專利名稱：飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞融合技術(shù)。
背景技術(shù)：
蝦青素是一種紅色的次生類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的生物抗氧化性，在醫(yī)藥，食品，化妝品及水產(chǎn)業(yè)等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)是利用生物技術(shù)生產(chǎn)天然蝦青素的主要來源。目前紅發(fā)夫酵母的蝦青素高產(chǎn)株的選育主要是通過使用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行細(xì)胞融合的方法。
PEG在誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞毒性很大。PEG濃度低時(shí)，原生質(zhì)體相互接觸的緊密度不夠，影響原生質(zhì)體的粘接和融合，原生質(zhì)體融合率較低；當(dāng)濃度高時(shí)，PEG可能造成原生質(zhì)體膜的大面積破壞或由于PEG本身的毒性引起細(xì)胞死亡。而且，通過PEG進(jìn)行的細(xì)胞融合是群體細(xì)胞間的隨機(jī)融合，這種融合不具備選擇性。即融合并非僅發(fā)生在所要求的兩個(gè)親本之間，這也是使融合率降低的重要因素。另外，在PEG法中融合子的檢出過程復(fù)雜。
已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道用激光進(jìn)行細(xì)胞融合，所用激光均為長脈沖激光。采用長脈沖激光的進(jìn)行細(xì)胞融合的作用機(jī)理是單光子吸收，當(dāng)能量較小時(shí)，不足以對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生作用，而當(dāng)能量較大時(shí)，激光所產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)部造成損傷，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。飛秒激光是脈沖寬度為飛秒(10-15s)量級(jí)的脈沖激光，其對(duì)細(xì)胞作用的機(jī)理是多光子吸收。飛秒激光的特點(diǎn)是具有極高的空間分辨率(～200nm)，因此飛秒激光可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行精確的操作，其不會(huì)對(duì)焦點(diǎn)以外的細(xì)胞區(qū)域造成損傷，不影響整個(gè)細(xì)胞的活性。目前人們使用飛秒激光已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞穿孔轉(zhuǎn)入外源基因、線粒體和葉綠體的切除和飛秒激光光鑷對(duì)單細(xì)胞的捕捉等操作，但尚無飛秒激光用于細(xì)胞融合的報(bào)道，更無采用飛秒激光用于紅發(fā)夫酵母的融合的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法。該方法具有融合率高，融合后細(xì)胞的活性高，融合子易于檢出以及能對(duì)整個(gè)融合過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和記錄的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，一種飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法，該方法采用飛秒激光顯微操作系統(tǒng)實(shí)施。所述飛秒激光顯微操作系統(tǒng)包括飛秒脈沖激光器、光束耦合裝置、倒置顯微鏡和監(jiān)控系統(tǒng)。所述飛秒脈沖激光器為摻鈦藍(lán)寶石自鎖模飛秒激光振蕩級(jí)，輸出脈沖重復(fù)頻率大于70兆赫茲，脈沖寬度小于100飛秒；光束耦合裝置包括一個(gè)焦距為150毫米的凸透鏡、兩個(gè)平面反射鏡及可旋轉(zhuǎn)偏振片和快門裝置；倒置顯微鏡主體基于Olympus公司生物倒置顯微鏡；監(jiān)控系統(tǒng)包括目鏡以及與計(jì)算機(jī)相連的CCD相機(jī)，進(jìn)行紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的融合，其特征在于包括以下過程1將收集的對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，置于含有30～70mmol/L二硫蘇糖醇和20～60mmol/L乙二胺四乙酸的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液中，于18～25℃處理10～30min，離心分離，收集紅發(fā)夫酵母細(xì)胞。
2將經(jīng)步驟1預(yù)處理后的細(xì)胞加入到由質(zhì)量百分比為1～4％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液組成的pH為8的高滲酶液中，于18～25℃處理5～20小時(shí)，離心分離，用含0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液洗滌去除葡聚糖酶，收集紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體。
3將步驟2所制得的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)到含有質(zhì)量百分比為1～10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液組成的溶液中，紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體濃度為2.5～12.5×106/mL。向融合液中加入熒光素雙醋酸酯(FDA)，融合液中的熒光素雙醋酸酯濃度為0.1mg/ml。將融合液加入融合池后，置于顯微鏡的載物臺(tái)上。
4在熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的熒光，選擇一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為融合目標(biāo)1。對(duì)所選中的目標(biāo)1紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體施加功率為5～20mW的激光，捕捉固定。再選擇另一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為融合目標(biāo)2，由計(jì)算機(jī)控制顯微鏡的載物臺(tái)的作前后和左右移動(dòng)，使目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的靠近，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體接觸。然后，再控制顯微鏡的載物臺(tái)的前后和左右移動(dòng)，使激光焦點(diǎn)所在的軸線與目標(biāo)1和目標(biāo)2的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ校僬{(diào)節(jié)物鏡焦距，使光束焦點(diǎn)在上下軸線方向與目標(biāo)1和目標(biāo)2的兩原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ泻?，采用功率?0～100mW的飛秒光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸區(qū)域達(dá)67.5～250ms，并由顯微鏡目鏡或通過CCD對(duì)整個(gè)融合過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。
5待目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體經(jīng)過150～180分鐘后，融合成一個(gè)大的細(xì)胞后，再用玻璃微管將此由融合得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白凍、3g/L酵母粉、3g/L麥芽汁和質(zhì)量百分比為1.5％的瓊脂組成的固體培養(yǎng)基平板上，22℃培養(yǎng)，觀察，當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落時(shí)說明細(xì)胞成活，融合成功。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠在單細(xì)胞水平進(jìn)行選擇性細(xì)胞融合，細(xì)胞融合率遠(yuǎn)高于PEG法；由于使用光鑷預(yù)先選擇活性較大的細(xì)胞，更因?yàn)轱w秒激光的高分辨率，激光作用時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)部沒有損傷，融合子的再生率也較高；另外，本方法能對(duì)整個(gè)融合過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，便于融合子的檢出以及在單細(xì)胞水平作進(jìn)一步的分析。


圖1-為實(shí)例1中已經(jīng)完成接觸的兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的照片。
圖2-為實(shí)例1中兩個(gè)緊密接觸的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體在經(jīng)過飛秒激光照射處理后的第23分鐘，兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體已經(jīng)發(fā)生部分融合的照片。
圖3-為實(shí)例1中兩個(gè)緊密接觸的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體在經(jīng)過飛秒激光照射處理后的第90分鐘，兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的融合已經(jīng)完成一半的照片。
圖4-為實(shí)例1中兩個(gè)緊密接觸的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體在經(jīng)過飛秒激光照射處理后的第160分鐘，兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體已經(jīng)融合成一個(gè)大的細(xì)胞的照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)例1調(diào)整飛秒脈沖激光器，使其進(jìn)入鎖模狀態(tài)，產(chǎn)生輸出脈沖重復(fù)頻率大于70兆赫茲，脈沖寬度小于100飛秒的飛秒脈沖激光光束。通過調(diào)整光束耦合裝置中的平面反射鏡調(diào)節(jié)飛秒脈沖激光光束的方向，使其光軸與顯微鏡成像光路的光軸完全重合，將飛秒脈沖激光光束耦合進(jìn)入顯微鏡中。
將收集的對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，置于含有50mmol/L二硫蘇糖醇和40mmol/L乙二胺四乙酸的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液中，于22℃處理10min，離心分離，收集紅發(fā)夫酵母細(xì)胞。
將預(yù)處理后的細(xì)胞加入到由質(zhì)量百分比為1％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液組成的pH為8的高滲酶液中，于22℃靜止處理20小時(shí)，離心分離，用含0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液洗滌去除葡聚糖酶，收集紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體。
將制得的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)到含有質(zhì)量百分比為10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液組成的溶液中，紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體濃度為2.5×106/mL。向融合液中加入熒光素雙醋酸酯(FDA)，融合液中的熒光素雙醋酸酯濃度為0.1mg/ml。將融合液加入融合池置顯微鏡的載物臺(tái)上。
在熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的熒光，選擇一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為融合目標(biāo)1。對(duì)所選中的目標(biāo)1紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體施加激光，實(shí)現(xiàn)光鑷對(duì)該目標(biāo)1紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體捕捉固定。再選擇另一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為另一融合目標(biāo)2，由計(jì)算機(jī)控制顯微鏡的載物臺(tái)的前后和左右移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的靠近，直至目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體接觸。接觸后，再控制顯微鏡的載物臺(tái)的前后和左右移動(dòng)，使激光焦點(diǎn)所在的軸線與目標(biāo)1和目標(biāo)2的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ校僬{(diào)節(jié)物鏡焦距，使光束焦點(diǎn)在上下軸線方向與目標(biāo)1和目標(biāo)2的兩原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ泻?，采用功率?0mW的飛秒激光光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸區(qū)域250ms。激光的功率由調(diào)整耦合裝置中的旋轉(zhuǎn)偏振片控制，光束的作用時(shí)間由整耦合光路中的快門控制。由顯微鏡目鏡或通過CCD對(duì)整個(gè)融合過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，并通過圖像采集裝置記錄細(xì)胞融合的全過程。
待目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體已經(jīng)融合成一個(gè)大的細(xì)胞，即融合過程基本完成后，用玻璃微管將此由融合得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白凍、3g/L酵母粉、3g/L麥芽汁和質(zhì)量百分比為1.5％的瓊脂組成的固體培養(yǎng)基平板上，22℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況。
實(shí)例2收集對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，用50mmol/L的二硫蘇糖醇和40mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的預(yù)處理液，22℃處理15min。轉(zhuǎn)入含2％葡聚糖酶的高滲酶液中22℃振蕩處理7小時(shí)，收集原生質(zhì)體。
使融合液中原生質(zhì)體濃度為5×106/mL，PEG重量百分比濃度為10％。采用功率為50mW的光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域250ms。
實(shí)例3收集對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，用30mmol/L的二硫蘇糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的預(yù)處理液，23℃處理20min。轉(zhuǎn)入含2％葡聚糖酶的高滲酶液靜止中23℃處理16小時(shí)，收集原生質(zhì)體。
使融合液中原生質(zhì)體濃度為10×106/mL，PEG為重量百分比濃度5％。采用功率為55mW的光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域125ms。
實(shí)例4收集對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，用60mmol/L的二硫蘇糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的預(yù)處理液，23℃處理15min。轉(zhuǎn)入含1％葡聚糖酶的高滲酶液中23℃振蕩處理15小時(shí)，收集原生質(zhì)體。
使融合液中原生質(zhì)體濃度為10×106/mL，PEG為重量百分比濃度5％。采用功率為55mW的光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域125ms。
實(shí)例5
收集對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，用60mmol/L的二硫蘇糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的預(yù)處理液，25℃處理10min。轉(zhuǎn)入含1％葡聚糖酶的高滲酶液中23℃振蕩處理15小時(shí)，收集原生質(zhì)體。
在融合液中原生質(zhì)體濃度為12×106/mL，PEG為重量百分比濃度5％。采用功率為55mW的光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域125ms。
實(shí)例6收集對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，用30mmol/L的二硫蘇糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的預(yù)處理液，23℃處理15min。轉(zhuǎn)入含2％葡聚糖酶的高滲酶液靜止中23℃處理16小時(shí)，收集原生質(zhì)體。
使融合液中原生質(zhì)體濃度為12.5×106/mL，PEG為重量百分比濃度1％。采用功率為60mW的光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域125ms。
權(quán)利要求
1.一種飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法，該方法采用飛秒激光顯微操作系統(tǒng)實(shí)施，所述飛秒激光顯微操作系統(tǒng)包括飛秒脈沖激光器、光束耦合裝置、倒置顯微鏡和監(jiān)控系統(tǒng)；所述飛秒脈沖激光器為摻鈦藍(lán)寶石自鎖模飛秒激光振蕩級(jí)，輸出脈沖重復(fù)頻率大于70兆赫茲，脈沖寬度小于100飛秒；光束耦合裝置包括一個(gè)焦距為150毫米的凸透鏡、兩個(gè)平面反射鏡及可旋轉(zhuǎn)偏振片和快門裝置；倒置顯微鏡主體基于奧林巴斯公司生物倒置顯微鏡；監(jiān)控系統(tǒng)包括目鏡以及與計(jì)算機(jī)相連的CCD相機(jī)，進(jìn)行紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的融合，其特征在于包括以下過程1)將收集的對(duì)數(shù)生長期的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，置于含有30～70mmol/L二硫蘇糖醇和20～60mmol/L乙二胺四乙酸的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液中，于18～25℃處理10～30min，離心分離，收集紅發(fā)夫酵母細(xì)胞；2)將經(jīng)步驟1)預(yù)處理后的細(xì)胞加入到由質(zhì)量百分比為1～4％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液組成的pH為8的高滲酶液中，于18～25℃處理5～20小時(shí)，離心分離，用含0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的水溶液洗滌去除葡聚糖酶，收集紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體；3)將步驟2)所制得的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)到含有質(zhì)量百分比為1～10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化鉀和0.02mol/L氯化鈣的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液組成的溶液中，紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體濃度為2.5～12.5×106/mL，向融合液中加入熒光素雙醋酸酯，融合液中的熒光素雙醋酸酯濃度為0.1mg/ml，將融合液加入融合池后，置于顯微鏡的載物臺(tái)上；4)在熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的熒光，選擇一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為融合目標(biāo)1，對(duì)所選中的目標(biāo)1紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體施加功率為5～20mW的激光，捕捉固定，再選擇另一個(gè)熒光強(qiáng)的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體作為另一融合目標(biāo)2，由計(jì)算機(jī)控制顯微鏡的載物臺(tái)的前后和左右移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的靠近，直至目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體接觸，再控制顯微鏡的載物臺(tái)的前后和左右移動(dòng)，使激光焦點(diǎn)所在的軸線與目標(biāo)1和目標(biāo)2的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ?，再調(diào)節(jié)物鏡焦距，使光束焦點(diǎn)在上下軸線方向與目標(biāo)1和目標(biāo)2的兩原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸的區(qū)域?qū)χ泻?，采用功率?0～100mW的飛秒光束，照射細(xì)胞膜緊密接觸區(qū)域67.5～250ms；5)待目標(biāo)1和目標(biāo)2兩個(gè)紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體經(jīng)過150～180分鐘后，融合成一個(gè)大的細(xì)胞后，再用玻璃微管將此由融合得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白凍、3g/L酵母粉、3g/L麥芽汁和質(zhì)量百分比為1.5％的瓊脂組成的固體培養(yǎng)基平板上，22℃培養(yǎng)，觀察，當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落時(shí)說明細(xì)胞成活，融合成功。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種飛秒激光融合紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體的方法，屬于細(xì)胞融合技術(shù)。該方法采用飛秒激光顯微操作系統(tǒng)實(shí)施，其過程包括，對(duì)數(shù)期紅發(fā)夫酵母用含二硫蘇糖醇和乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖液預(yù)處理；用由葡聚糖酶、氯化鉀和氯化鈣的水溶液組成的酶液，制原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體與聚乙二醇、氯化鉀、氯化鈣和磷酸鹽緩沖液組成融合液，并加入熒光素雙醋酸酯；以5～20mW的光鑷為工具，實(shí)現(xiàn)熒光較強(qiáng)兩目標(biāo)原生質(zhì)體接觸；調(diào)整激光光束的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)兩原生質(zhì)體細(xì)胞膜緊密接觸區(qū)，50～100mW照射67.5～250ms；兩目標(biāo)原生質(zhì)體完全融合后，分離，培養(yǎng)。本發(fā)明細(xì)胞融合率高，融合后細(xì)胞的活性高，融合子易于檢出以及能對(duì)融合過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和記錄。
文檔編號(hào)C12N15/04GK1970748SQ20061012992
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者邢岐榮, 鞏繼賢, 李寰宇, 田震, 趙學(xué)明, 柴路, 王清月 申請(qǐng)人:天津大學(xué)