：一種將脂肪生物轉化為抗壞血酸脂肪酸酯的工藝的制作方法
技術領域：
本專利涉及一種將脂肪生物轉化為抗壞血酸脂肪酸酯的工藝，屬生物催化的有機合成技術領域。
背景技術：
抗壞血酸脂肪酸酯，包括L-抗壞血酸-6-0-月桂酸酯、L-抗壞血酸-6-0-豆蔻酸酯、L-抗壞血酸-6-0-棕 櫚酸酯以及L-抗壞血酸-6-0-硬脂酸酯等，已知可作為有效的抗氧化劑用于堅果、炸薯片，蛋黃醬、人造 奶油以及油炸小吃食品等高脂食品中。并且，這些酯的有些鹽類可作為表面活性劑用于食品中。此外，作 為維生素C的脂溶性形態(tài)，抗壞血酸脂肪酸酯因其脂溶性特征也引起了廣泛的興趣。因為它們可以輕易的 穿過細胞膜和血腦屏障，具有許多維生素C所沒有的特性，易于被細胞吸收，并累積在細胞內，可以到達 維生素C本身所無法到達的組織和器官，保護機體的細胞膜等脂質部分不被氧化，因而具有良好的抗癌抗 腫瘤、抗衰老等營養(yǎng)保健功能。Kageyama K等發(fā)現它們能強烈地抑制Ehrlich ascites癌細胞的DNA的合 成，分解癌細胞的細胞膜的磷脂，是極好的抗癌物質['1。 Naidu等人的研究表明，抗壞血酸脂肪酸酯可以 抑制鼠神經膠質瘤(mouse glioma, C6)和人腦瘤細胞，即神經膠質瘤(glioma, U-373)和神經膠質母細胞瘤 (glioblastomaT98G)細胞和腎癌細胞的增殖。M|
關于抗壞血酸脂肪酸酯的合成，有化學合成15'61和生物催化合成[7^兩類方法。其中的化學合成工藝已 經實現了大規(guī)模工業(yè)化生產。目前市售的抗壞血酸脂肪酸酯類產品全部是用化學法合成的。但化學合成工 藝存在著某些致命的缺陷。該工藝需采用濃硫酸為催化劑，不可避免地伴有副反應，產生某些機理和結構 都很復雜的副產物和非自然的異構體，對抗壞血酸的轉化率和產物的產率影響很大，分離提純工藝復雜。 此外，該工藝對設備的要求很高，對環(huán)境的污染也極為嚴重。
與化學合成工藝相比，抗壞血酸脂肪酸酯的生物催化合成工藝具有非常大的優(yōu)越性，可以避免使用濃 硫酸，使反應在溫和的條件下進行，幾乎無副反應發(fā)生，抗壞血酸的轉化率和產品的純度都可以大幅度提 高。同時可以消除對環(huán)境的污染，實現綠色化工、環(huán)境友好生產。但迄今為止所研究的生物催化合成技術 中，大多是以脂肪酸或脂肪酸的甲酯(乙酯)為原料的，而這些原料本身通常仍是以化學合成的方法制備的， 其生產過程仍是會造成環(huán)境污染的，因而以脂肪酸或其甲酯(乙酯)為原料進行的生物催化法合成仍不是徹 底的環(huán)境友好生產，不能根除對環(huán)境的威脅。
為了根除環(huán)境污染，實現徹底的環(huán)境友好生產，我們也進行了以天然來源的植物油脂、動物脂肪或魚 油等可食用天然原料為原料與抗壞血酸通過酯交換直接合成抗壞血酸脂肪酸酯的研究191。結果表明，反應 可以進行，但因缺乏足夠的平衡移動推動力，平衡轉化率不高。 參考文獻 Kagey細a K. Enhanced inhibition of DNAand release of membrane phosphor-lipids in tumor cells treated
with a combination of acylated ascorbate and hyperthermia, Int. J.Hyperthermia, 199，7( 1): 85-91. Naidu A K， Wiranowska M, Kori S H， Prockop L D， Kulkarni A P. Inhibition of human glioma cell
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glutathione-S-transferase by ascorbyl esters and interferon in mouse glioma. J Neuro-Oncol 1993,16:1~10. Makino Y， Sakagami H, Takeda M: Induction of cell death by ascorbic acid derivatives in human renal
carcinoma and glioblastoma cell lines. Anticancer Res 1999， 19:3125~3〗32.
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[9〗袁紅玲，湯魯宏，陶文沂.以抗壞血酸和食用油脂為原料非水相酶促酯交換法合成抗壞血酸脂肪酸酯 的研究.江南大學學報，2006,(已接受，待發(fā)表)

發(fā)明內容
本專利涉及一種環(huán)境友好的，從天然原料出發(fā)的，以生物催化的方式進行的，相對廉價的，高產率的 合成抗壞血酸脂肪酸酯的工藝。更為獨特的是，它涉及一種經過改進的工藝，這種工藝以乙醇為媒介，將 脂肪醇解反應和脂肪酸乙酯與抗壞血酸之間的酯交換反應結合在一起，通過從反應混合物中不斷的去除某
一反應產物，使平衡反應向正反應方向移動，使反應趨于完成，顯著提高了產率和產物的純度。按照本專 利進行操作，與此前的傳統(tǒng)方法相比，能夠徹底根除抗壞血酸脂肪酸酯的生產對環(huán)境的污染威脅，實現徹 底的環(huán)境友好生產，并顯著改善產率及產品的純度。以上這些改進對于涉及環(huán)境污染以及抗壞血酸之類的 昂貴反應物的化學合成而言是至關重要的。
棕櫚酸、豆蔻酸、硬脂酸等脂肪酸的抗壞血酸酯已知可作為有效的抗氧化劑用于堅果、炸薯片，蛋黃 醬、人造奶油以及油炸小吃食品等高脂食品中。并且，這些酯的有些鹽類可作為表面活性劑用于食品中。
美國專利4151178描述了經過改良的，最佳的抗壞血酸-6-0-脂肪酸酯的化學合成方法。該方法由下列 步驟構成將脂肪酸溶于至少不低于96%的高濃度濃硫酸中，讓過量的脂肪酸跟抗壞血酸混合后放置過夜 (脂肪酸對抗壞血酸的摩爾比為大約1.35)，生成所期望的6-S旨。重結晶的抗壞血酸-6-月桂酸酯，6-豆蔻酸 酯，6-棕櫚酸酯和6-硬脂酸酯，由于脂肪酸過量35%，抗壞血酸轉化為相應的酯的轉化率可以高達86%。 但這種高轉化率是以大劑量的使用濃度大于％%的高濃度硫酸為代價的，該專利要求將反應混合物中脂肪 酸與抗壞血酸的摩爾數之和對硫酸的摩爾比控制在大約0.1到0.3之間，建議控制在0.15到0.17之間。
前已述及，上一方法在合成中使用如此高濃度的如此大量的濃硫酸，對環(huán)境造成了極大的威脅，也使 得該合成過程不可避免的伴隨有許多難以預料和解釋的副反應，不得不運用繁復分離提純工藝對產物進行 純化。并且所用原料為脂肪酸，而脂肪酸本身也是需要以脂肪為原料加工生產的。所有這些缺陷都是十分 不利的和需要克服的。
因而，本發(fā)明的最重要的目的之一，就是要提供一種從天然原料出發(fā)的，不再使用濃硫酸的，完全綠 色的，對環(huán)境不會造成任何不良影響的合成T.藝，實現抗壞血酸脂肪酸酯的環(huán)境友好型生產。同時，通過 避免副反應，并允許對未反應完的脂肪酸乙酯和抗壞血酸進行回收和循環(huán)使用，使抗壞血酸和脂肪的轉化 率都得到大幅提高，以此來降低反應物的成本。
作為一個順帶的結果，本發(fā)明的另一個目標是提供一種生產純的甘油的工藝。
具體來說，首先，我們發(fā)現，酶促脂肪醇解反應混合物中所含的甘油在室溫或更低一點的溫度下，會 跟脂肪酸乙酯的乙醇溶液分層，可以很方便地將反應中所產生的甘油從反應體系中分離除去。這一發(fā)現的 重要意義在于，這允許酶促脂肪醇解反應不斷地向正反應方向移動，使反應趨于完成。甘油的及時除去， 連同乙醇的過量，共同提供了確保反應趨于完成的反應驅動力。
還發(fā)現，作為脂肪醇解反應的反應物的乙醇，在脂肪酸乙酯跟抗壞血酸進行酶促酯交換反應的過程中 可以起到很好的溶劑的作用，對于增大抗壞血酸的初始反應濃度，提高初反應速度，使酶促酯交換反應盡 快達到平衡是至關重要的。當反應達到平衡之后，作為反應產物的乙醇可以很方便的蒸餾脫除，以使酶促 酯交換反應趨于完成。
采用該工藝，脂肪中所含的脂肪酸應當是4到22個碳原子的飽和(或不飽和或多不飽和)脂肪酸。依照 所需要的產物類型的不同，適用的脂肪可以是富含月桂酸，棕櫚酸，肉豆蔻酸和硬脂酸的，也可以是富含 不飽和，甚或多不飽和脂肪酸的。關于抗壞血酸組分，抗壞血酸的任何異構體，如L-抗壞血酸或D-異抗 壞血酸，都可以使用。
反應應當在所選用生物催化劑的最適催化溫度下進行。對于Novozym435而言，55°C到60°C在實踐 中被證明是有效的。我們還發(fā)現，低于55°C的溫度再加上較長的反應時間，與溫度較高，時間較短的方 法相比可以給出更高的產率。本發(fā)明中脂肪醇解反應所需要的反應時間為2到48小時，抗壞血酸脂肪酸 酯的合成達到基本完成的較佳時間段為大約4到16小時。
本發(fā)明中所提及的所有重要參數全部最優(yōu)化后脂肪和抗壞血酸的轉化率均可提高至接近100%。本發(fā)明中所使用的抗壞血酸脂肪酸酯產品回收技術基本沿用傳統(tǒng)方法。酯化反應完成后，對反應混合 物進行冷卻，物理分離，乙醚萃取和干燥。這些步驟(包括重結晶)給出了色譜純產品的良好的產率。
具體實施例方式
下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
20g氫化棕櫚油和lgNovozym435被添加到100g無水乙醇中構成混合物，隨后在55。C下，在不斷攪 拌的條件下，反應48hr。反應結束后，將液體反應混合物與固體酶分開，并冷卻至室溫下靜置分層，然后 將冷卻后的混合物移入分液漏斗中，分出1.8g甘油；上層脂肪酸乙酯的乙醇溶液重新倒入含有固體酶的反 應容器中，然后添加13.2gL-抗壞血酸，構成新混合物，隨后在55。C下，在不斷攪拌的條件下，反應8hr。 隨后開啟真空泵，對反應體系減壓，以使乙醇蒸出，邊蒸除乙醇邊繼續(xù)維持反應，直到不再有乙醇蒸出， 繼續(xù)維持反應4hr。反應結束后，將反應混合物連同固體酶一起冷卻至室溫，并用100ml石油醚洗滌3次， 每次洗滌后過濾，回收固體酶和未反應完的L-抗壞血酸并在下一輪酯交換反應中循環(huán)使用，得到產品的石 油醚溶液。溶液中添加500~600ml乙醚，結晶得到L-抗壞血酸脂肪酸酯25g。
結晶母液回收溶劑，殘余物回收并在下一輪酯交換反應中循環(huán)使用。
權利要求
1.一種將脂肪生物轉化為抗壞血酸脂肪酸酯的工藝。該工藝由下列步驟組成(1)制備一個混合物。該混合物由相應量的(i)脂肪，(ii)乙醇和(iii)生物催化劑組成；(2)讓混合物反應以生成脂肪酸乙酯和甘油；(3)從反應混合物中分離去除所生成的甘油；(4)向分離掉甘油之后的反應混合物中添加相應量的抗壞血酸，構成新的混合物；(5)讓新的混合物反應以生成抗壞血酸脂肪酸酯；(6)回收抗壞血酸脂肪酸酯。所宣稱的乙醇相對于所宣稱的脂肪摩爾過量；所宣稱的生物催化劑的用量為所宣稱的脂肪的重量的大約0.05到0.1；所宣稱的抗壞血酸的用量大致相等于所宣稱的脂肪中所含脂肪酸的摩爾數。
2. 內容1中所宣稱之脂肪為植物油脂、動物脂肪或魚油等各種脂肪酸甘油三酯中選定的一個成員。
3. 內容1中所宣稱之乙醇為無水乙醇。
4. 內容1中所宣稱之生物催化劑為脂肪酶、酯酶、蛋白酶或任何對此反應體系具有催化活性的生物催化 劑中選定的一個成員。
5. 內容l中所宣稱之抗壞血酸為抗壞血酸各種異構體中選定的一個成員， 一般為L-抗壞血酸。
6. 內容1中所宣稱之混合物在脂肪酸乙酯的生成期間被保持在從20°C到80。C的溫度下，最好是30°C 到60。C之間。
7. 內容1中所宣稱之脂肪酸乙酯的生成反應可以進行從2小時到48小時的一個周期。
8. 內容1中所宣稱之新混合物在抗壞血酸脂肪酸酯的生成期間被保持在從20°C到80°C的溫度下，最好 是30。C到60。C之間。
9. 內容1中所宣稱之抗壞血酸脂肪酸酯的生成反應可以進行從4小時到16小時的一個周期。
10. —種將脂肪生物轉化為抗壞血酸脂肪酸酯的工藝。該工藝由下列步驟組成 制備一個混合物。該混合物由相應量的(i)脂肪，(ii)乙醇，和(iii)生物催化劑組成。 乙醇相對于脂肪摩爾過量；生物催化劑的用量為脂肪的重量的大約0.05到0.1 。 讓所宣稱的混合物在從20°C到80°C的溫度下反應從2小時到48小時的一段時間以生成脂肪酸乙脂和甘油；分離去除并回收所生成的甘油后，向脂肪酸乙酯中添加等摩爾量的抗壞血酸，構成新的混合 物。讓新的混合物在從20°C到80°C的溫度下反應從4小時到16小時的一段時間以生成抗壞血酸脂肪酸脂；回收抗壞血酸脂肪酸酯。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種從天然原料出發(fā)的，以生物催化方式進行的，相對廉價的，高產率的，環(huán)境友好的抗壞血酸脂肪酸酯合成工藝。該工藝在生物催化劑(如Novozym 435)的催化下，以乙醇為媒介，將脂肪與乙醇之間的脂肪醇解反應和抗壞血酸與脂肪酸乙酯之間的酯交換反應結合在一起，實現了脂肪向抗壞血酸脂肪酸酯的轉化，徹底根除了現有化學生產工藝對環(huán)境的污染威脅，顯著提高了產率和產物的純度，并副產純甘油。該工藝由下列方法組成讓脂肪跟乙醇在酶的催化下于55～60℃下進行反應，回收去除生成的甘油；隨后添加抗壞血酸，讓脂肪酸乙酯跟抗壞血酸在酶的催化下于55～60℃下進行反應，回收去除生成的乙醇，得到抗壞血酸脂肪酸酯。
文檔編號C12P17/04GK101319240SQ200610126419
公開日2008年12月10日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權日2006年8月25日
發(fā)明者姜瑞霞, 湯魯宏 申請人:江南大學