專利名稱：酵母細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從廢棄啤酒酵母菌中提取酵母細(xì)胞壁{3-1，3-葡聚糖的方法。
背景技術(shù)：
糖類是生物體的主要成分之一，而多糖是除蛋白質(zhì)、核酸外的又 一高分子化合物，在生物活性物質(zhì)研究蓬勃發(fā)展的今天，多糖由于其 獨(dú)特的生物功能，己成為備受重視的功能因子之一。
真菌葡聚糖重要的來(lái)源是啤酒酵母(&cc/2ara^y cescerv/Mae )， ^cweWs/^是人類使用的最古老的微生物之一，它安全無(wú)毒，在食 品和醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。酵母細(xì)胞能利用廉價(jià)的培養(yǎng)基，繁殖 快，生物量收率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。酵母細(xì)胞被細(xì)胞壁包圍， 一般地，酵母細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的20 25 %，它呈三明治狀——外 層為甘露聚糖(mannan)，內(nèi)層為葡聚糖(glucan)，都是分枝狀聚合 物，中間夾著一層蛋白質(zhì)(包括多種酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶等)。
酵母的細(xì)胞壁主要由以下成分組成①具有P (1—6)鍵合的葡 聚糖側(cè)鏈的原纖維的堿不溶性p (1—3)鍵合的葡聚糖；②具有卩
(1—6)鍵合的葡聚糖側(cè)鏈的堿溶性P (1—3)鍵合的葡聚糖；③具 有間歇性的P (1—3)鍵的不定型的酸溶性的P (1—6)葡聚糖；
連接到蛋白質(zhì)的不定型的堿溶性的甘露聚糖。細(xì)胞壁中(3-l，3-葡聚糖 占多糖的50%—60%，表明酵母細(xì)胞壁是|3-1,3-葡聚糖較好的提取原 料。
目前對(duì)啤酒廢酵母的綜合利用，多集中在對(duì)其蛋白質(zhì)、核酸、維 生素、微量元素和酶方面，研究最多的是從酵母中回收蛋白質(zhì)和可溶 性營(yíng)養(yǎng)物制作營(yíng)養(yǎng)添加劑和調(diào)味品。
卩-1， 3-葡聚糖(卩-l,3-D-glucan)是以葡萄糖為基本單位，通過(guò) (1-3)-卩-D—糖苷鍵連接而成的一類高分子化合物。它廣泛存在于 細(xì)菌、酵母、蘑燕、谷類和海藻中，系(3-l，3-D-吡喃型葡聚糖聚合物， 呈梳子狀結(jié)構(gòu)，(1—3) -p-主鏈和(1—6)-卩-分支是其免疫活性所必 需的。
目前P-l，3-葡聚糖的制備方法有以下三種
1、 國(guó)外報(bào)道
Masler等(1986)報(bào)道了酸堿處理制備酵母卩-l，3-葡聚糖的方法 將lkg壓搾酵母分散到1.5L 、 6%(w/v)NaOH溶液，60"C攪拌4h。 然后加入1L水，1200g離心20min ，收集沉淀。沉淀再分散到1. 5L、 3Q/o(w/v)NaOH溶液，90。C保溫2h ， 1200g離心20 min，收集沉淀。 沉淀用200mL水洗3遍。室溫下，用200mL、 4%(w/v)HCl浸提2遍， 每遍2h， 1200g離心20min，收集沉淀，干燥后得到P-l，3-葡聚糖產(chǎn)品。 Williams等作了一些修改S.ce^v/w^分散到3 °/。 (w/v) NaOH溶液， 75X:攪拌2h ，自然冷卻，繼續(xù)攪拌5h,離心，棄上清，沉淀再分散 到3。/。(w/v)NaOH溶液75。C下攪拌lh ，自然冷卻至室溫，繼續(xù)攪拌 3h，加水過(guò)夜。離心，棄上清，沉淀再分散到3。/。(w/v)NaOH ， 75 。C攪拌lh ，用HC1調(diào)至pH4.5，離心，棄上清，沉淀依次用水、無(wú) 水乙醇和無(wú)水乙醚洗滌數(shù)次，37。C下干燥。傳統(tǒng)的p-l，3-葡聚糖制備 方法是基于酸堿反復(fù)萃取，這種方法明顯不足在于酸、堿試劑用量大、 產(chǎn)物雜質(zhì)含量高、耗時(shí)和環(huán)境污染大。從真菌細(xì)胞提取的|3-1,3-葡聚 糖仍含有5 10%的雜質(zhì)，主要是蛋白質(zhì)和甘露聚糖等多糖。
2、 國(guó)內(nèi)研究
將新鮮酵母300g(相當(dāng)于重100g)懸浮于l L， 1 mol/LNaOH溶液 中，IOO 。C下劇烈攪拌l h冷卻至40 50。C， 3000 rpm離心15 min，棄 上清液，不溶物用1L、 0.75mol/LNaOH溶液重新懸浮，加熱至10(TC 維持15min， 3000 rpm離心去上清，沉淀用1L、 0. 75 mo1/L NaOH溶 液重新懸浮，加熱至10(TC維持15min，冷卻后用HCl調(diào)節(jié)至pH 4. 5， 然后用200mL蒸餾水洗滌2遍，200mL無(wú)水乙醇脫水2次，再用200mL 無(wú)水乙醚脫水，37 。C下風(fēng)干12 h，獲得堿不溶性(3-l，3-葡聚糖。使用 無(wú)水乙醚一方面可以脫水，另一方面還能脫脂，用皂化法檢測(cè)不出脂 肪。用酸一堿法制備P-l，3-葡聚糖，0. 75mol/LNaOH在100 。C下作用 2h。能有效地去除甘露糖蛋白，0.75mol/L硫酸提高了P-l，3-葡聚糖 的比粘度，制備的P-l，3-葡聚糖不溶于水、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但 能在二甲基亞砜中形成穩(wěn)定的懸濁液，亦可溶于發(fā)煙鹽酸。從啤酒廢 酵母泥中提取的酵母多糖溶液為粘稠的膠體，表現(xiàn)為非牛頓假塑性, 其溶液的粘度隨溫度升高、受熱時(shí)間延長(zhǎng)而下降。
3、自溶法生產(chǎn)葡聚糖
將新鮮酵母300g (相當(dāng)于干重100g)懸浮于lLlmol/L的NaOH溶 液中，100。C下劇烈攪拌lh，自溶的酵母細(xì)胞冷卻至40 5(TC， 3 000rpm/min離心15min，去上清液。自溶的酵母細(xì)胞用1L 0. 75mol/L 的NaOH溶液重新懸浮，直接加熱至100。C維持15min， 3000 rpm/min 離心去上清液，溶解的酵母細(xì)胞再用1L 0. 75 mol/L的NaOH溶液重復(fù) 提取一次，降至70'C保溫16h，冷卻后用HCl調(diào)pH至4. 5， 3 000 rpm/min 離心去上清液，用200mL蒸餾水懸浮煮沸10min，重復(fù)兩次，離心去 上清液，200mL無(wú)水乙醇分兩次脫水，再用200mL無(wú)水乙醚脫水，37 'C下風(fēng)干12h，得堿不溶性葡聚糖，稱為酵母葡聚糖。
酵母泥預(yù)處理—水洗，離心—自溶—離心，沉淀溶于水中—超聲 波粉碎—木瓜蛋白酶，pH7.0， 55°C，酶解—離心—沉淀—堿溶—離 心—沉淀水洗—無(wú)水乙醇洗滌—抽提—烘干
以上方法存在下列不足之處1、原料問題文獻(xiàn)報(bào)道中有的實(shí) 驗(yàn)采用新鮮酵母為原料，這樣的原料來(lái)源不便，成本較高。2、工藝 問題文獻(xiàn)報(bào)道大部分為實(shí)驗(yàn)室小量試驗(yàn)，很少有工業(yè)化規(guī)模的研究 的報(bào)道， 一些工藝不便于工業(yè)化規(guī)模使用。3、后處理問題大量的 酵母經(jīng)過(guò)處理后形成了可溶性物質(zhì)和葡聚糖混合的狀態(tài)，如果通過(guò)離 心的方式進(jìn)行分離，則要大型的離心設(shè)備，并且消耗大量的電能。4、 干燥問題已有方法在后處理過(guò)程中多采用有機(jī)溶劑進(jìn)行脫水，工業(yè) 化生產(chǎn)有易燃易爆的危險(xiǎn)。 發(fā)明的內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酵母細(xì)胞壁(3-1， 3-葡聚糖制備方法， 該方法的工藝簡(jiǎn)單，有效地降低成本，并且可工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種酵母細(xì)胞壁P-1， 3-葡聚糖的制備方 法，其特征在于依照如下步驟完成1)雜質(zhì)處理將酵母干粉分 散于水中，酵母干粉與水的質(zhì)量比為1: 1.5——1: 20攪拌使其充分 混合，通過(guò)60—100目篩過(guò)濾除去其中的雜質(zhì)；如果原料為酵母懸液， 則直接通過(guò)60—100目篩過(guò)濾除去其中的雜質(zhì)；2)堿處理向過(guò)濾
后的酵母懸液中加入堿，使懸液中堿的濃度達(dá)到0.5—7%,升溫到96
—121°C，攪拌轉(zhuǎn)速10 — 500轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)l一7小時(shí)，靜置過(guò)夜，棄 去上清液，再加入水和堿，使堿最終濃度仍為0.5—7°/。，加熱到96 —121°C，反應(yīng)時(shí)間為1—7小時(shí)；3)清洗靜置使葡聚糖沉降，棄 去上清液，再將沉淀物加水混勻，靜置0.2—48小時(shí)，利用虹吸的方 法吸去上清液，如后反復(fù)清洗，每次靜置0.2—48小時(shí)，直到上清液 澄清透明無(wú)雜質(zhì)，且pH值到7—8為止；4)噴霧干燥將清洗后的 酵母葡聚糖經(jīng)均質(zhì)后，濃縮到噴霧干燥設(shè)備要求的濃度范圍，通過(guò)噴 霧干燥設(shè)備進(jìn)行噴霧干燥，最終得到卩-1， 3-葡聚糖固體粉末。 本發(fā)明還可以采用如下技術(shù)措施
上述堿采用NaOH或KOH。
上述雜質(zhì)處理步驟中采用80目篩子進(jìn)行過(guò)濾。 上述堿處理步驟中堿的濃度為4%，溫度為IO(TC，攪拌轉(zhuǎn)速350 轉(zhuǎn)/min,反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)；第二次處理堿濃度為4%，溫度為IO(TC， 時(shí)間為l-7小時(shí)；靜置時(shí)間為3-12小時(shí)，pH為7-8。
上述雜質(zhì)處理和堿處理步驟之間可以增加酶處理工藝，酶的加入 量為3-30AU/千克蛋白，處理時(shí)間在O.l小時(shí)-10小時(shí)之間，處理溫度 在50-60。C之間，pH值為7-10。
上述酶采用堿性蛋白酶。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明采用的是啤酒工業(yè)和酒精工業(yè)廢棄 的酵母菌，這樣的原料量大、成本低廉且較易獲得，并且有廢棄物利 用的社會(huì)效益。2、本發(fā)明所述方法較其它方法省去了很多步驟，有
助于降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本。3、本發(fā)明所述的操作過(guò)程簡(jiǎn)單，易于 實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，使用的設(shè)備較簡(jiǎn)單。4、原料中蛋白去除率高，產(chǎn) 物P-l, 3-葡聚糖的得率和純度較高。5、本發(fā)明根據(jù)葡聚糖在水中和 堿液中都不溶的特點(diǎn)，采用自然沉降的方式進(jìn)行分離，并且用虹吸的 方式分離上清液，這樣有利于節(jié)省設(shè)備投資，降低生產(chǎn)成本。6、酶 處理?xiàng)l件溫和，對(duì)葡聚糖的生物活性沒有任何破壞。由于酶對(duì)蛋白的 降解，對(duì)于后處理具有明顯的優(yōu)勢(shì)。


圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均勻后，通過(guò)80目篩去 除麥皮等雜質(zhì)，然后加入NaOH，使NaOH終濃度為4%，加熱到 IO(TC， 350轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)3h，靜置過(guò)夜，次日棄去上清液，倒入 與棄去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其終濃度為4。/。，加熱 到10(TC， 350轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)3h，靜置棄去上清液，倒入清水，反 復(fù)洗滌得到的沉降物，經(jīng)噴霧干燥得到葡聚糖。
實(shí)施例2:
取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均勻后，通過(guò)60目篩去 除麥皮等雜質(zhì)，然后加入NaOH，使NaOH終濃度為4.5%，加熱到 ll(TC， 300轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)3.5h，靜置過(guò)夜，次日棄去上清液，倒 入與棄去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其終濃度為5。/。，加 熱到110'C， 350轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)3h，靜置棄去上清液，倒入清水， 反復(fù)洗滌得到的沉降物，經(jīng)噴霧干燥得到葡聚糖。
實(shí)施例3:
取lKg啤酒千酵母加入4.5升水，混合均勻后，通過(guò)80目篩去 除麥皮等雜質(zhì)，然后加入NaOH調(diào)節(jié)pH值到8，加入堿性蛋白酶， 于55'C反應(yīng)2小時(shí)；加入5L清水，然后加入NaOH使懸液濃度為 1%，加熱到10(TC， 300轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)3h ，靜置棄去上清液，倒 入清水，反復(fù)洗滌得到的沉降物，經(jīng)噴霧干燥得到葡聚糖。
權(quán)利要求
1. 一種酵母細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖的制備方法，其特征在于依照如下步驟完成1)雜質(zhì)處理將酵母干粉分散于水中，酵母干粉與水的質(zhì)量比為1∶1.5——1∶20攪拌使其充分混合，通過(guò)60-100目篩過(guò)濾除去其中的雜質(zhì)；如果原料為酵母懸液，則直接通過(guò)60-100目篩過(guò)濾除去其中的雜質(zhì)；2)堿處理向過(guò)濾后的酵母懸液中加入堿，使懸液中堿的濃度達(dá)到0.5-7％，升溫到96-121℃，攪拌轉(zhuǎn)速10-500轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)1-7小時(shí)，靜置過(guò)夜，棄去上清液，再加入水和堿，使堿最終濃度仍為0.5-7％，加熱到96-121℃，反應(yīng)時(shí)間為1-7小時(shí)；3)清洗靜置使葡聚糖沉降，棄去上清液，再將沉淀物加水混勻，靜置0.2-48小時(shí)，利用虹吸的方法吸去上清液，如后反復(fù)清洗，每次靜置0.2-48小時(shí)，直到上清液澄清透明無(wú)雜質(zhì)，且pH值到7-8為止；4)噴霧干燥將清洗后的酵母葡聚糖經(jīng)均質(zhì)后，濃縮到噴霧干燥設(shè)備要求的濃度范圍，通過(guò)噴霧干燥設(shè)備進(jìn)行噴霧干燥，最終得到β-1，3-葡聚糖固體粉末。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞壁卩-1 ， 3-葡聚糖的制備方法， 其特征在于上述堿采用NaOH或KOH。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞壁(3-1， 3-葡聚糖的制備方法， 其特征在于上述雜質(zhì)處理步驟中釆用80目篩子進(jìn)行過(guò)濾。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞壁p-l，3-葡聚糖的制備方法， 其特征在于上述堿處理步驟中堿的濃度為4%，溫度為IO(TC，攪 拌轉(zhuǎn)速350轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)；第二次處理堿濃度為4%， 溫度為10℃，時(shí)間為1-7小時(shí)；靜置時(shí)間為3-12小時(shí)，pH為7-8。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母細(xì)胞壁(3-1， 3-葡聚糖的制備方法， 其特征在于上述雜質(zhì)處理和堿處理步驟之間可以增加酶處理工藝， 酶的加入量為3-30AU/千克蛋白，處理時(shí)間在0.1小時(shí)-10小時(shí)之間， 處理溫度在50-6(TC之間，pH值為7-10。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的酵母細(xì)胞壁(3-1 ，3-葡聚糖的制備方法， 其特征在于上述酶采用堿性蛋白酶。
全文摘要
一種酵母細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖的制備方法，依照如下步驟完成1)雜質(zhì)處理將酵母干粉分散于水中，過(guò)濾除去其中的雜質(zhì)；2)堿處理向過(guò)濾后的酵母懸液中加入堿，使懸液中堿最終濃度仍為0.5-7％；3)清洗利用虹吸的方法吸去上清液，直到上清液澄清透明無(wú)雜質(zhì)，且pH值到7-8為止；4)噴霧干燥最終得到β-1，3-葡聚糖固體粉末。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本。2.操作過(guò)程、使用的設(shè)備簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3.原料中蛋白去除率高，產(chǎn)物β-1，3-葡聚糖的得率和純度較高。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101205552SQ200610130420
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者儲(chǔ)兆坤, 姜文俠, 張英筠, 王海燕, 吶 魏 申請(qǐng)人:天津市工業(yè)微生物研究所