專利名稱：：同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定其藥物抗性的方法及所用材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和醫(yī)學(xué)，并且提供在區(qū)分性生物芯片上在臨床樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(A^co6ac"W咖fu6ercu7os/s)復(fù)合體(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M6or")、牛分枝桿菌沉K、非洲分枝桿菌OKa/Wca/7咖)、和田鼠分枝桿菌OK邊/cron"))并同時(shí)評(píng)價(jià)菌#*1"利福平和異煙肼的敏感性的方法.
背景技術(shù)：
：下面的方法通常用于;j^測(cè)產(chǎn)生藥物拔汰的突變I.W苷酸多態(tài)性(SNP);DubileyS"KirillovE和A.Mirzabekov-1999.Polymorphismanalysisandgenedetectionbyminisequencingonanarrayofgel-immobilizedprimers./Vi/c/e/c義c油Aesearc力，Vol.27，No.18(el9).MarthGT，KorfI，YandellMD等人，1999.Ageneralapproachtosingle-nucleotidepolymorphismdiscovery.A^"e/2e^，Dec;23(4):452-456.II.等錄因特?cái)侾CR;DelosMonterasL.E,E.，J.C.Galan，M.Gutierrez,S，Samper,J.F.G.Marin,C*Martin,L,Doninguez，LdeRafael,F.Baquero，E.Gomez-Mampaso和J.Blazquez.1998.Allele-SpecificPCRMethodBasedonand0jr7及SequencesforDistinguishing妙c06a"e"'咖6of!from妙co6a"e/7咖^e/w/os/s:Intraspecific乂6of/s;wc^SequencePolymorphism./.Wcro6/o厶36:，239—242.III.限制性片段M多態(tài)性(RFLP);PCR-RFLPDetectionofpointMutationsintheCatalase-PeroxidaseGene(ir"6)of妙co^s"eW咖fw6ercw/o"'sAssociatedwithIsoniazidResistance.In:PCRProtocolsforEmergingInfectiousDiseases(D.H.Persing，Ed.)(1996)ASMPress,Washington,pp.144-149.IV.單"^(雙)^^i象多態(tài)性(SSCP和DSCP);DelgadoM.B.和A.Telenti.DetectionofFluoroquinoloneResistanceMutationsin妙co6a"er/咖"6ercw/o57s.In:PCRProtocolsforEmergingInfectiousDiseases(D.H.Persing，Ed.)(1996)ASMPress,Washington,pp.138-143.PretoriusG.S.，P.D.vanHelden，F(xiàn).Sirgel，K.D.Eisenach和T.C.Victor.1995.MutationsinGeneSequencesinIsoniazid-ResistantClinicalIsolatesof妙co6a"er/咖fu6ercf//c".sAreRare,爿/7〃邁/.c/^6.々e/"C力e邊c^力ei".，39，10，2276-2281.V.在高密度微P車列上的雜交；TroeschA，NguyenH，MiyadaCG等人，妙co6a"er/咖speciesidentificationandrifampinresistancetestingwithhigh-densityDMprobearrays./飾roWo/1999;37:49-55.W.Sougakoff，M.Rodrigue,C.Truffot-Pernot，M.Renard，N.Durin，M.Szpytma,R.Vachon，A.Troesch和V.Jarlier.Useofahigh-densityDMprobearrayfordetectingmutationsinvolvedinrifampicinresistancein妙co6a"er/咖Mercw/c^/s.脅roWo//o/^.2004;10(4):289-94.VI.在專門的M苷酸微陣列上的雜交；JunYue，WeiShi，JingpingXie,YaoLi，ErliangZeng和HonghaiWang,Detectionofrifampin-resistantMercw/o"'sstrainsbyusingaspecializedoligonucleotidemicroarray.i/a卵#2'cro6/o72004;48:47-54.GryadimovD.A.，MikhailovichV.M.，LapaS.A.，RoudinskiiN.I.，BarskiiV.E.，ChudinovA.V.，ZasedatelevA.S.，MirzabekovA.D.Identificationof妙co6s"er/咖tw6ercw/os/sstrainswithsimultaneousevaluationoftheirdrug-resistancebyhybridizationmethodonoligonucleotidemicroarrays.M/ei7;/yar刀a7age"e〃h,范/iro6/o/og/",r/r^o/o^r>a2003;(4):24-27(在俄羅斯)VII.J^于測(cè)序的方法；Kapur，V.，L.-L.Li，S.Iordanescu,M.R.Hamrick,A.Wanger，B.N.Kre-iswirth和J.M.Musser.1994.Characterizationbyautomated歸sequencingofmutationsinthegene(r/w歷encodingtheRNApolymerasebsubimitinrifampin-resistant妙c06a"er/咖^e"w/o"'sstrainsfromNewYorkCityandTexas./.#2'"oWW.32:1095—1098.CavusogluC，Karaca-DericiY,BilgicA.In-vitroactivityofrifabutinagainstrifampicin-resistant妙c06a"eri咖^era//(751/^isolateswithknownrpoBmutations.C7/"#/cro6/o///2/"e".2004;10(7):662-5.VIII.W^旨,(ddF法)；RysP.N.和T.A.Felmlee.DetectionofRifampicinResistanceMutationsin妙c06a"eri咖^ercw7o".sbyDideoxyFingerprinting.In:PCRProtocolsforEmergingInfectiousDiseases(D.H.Persing,Ed.)(1996)ASMPress,Washington,pp.112-121.IX.PCR-異源雙鏈體分析；WilliamsD丄，C.W.Limbers,LSpring,S.Jayachandra和T.P.Gillis.PCR-HeteroduplexDetectionofRifampicin-Resistant妙co^s"e".咖"6ercw/(57V，In:PCRProtocolsforEmergingInfectiousDiseases(D.H.Persing，Ed.)(1996)ASMPress,Washington,pp.122-129.X.RNA錯(cuò)配線Dracopoli，N.C.Ed."DetectionofMutationsbyRNaseCleavage".CurrentProtocolsinHumanGenetics.1998.JohnWiley&Sons,Inc.MarthGT，KorfI，YandellMD等人，1999.Ageneralapproachtosingle-nucleotidepolymorphismdiscovery.toef.，Dec;23(4):452-456.XI.結(jié)構(gòu)特異f誠(chéng)酸內(nèi)切S^刀割；BrowM.A.D.，M.C.Oldenburg,V.Lyamichev，LM.Heisler，N.Lyamicheva,J.G.Hall,N.J.Eagan，D.M.Olive,L.M.Smith,L.Fors和J.E.Dahlberg.1996.DifferentiationofBacterial16SrRNAGenesandIntergenicRegionsand妙co6a"er/咖fi/6ercu/os/sir"CGenesbyStructure-SpecificEndonucleaseCleavage./,C7i/i.肌croWo厶，34:3129-3137.XII.線型探針分析(LiPA);RossauR，TraoreH，DeBeenhouwerH，MijsW，JannesG,DeRijkP,PortaelsF.EvaluationoftheINNO-LiPARif.TBassay,areversehybridizationassayforthesimultaneousdetectionof妙co6a"er/咖fw6ercu/o57scomplexanditsresistancetorifampin.顛/邊/"o6Jge/z"Cft騰Mer1997;41:2093-2098.DrobniewskiFA，WattersonSA，WilsonSM，HarrisGS.Aclinical,microbiologicalandeconomicanalysisofanationalUKservicefortherapidmoleculardiagnosisoftuberculosisandrifampinresistancein妙co6a"er/咖fw6ercu/oWs./#ed#2'"oWo72M《49:271-278.XIII.基于噬菌體的方法(PhaB分析)；Wilson,S.M.,Z.Al-S飄idi，R.McNerney，J.Porter和F.Drobniewski.1997,Evaluationofanewrapidbacteriophage-basedmethodforthedrugsusceptibilitytestingof妙co6a"er/咖Z^ercw/o".s.射.3:465-468，XIV.切割酶片段狄多態(tài)性(CFLP);SreevatsanS，BookoutJB，RingpisFM，MogazehSL,KreiswirthBN，PottathilRR，BarathurRR.1998.ComparativeEvaluationofCleavaseFragmentLengthPolymorphismWithPCR-SSCPandPCR-RFLPtoDetectAntimicrobialAgentResistancein妙co6a"eW咖Mercy/os/s.#0/1998Jun;3(2):81-91.XV.基于連接的分析；MikhailovichV.，LapaS.，GryadunovD.，SobolevA.，StrizhkovB.，ChernyhN.，Skotnikova0.，Irtuganova0.，MorozA.，LitvinovV.，VladimirskiiM.，PerelmanM.，ChernousovaL，ErokhinV.，ZasedatelevA.和MirzabekovA.2001.Identificationofrifampin-resistant炒co^s"e"'咖Me_rcw/o"'sstrainsbyhybridization,PCR，andligasedetectionreactiononoligonucleotidemicrochips./C7/o.#/cro6/o/.39:2531-2540.XVI.實(shí)時(shí)PCR;MarinM，GarciadeViedmaD，Ruiz-SerranoMJ，BouzaE，Rapiddirectdetectionofmultiplerifampinandisoniazidresistancemutationsin妙c06a"er/咖z^6ercw/o"'sinrespiratorysamplesbyreal-timePCR.^2〃邊/cro6J卿"CA師Mer.2004Nov;48(11):4293-300.XVII.翻質(zhì)譜法的差異測(cè)序；Griffin,T.J，和L.M.Smith.2000.SinglenucleotidepolymorphismanalysisbyMALDI-TOFmassspectrometry.7>e/2c^5/otec力/20/.18:77—84.XVIII.熒>^*能量絲；ViedmaG.D.，delSolDiazInfantesM,LasalaF，ChavesF，AlcalaL,BouzaE.2002.NewRea卜TimePCRAbleToDetectinaSingleTubeMultipleRifampinResistanceMutationsandHigh-LevelIsoniazidResistanceMutationsin妙c06a"er/咖fw6erctf/o"'51./C7/力臉ro6/o人40(3):988-95.XIX.在絲苷酸微芯片上的PCR,MikhailovichV.，LapaS.,GryadunovD.，SobolevA.，StrizhkovB.,ChernyhN.，Skotnikova0.，Irtuganova0.，MorozA.,UtvinovV.，VladimirskiiM.，PerelmanM.，ChernousovaL.，ErokhinV.，ZasedatelevA.和MirzabekovA.2001.Identificationofrifampin-resistant妙c06a"eW咖&6e_rcw/os/$strainsbyhybridization,PCR，andligasedetectionreactiononoligonucleotidemicrochips./,Wcro6/0/.39:2531-2540.TillibSV，StrizhkovBN，MirzabekovAD.IntegrationofmultiplePCRamplificationsandDNAmutationanalysesbyusingoligonucleotidemicrochip,j加/"/oc力e瓜2001May1;292(1):155-60.下面的方法用于檢測(cè)結(jié)核^f支桿菌復(fù)合沐XX.對(duì)于IS6110或65kD熱激蛋白的聚^HllA應(yīng)；GunishaP,MadhavanHN,JayanthiU，ThereseKL.2001.PolymerasechainreactionusingIS6110primertodetect妙co6a"eW咖^e"i/7(".sinclinicalsamples.//3力'a/2/戶"力o/飾ro6/。/.44(2):97-102.XXI.通過聚^HMA^的核^^^基因間間隔區(qū)抬r測(cè)；GlennonM，SmithT,CormicanM，NooneD，BarryT，MaherM，DawsonM，GilmartinJJ，GannonF.1994.Theribosomalintergenicspacerregion:atargetforthePCRbaseddiagnosisoftuberculosis.7V6erZw/2g"1、75(5):353-60.KrausG，ClearyT，MillerN，SeivrightR，YoungAK，SpruillG，HnatyszynHJ.2001.Rapidandspecificdetectionofthe妙c06a"er/咖fi/6ercu/o"、complexusingfluorogenicprobesandreal-timePCR.#0/Ce〃/Voto15(6):375-83.XXII.用于擴(kuò)增16SrRNA基因的一^分的Amplicor結(jié)核分枝桿菌測(cè)試(醒E)。J.Schirm，L.A.B.Oostendorp和J.G.Mulder.1995.ComparisonofAmplicor,In-HousePCR，andConventionalCultureforDetectionof妙c06a"er/'咖Wercu/os/sinClinicalSamples./.67/仏#/cro33:3221-3224.XXIII.連^^JS;ViinaneiiAH，SoiniH，MarjamakiM，LiippoK，ViljanenML2000.Ligasechainreactionassayisclinicallyusefulinthediscriminationofsmear-positivepulmonarytuberculosisfromatypicalmycobacterioses.AnnMed32(4):279-283.LinIJ，CheMJ，YehA,HwangJJ，WeiCY，TsaoWL，LeeCP.1999.Comparisonofthesensitivityandspecificityofanautomaticligasechainreactionassaysystemwithaone-steppolymerasechainreactionassayinthediagnosisof妙co6a"eri咖/^6ei"cu7oW51complex.C力a鄉(xiāng)e/^7/丄i/eZ力/22(2):204-211.XXIV.實(shí)時(shí)PCR。ShresthaNK,TuohyMJ，HallGS，ReischlU，GordonSM，ProcopGW.Detectionanddifferentiationof妙o6a"er/咖fw^rcw/o"Vandnontuberculousmycobacterialisolatesbyreal-timePCR./C7/"WcroWo/.2003Nov;41(11):5121-5126.下面^iJi面彬'J的檢測(cè)突變的方法的故泉-試管中的辨苦酸多態(tài)',等錄因特異性PCR方法(I、II)需要對(duì)每個(gè)待測(cè)突變進(jìn)行獨(dú)立的反應(yīng)(也f線對(duì)于r;w5基因要多于30次)，并且各需要大量的研究用躲-多態(tài)性分析(III、IV)、PCR-異源雙鏈體分析(IX)、和RNA錯(cuò)配分析(X)方法是勞動(dòng)密集型、時(shí)間消耗型的，4^供突變類型的間接結(jié)論，并且需要典型的標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)于每個(gè)突變)；另外，RNA錯(cuò)配分析需絲于RM酶污染方面的特殊條降，它也是勞動(dòng)密集型的且不適于檢測(cè)G-U雙鏈似Nash，K.A.，A.Gaytan，和C.B.Inderlied.1997.Detectionofrifampinresistancein妙cc^s"eri咖fw6ercu/o57夕bymeansofarapid,simple,andspecificRNA/RNAmismatchassay./.176:533-536;Telenti，A.，P.Imboden，F(xiàn).Marchesi，D.Lowrie，S.Cole,M.J.Colston,LMatter,LSchopfer,和T.Bodmer.1993.Detectionofrifampinresistancemutationsin妙co6a"er/咖Mercw7os/.51.341:647-650);-在高密;1^苷酸孩"牟列上的雜交(V)需要復(fù)雜的基于計(jì)B的數(shù)據(jù)處理過程和昂責(zé)的有效務(wù)賭器(微陣列本身)；目前高密度微陣列僅開發(fā)用于在r/;^基因中的導(dǎo)致利福平拔性的突變分析；-在專門的微陣列上的雜交的已知方法(VI)不適于進(jìn)行臨M品分析，因?yàn)檫@些方法使用分離自菌，養(yǎng)物的DNA作為試驗(yàn)樣品，而這需要對(duì)獲自臨^^料的細(xì)^i行額夕卜的培育和提純(GryadunovD.A.,MikhailovichV.M.，LapaS，A.，RoudinskiiN.I.，BarskiiV.E.，ChudinovA.V.，ZasedatelevA.S.，MirzabekovA.D.Identificationof妙co6a"eW咖^eroz/oy/sstrainswithsimultaneousevaluationoftheirdrug-resistancebyhybridizationmethodonoligonucleotidemicroarrays.#o/eiri///a/77sjage"e〃h,/z/irro62'o/o#//a，W/T/s^A^/ya2003;(4):24-27(在俄羅斯)；YueJue，WeiShi，JingpingXie,YaoLi，ErliangZeng和HonghaiWang.Detectionofrifampin-resistant妙co6a"er/咖fw6ercw/051/51strainsbyusingaspecializedoligonucleotidemicroarray.//<3卵Wcrc6/o////e"脅2004;48:47-54);-直驗(yàn)苷酸測(cè)序(VII)需粉離躲絲，進(jìn)4tr增^和測(cè)序，而且對(duì)于^J!！自動(dòng)領(lǐng)'J序機(jī)器的分析需要^I產(chǎn)物的額外純化；-^JW旨玟法(VIII)和結(jié)構(gòu)特異',酸內(nèi)切酵4刀割法(XI)需要初步標(biāo)準(zhǔn)化(糾的選擇)，這樣就會(huì)增加勞動(dòng)強(qiáng)度，并且需要可得到典型標(biāo)準(zhǔn)品。另外，Mt^旨紋法需JH^U謝性探針，從而P艮制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用；一商業(yè)上可獲得的INN0-LiPA裝置(XII)的,高昂并且僅^^定在r/7oS基因中的有限數(shù)目的突變(RossauR，TraoreH，DeBeenhouwerH，MijsW，JannesG，DeRijkP，PortaelsF.EvaluationoftheINNO-LiPARif.TBassay，areversehybridizationassayforthesimultaneousdetectionof妙co&2"e/7鵬f由rcw/oy/'51complexanditsresistancetorifampin.^"邁AvY6^^e/z"1997;41:2093-2098);-基于噬菌體的方法(XIII)非常消耗時(shí)間，因?yàn)槠渑c噬菌體復(fù)制以及隨后對(duì)，分枝桿菌(必幼^咖"》培#^所進(jìn)行的，記斜目關(guān)，而且該方法^動(dòng)密集型的；-切割*理法(XIV)和質(zhì)i普法(XVII)需要均一的高度純化的DNA樣品；樣品制備步^高^H殳4^是P艮制質(zhì)il^析(XVII)廣泛應(yīng)用的因素；-基于連接的方法(XV)的應(yīng)用受到限制是因?yàn)殡y于制備用于大量檢測(cè)耙的探4H且和需使用昂貴的酶(熱穩(wěn)定DM-連接酶)；-實(shí)時(shí)PCR(XVI)M示受測(cè)試的基因組片段中最廣布的突變的存在，而不^lt確^^定核苷酸取代，并且該方法相對(duì)于常M^析來(lái)說(shuō)比較昂貴；-熒;5^^能量##法(XVIII)有兩個(gè)重大的^泉1)它只允許檢測(cè)有Pl^:目的突變，2)它不允"i午將功肯Ui重要的突變與^^^上不顯現(xiàn)的突變區(qū)分開來(lái)。-在寡核苷酸微芯片上的PCR和連接的方法(XIX)需要進(jìn)一步改進(jìn)而Jjt于在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用有些復(fù)雜。所有上面鬆'J的基于擴(kuò)增IS-因子(XX)、熱激蛋白(XX)，基于核糖體間隔區(qū)基因^"測(cè)(XXI);5^^測(cè)結(jié)核^4支桿菌復(fù)*的方法，以及自動(dòng)PCR(XXII)、連^il^Jl(XXIII)和實(shí)時(shí)PCR(XXIV)的方法，允許檢測(cè)在受測(cè)樣品中結(jié)核病病原體的存在，鄉(xiāng)^^測(cè)病原樹抗^f支桿菌藥物的敏感性。發(fā)明M在微型生物芯片Ji^r測(cè)對(duì)利福平和異煙肼具有抗性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)M的菌株的方法的優(yōu)點(diǎn)在微型生物芯片Ji^r測(cè)臨斜品中對(duì)利福平和異煙肼具有抗性的結(jié)核^f支桿菌復(fù)合體的菌林的方法在如下方面有皿不同于tt技術(shù)已知的方法能夠直接鑒定臨^#料中的病原體，同時(shí)"^t兩種第""^級(jí)的^^枝桿菌制劑的抗性；能夠鑒定導(dǎo)致藥物抗性的突變的類型；以;SJl得結(jié)^^斤需的低費(fèi)用和短時(shí)間。該方法不需要昂貴的設(shè)備和非常有技能的人員。使用雜交法獲得的數(shù)據(jù)可以用于確定藥物產(chǎn)品的治療劑量和^f亍病學(xué)的遺傳分型。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了^U微型生物芯片同時(shí)檢測(cè)臨床材料中的結(jié)核^^支桿菌復(fù)^^基于鑒定^^支軒菌DM中使孩性物對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的突變來(lái)，菌林對(duì)利福平和異煙肼的拔性的快速方法。該方法的^f出是兩步多重PCR以獲得單鏈熒光DM片段，然后在^"組區(qū)分^^苷酸的微陣列上讓這些片段雜交。該方法包4^(口下步驟(A)->f^U—組用于第一PCR步驟的特異性？1物對(duì)來(lái)多重?cái)U(kuò)增"w5、iraW、/iiAAfl力pC基因、/^^M可動(dòng)因子的片乾(B)-使用在步驟(A)中獲得的PCR產(chǎn)物作為模板、和一組用于第二PCR步驟的特異性引物對(duì)來(lái)多重?cái)U(kuò)增r/7oAhW、//A4、a知C基因、/5WM可動(dòng)因子的片段，其中每對(duì)引物中有一個(gè)引^^皮熒it^i己以獲得主要是單鏈熒iy科己的片段；(C)-制備能夠同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)^^和鑒定導(dǎo)IW利福平和異煙肼產(chǎn)生拔性的突變的生物芯片，所述生物芯片由具有膠墊(gelpad)的M組成，每個(gè)墊中固定有獨(dú)特的絲苷酸探針，其中所ii^fe苷酸的序列選自如下序列a)與野生型i77W基因片餅列相應(yīng)的序列；b)與導(dǎo)致觸物對(duì)利福平產(chǎn)生拔性的突變型變體"o"基因片段序列相應(yīng)的序列；c)與a)和b)中描述的序列互補(bǔ)的序列；d)與野生型hW基因片辦列相應(yīng)的序列；e)與導(dǎo)致孩&物對(duì)異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體h"基因片餅列相應(yīng)的序列；f)與d)和e)中描述的序列互補(bǔ)的序列；g)與野生型//zA4基因片餅列相應(yīng)的序列；h)與導(dǎo)致做物對(duì)異煙肼產(chǎn)生抗l"生的突變型變體基因片餅列相應(yīng)的序列；i)與g)和h)中描述的序列互補(bǔ)的序列；j)與野生型a知C基因片絲列相應(yīng)的序列；k)與導(dǎo)致樣性物對(duì)異煙肼產(chǎn)生捻性的突變型變體a知C基因片餅列相應(yīng)的序列；1)與j)和k)中描述的序列互補(bǔ)的序列；m)與可動(dòng)因子/5WM的序列相應(yīng)的序列；o)與描迷于m)中的序列互補(bǔ)的序列；(D)-在能為雜交時(shí)形成的完美的和錯(cuò)配的雙鏈體之間提^個(gè)核苷酸的^^率的*下，在生物芯片上ib^步驟(B)中獲得的擴(kuò)增出的才封己產(chǎn)物雜交；(E)-記絲解析雜交數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的特征在于，在多重PCR的第一步驟(A)中^^J序列為SEQIDNO:70、71、74、75、77、78、80、81、83、84的一組特剩生引物對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的特4i^于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用序列為SEQIDNO:72、73、74、76、77、79、80、82、83、85的一組特異性引物對(duì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法的特征在于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用的熒光^i己的？1物相對(duì)于來(lái)自該引物對(duì)的另一引物來(lái)it^學(xué)爾過量的，以對(duì)于所有$1物對(duì)都獲得主要是單鏈熒^^i己的片段。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法的特征在于，直4^吏用來(lái)自臨M品的材料(痰、滲出物、洗出液(wash-out)、支氣管肺泡灌'皿)或孩化物的初步生^1##，iMi行基因和/5W"可動(dòng)因子的片段的擴(kuò)增。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的特樣于^^J包^^S^列為SEQIDNO:1-69的固定的寡fe苷酸的生物芯片。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法的特灘于^U雜交緩沖液，其允許在擴(kuò)大的溫度區(qū)間內(nèi)進(jìn)行雜交，以便為雜交時(shí)形成的完美的肖配的雙鏈體之間提^-個(gè)核苷酸的緒率。在另一個(gè)實(shí)施絲中，該方法的特絲于，步驟(E)中的數(shù)樹己錄^M便攜式熒光^^/H^^^:件，所述軟件允許進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度的自動(dòng)處理以用于隨后的在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的特征在于，通過比較墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度^t在步驟(E)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)4博析，在所述墊中形成了完美的和錯(cuò)配的雜交雙鏈體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的特絲于，將解析結(jié)果用于利用存在一個(gè)或另一個(gè)作為標(biāo)記的突變來(lái)證實(shí)結(jié)核病的臨床診斷和流行病學(xué)遺傳分型，在以下方面，本發(fā)明提供了特異性引物對(duì)組，其用于實(shí)現(xiàn)4^發(fā)明的第一個(gè)方面，也^U^于在臨M品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核^^支桿菌復(fù)^^鑒定導(dǎo)致菌林對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其中引物序列為SEQIDNO:70-85。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生物芯片，其用于本發(fā)明第一方面的方法中，也，^UJI于在臨斜品中同時(shí)稱則結(jié)核^f支桿菌復(fù)^^和鑒定導(dǎo)致菌糾利福平和異煙肼產(chǎn)生拔性的分枝桿菌DM突變的方法中，其中所述生物芯片由具有膠墊的M組成，其中在每個(gè)墊中固定了獨(dú)特的寡核苷酸探針，而且所述探針的序列為SEQIDNO:1-69。最后，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了序列為SEQIDNO:1-69的絲苷酸探4jiE，其用于制備適合于^W本發(fā)明的第一方面的方法的生物芯片，即適合于在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核^^支桿菌復(fù)*和鑒定導(dǎo)致菌糾利福平和異煙肼產(chǎn)生拔性的分枝桿菌DNA突變的方法。本發(fā)明的雞方面將可以從附圖、發(fā)明詳ii^r^U'J要求中看出。附圖簡(jiǎn)述為更清楚，解本發(fā)明的本質(zhì)，也為了證實(shí)本發(fā)明的特^優(yōu)點(diǎn)，下面將參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)4辨細(xì)描述，其中圖l顯示了生物芯片上區(qū)別性寡核苷酸的排列示意圖。圖2顯示了來(lái)自野生型結(jié)核^f支桿菌的DNA樣品的雜交圖式。圖3顯示了來(lái)自含有突變的結(jié)核分枝桿菌的DNA樣品的雜交圖式，其中所述突變導(dǎo)致r/o"基因中Ser531〉Leu和iaW基因中Ser315〉Thr的虞J^^取代。圖4顯示了來(lái)自含有突變的結(jié)核分枝桿菌的DNA樣品的雜交圖式，其中所述突變導(dǎo)致r;w^基因中Asp516〉Val的^J^^取^^//^基因啟動(dòng)子區(qū)中OT15的核苷酸取代。圖5顯示了牛^f支桿菌及^的DNA樣品的雜交圖式，其中該^Nt桿菌在r/w"和hW基因中和在//A4和a力/C基因的調(diào)節(jié)區(qū)中不包含取代。圖6顯示了烏^^支桿菌(必flw'zz^5W的DNA樣品的雜交圖式。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提^"種快^法，其用于檢測(cè)臨床樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)*，同時(shí)通過^H^在^f支桿菌DNA中導(dǎo)致出現(xiàn)藥物抗性的次要多態(tài)性(點(diǎn)突變、缺失、插入)來(lái)確定^^支桿菌對(duì)利福平和異煙肼的抗性。J^求保護(hù)的方法建議"f頓同時(shí)擴(kuò)增可動(dòng)因子/^M以及rpo厭hW、//z/Aa知C基因的序列的多重聚^H^應(yīng)；^^)擴(kuò)增產(chǎn)物作為^^^得上錄因的熒;5t^i己的單鏈片段，其中臨^H"料、細(xì)艦絲的賄產(chǎn)物、無(wú)生理液體可以用作絲樣品。要求保護(hù)的方法還提供具有固定的特異性探針的原始寡核苷酸生物芯片的用法、雜交程序、數(shù)據(jù)的記^解析。在生物芯片上檢測(cè)對(duì)于利福平和異煙肼具有抗性的結(jié)核^^支桿菌復(fù)合沐的菌株的原理性練讓臨M品(*部形式的疾病情況下-痰)進(jìn)行;ff沐細(xì)胞裂解，從而能夠獲得基因組DM。一個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ窃贜-乙?；?L-半M^酸存在下于堿性糾下進(jìn)^#釋，并與去污劑^煮沸，以獲得DNA^H吏樣品剩t。對(duì)于這些目的，本領(lǐng)域技#員已知的其他方法也可以使用，例如用超聲波破裂細(xì)胞(PadillaE，GonzalezV，ManterolaJM等人，EvaluationoftwodifferentcelllysismethodsforreleasingmycobacterialnucleicacidsintheINNO-LiPAmycobacteriatest.ZV柳Mcro6/》/Zo/ecWA2003May;46(1):19-23)，用錄離-減酸進(jìn)行鶴(KotlowskiR，MartinA，AblordeyA等人,One—tubecelllysisandDNAextractionprocedureforPCR-baseddetectionof妙co&2"eW咖wA;era/winaquaticinsects,molluscsandfish./飾油'o/.2004Sep;53(Pt9):927-933)，等。在第一步驟中利用多重PCR進(jìn)行功f讓重要的基因的片段的特異'^T增。在笫二步驟中，主要是單鏈熒it^己的產(chǎn)物是使用5'-包含熒光染料的《I物通過非對(duì)稱多重PCR而獲得的。選擇用于進(jìn)^^增的第一步驟的引物以使得它們處于基因區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的側(cè)翼，大量導(dǎo)致tt物的藥物抗性的突變位于所錄因區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)中。利用特殊的lt件，例如Oligov.6.3(MolecularBiologyInsightsInc.,CIIIA)或FastPCR(http://www,biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm)或者其他商業(yè)上可獲得的程序或通itX聯(lián)網(wǎng)可得到的程序，來(lái)計(jì)算引物的解鏈溫度，然后通it^變引物的長(zhǎng)度使得引物的ii^溫^^布不大于3-4匸。^擇引物的時(shí)候有必要敏這樣的序列，即^^^=^#構(gòu)，例如具有高的解^^顯度的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。^i^擇用于多重PCR的引物的時(shí)候有必要狄這樣的序列，即其相互之間能夠形成由多于3-5個(gè)核苷^i賦的雙鏈體。每^il^的引物應(yīng)該對(duì)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)M的基因組核斷列的分析區(qū)具有獨(dú)特的特異性。引物的特異性是通過能夠##BLAST算法在核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行捷索的軟件綠制的(例4口爾.ncbi.nlanih.gov/BLAST)。如果可能，用于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因組區(qū)域的引物是以提供擴(kuò)增的片段^1的差異為30-504iiJ^(b.p.)這樣的方式^i行選a，該差異允許可4W^查在2"/。瓊脂糖m電泳后對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增產(chǎn)物的特異f生條帶的存在/M在。考慮上述要求^i^擇用于進(jìn)行擴(kuò)增的第二步驟的引物，不同^t^于至少一個(gè)引物是于在第一步驟中獲得的PCR片段之中進(jìn)行選輛，以增加A^特異性。以在第二步驟中擴(kuò)增的片段大小將是70-400b.p，這樣的方^^擇引物。在件上的被分析;段的有效擴(kuò)lfcJtiiJ麻煩，最"致形成的雜交雙鏈體的量斷氐并且因而導(dǎo)致墊中的熒光信號(hào)的減弱。在選擇引物的時(shí)候有必要考慮在反應(yīng)收因此，在每對(duì)引物中，包含熒it^i己并且被過量加入的引物("正向引物")選自其序列與固定在生物芯片的墊上的寡核苷酸序列互補(bǔ)的鏈。也就是，當(dāng)用于固定的苷^自有義鏈的情況下，^^C鏈的主要擴(kuò)增對(duì)于在生物芯片的墊中形成雜交雙鏈體是必需的，由此"正向引物"選自基因序列的互^喊(^gJC鏈)，反之亦然。^f^f可熒光染^H"以用作熒it^H己，它可以化學(xué)地附著到苷酸引物的5'-絲并且不會(huì)^^礙聚^l^^的實(shí)施。這些染料的光鐠對(duì)于4^頁(yè)域?qū)員來(lái)i^l熟知的，其例如包括下述染牝熒光素(TAMRA⑧，R0X，JOE)，羅丹明(TexasRed"，和聚甲炔(Cy3逸，Cy5，Cy5.5，Cy7)家族(RanasingheR.和BrownT.Fluorescencebasedstrategiesforgeneticanalysis.C力e邁.CoiM肌，2005，5487-5502)。熒光染料可以商購(gòu)獲得，特別;U^自MolecularProbes,USA。大部M選的染料具有位于光語(yǔ)的長(zhǎng)波(紅)區(qū)的激^/潛，這樣就可以利用>*^光源如半#絲器^^11染料。熒光染料可以直接iik^者通過中間間隔物，例如來(lái)自GlenResearch的5'-#JH務(wù)飾劑而附著到引物的5'-末端。對(duì)于引物的焚it^封己，熒光染料以AJI性衍生物的形式使用，例如^自,胺醚。熒光染料可以在引物進(jìn)行了合成并與固體M(CPG)(在其上進(jìn)行合成)^f4^以人工方i(進(jìn)行^i務(wù)飾。用高效斜目色鐠法(HPLC)^^!l應(yīng)的染^P^^應(yīng)副產(chǎn)物中純化出熒iy射己的引物。對(duì)于用于固定在生物芯片上的區(qū)別性寡核苷酸的選擇，區(qū)別'I^S核苷酸的長(zhǎng)M以這樣的方式進(jìn)行選擇的，即考慮了被分析序列的大小和復(fù)雜度而提供^ii^析序列的特異性，尤其是在重M列和大范圍同聚體序列存在的a下。對(duì)于已知其中的突變、多態(tài)性或等位基因變體的^Ni置來(lái)說(shuō)，特異的區(qū)別性寡核苷酸組的選擇應(yīng)該能夠揭示已知的替換、缺失、和插入。利用軟件，例如Oligov.6.3(MolecularBiologyInsightsInc.,USA)來(lái)計(jì)算絲苷酸的解銜顯度，然后通過改變引物的長(zhǎng)^M吏得寡核苷酸解銜顯度的分布不大于2-3。C。有必要i^這樣的，苷酸，即^^C構(gòu)，例如具有高的解^i顯度的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。確定的可變核苷酸和其他核苷酸改組(nucleotidereorganizations)的位置主^i^離相應(yīng)的區(qū)別性絲苷酸中部不多于l-4個(gè)核苷酸的位置內(nèi)。將區(qū)別性絲苷酸固定在^^L件上，所述m^L件以滴(墊)的形式:5L^在基質(zhì)上，直徑為80-300jLim，間隔150-500jum,而并不^^l特歹木的絮j:,例如石^^模。玻璃M(載物片或蓋玻片)和更多的可用材彬口塑辦']品可以用作基質(zhì)。為了將寡核苷酸固定在生物芯片上，將它們與主要的凝M^分共聚合。作為這種一步AJJ的結(jié)果，固定的W不可i^與生長(zhǎng)聚^^鏈的一種或另一種^^合，并且以高產(chǎn)率(對(duì)于苷酸為約50%)均勻分布在#;^^^p沖(隨naAY，Pan'kovSV，DementievaEI等人，Hydrogeldropmicrochipswithimmobilizedpropertiesandmethodsforlarge-scaleproduction,^a/2004;325:92-106)。通itlU對(duì)DNA核苷斷列具^#的^1(MikheikinA.L.，ChudinovA.V.，YaroshchukA.I.，RubinaA.Yu.，Pan'kovS.V.，KrylovA>C.，ZasedatelevA.S.，MirzabekovA.D.ThedyewithlowspecificitytoDNAnucleotidesequence:applicationfortheevaluationofamountofoligonucleotidesimmobilizedinarraycellsonbiochips.Vo/eJhz/7ar加/aWo/塔/"，2003,37(6):1061-1070(在俄羅斯))。在擴(kuò)增的第二步驟中獲得的PCR產(chǎn)物在區(qū)分lt生物芯片上與固定的寡核苷酸雜交，所述固定的，苷酸與用于檢測(cè)突變的測(cè)試基因y的序列互補(bǔ)。在密封雜交室中，在包含用于維持pH的緩沖液成分、用于形成離子強(qiáng)度的鹽、和離液劑(^iL鍵不穩(wěn)定)的溶液內(nèi)進(jìn)行雜交，雜交溫度，于^f車列上固定的區(qū)別性絲苷酸的解^j顯度而定。例如，可以^^)硫H^、尿素、或曱^ft為^H鍵不穩(wěn)定的試劑。雜交的最佳溫度的選#1^考慮系統(tǒng)實(shí)際應(yīng)用的便利性。^>發(fā)明要求4呆護(hù)的區(qū)別性苷酸的解^^顯度范圍為42-44X:，這樣ityL許在37X^M離液劑進(jìn)行雜交。371C的溫度很合適，因?yàn)榇蠖鄶?shù)臨床實(shí)驗(yàn)室都裝備有維持這個(gè)溫度的恒溫器。當(dāng)該開發(fā)出的方法定位于在野外條件下應(yīng)用該系統(tǒng)時(shí)，雜交的溫度范圍可以擴(kuò)^J，J20-37X:,雜交緩沖液的離子強(qiáng)度相應(yīng)地改變到0.3-1.0M。(LapaS，MikheevM，ShchelkunovS等人，Species-levelidentificationoforthopoxviruseswithanoligonucleotidemicrochip./恥'"M/o六2002Mar;40(3):753—7)。測(cè)試的DM片段僅與相應(yīng)的(完全互補(bǔ)的)，苷酸形成完美的雜交雙鏈體。測(cè)試的DM片段與其它所有的，普酸形成錯(cuò)配的雙鏈體。完美的和辦己的。在其中形成了完美的雜交雙鏈體的墊上的信號(hào)強(qiáng)度(I完美的)高于在其中形成了錯(cuò)配的雙鏈體的墊上的信號(hào)強(qiáng)度(I嫩納)。雜交在最佳M(溫度、離液劑的適當(dāng)濃度、和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度)下進(jìn)行以允許在2個(gè)墊之間獲得的比率I細(xì)納>2，所述墊包含屬于一個(gè)^^ibf目差一個(gè)核苷酸的探針。利用絲苷錄生物芯片上的排列方案來(lái)^N皮測(cè)DNA序列中的突變，并就測(cè)餅品對(duì)利福平和/或異煙肼的私liiL敏感性作出結(jié)論。相互比較在屬于一個(gè)群沐的膠墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度。最大的熒光信號(hào)證明(即屬于對(duì)藥物敏感的微生物)的墊中記錄了最大信號(hào)，那就表明測(cè)試樣品在該#_位置(膠墊群)沒有突變。如^t應(yīng)于具有突變的DNA(即屬于對(duì)藥物具有拔t生的擺逸物)的膠墊中記錄了最大信號(hào)，那錄明測(cè)餅品在該絲酸位置(膠墊群)具有導(dǎo)致藥物抗性的^J^替換。如果樣品的特征是在每個(gè)^J^位置(墊群)^!t感，那就iUH亥測(cè)^f品屬于分枝桿菌的敏感性菌林。如果樣品的特征是在至少一個(gè)JIJ^位置(膠墊群)具有導(dǎo)致藥物糊生的突變，那就認(rèn)為該測(cè)餅品屬于分枝桿菌的抗性菌林。對(duì)于這樣的樣品，,嫂財(cái)其產(chǎn)生了抗性的藥物類型還可以通過確定其中樣品屬于藥物抗性類型的^^來(lái)闡明。由2個(gè)墊組成的^^分別形成用于檢測(cè)結(jié)核^f支桿菌復(fù)^LDNA的系統(tǒng)。無(wú)固定"寡核苷酸的膠墊;為參考?jí)|:'如^i測(cè)墊中記錄下了更強(qiáng)的信;，那么可以得出結(jié)論，該測(cè)，品包含屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)M的DM。給出下面的實(shí)施例用以進(jìn)一步解#^描^^^發(fā)明的范圍和細(xì)節(jié)，其不應(yīng)表示對(duì)^^發(fā)明的限制。實(shí)施例實(shí)施例1.用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)^f^H^菌;^Mt利福平和異煙耕的敏感性的生物芯片DNA/RNA合成儀(AppliedBiosystems，USA)上合成，并且包含分別具有用于進(jìn)一步固定在^IUi的游離My-^jH辨劑C7CPG500(GlenResearch,USA)或用于附著熒光染料的5'-^JH參飾劑C6(GlenResearch,USA)的間隔物。吲咪^^l胥(indodicarbocyanine)熒光染料("Biochip-1MB"，俄羅斯)的附著才Nt廠商的建議進(jìn)行。才早期描述的方法生產(chǎn)生物芯片(RubinaAY，Pan'kovSV,DementievaEI等人，HydrogeldropmicrochipswithimmobilizedDM:propertiesandmethodsforlarge-scaleproduction,Woc力飾2004;325:92-106)。生物芯片包含直徑為100|um的半球形墊，相互間隔300ym。墊沉積的均勻度及其直《5it過"Test-chip"軟件("Biochip-IMB"，俄羅斯)來(lái)刑t通過測(cè)量固定的寡核苷酸的濃^Mi行微P車列品質(zhì)的控制。生物芯片用熒光染料ImD-310染色，并如早期所述測(cè)量固定的探針的濃度(MikheikinA.L.，ChudinovA.V.，YaroshchukA.I.，RubinaA.Yu.，Pan'kovS.V.，KrylovA，C，，ZasedatelevA.S，，MirzabekovA.D.ThedyewithlowspecificitytoDNAnucleotidesequence:applicationfortheevaluationofamountofoligonucleotidesimmobilizedinarraypadsonbiochips.Mj/eirw/jaraa/aWo/og/"，2003，37(6):1061—1070(在俄羅斯))。生物芯片結(jié)構(gòu)生物芯片包含列Ml中的69個(gè)固定的寡核苷酸、通過軟件提供的用于正確定位(圖^4t獲)的三個(gè)才斜己點(diǎn)、和7^H55留的空白^^墊。固定在微陣列上的a苷酸的朝一J顯示在圖1中。圖1中的灰色顯示了包含寡核苷酸(表l，SEQIDNO:1-69)的膠墊，這些苷酸能夠在對(duì)應(yīng)于下面的在基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的#^^核苷酸的位置處，與無(wú)突變的DNA(即與野生型(WT)DM)形成完美的雜交雙鏈體(Gly/Thr)WT507(Al);Met515(Bl);Ser522(Cl);Leu533(Dl);Asp516(A3);His(B3，C3);Ser531(D3);Leu511卿;Gln513(A8);Ser512卿；ir"GSer315(El，F(xiàn)l);Trp328(Gl);Ile335(G5);//zMinhAw-G24(G8);inhAw一AT8(H8);inhAw一C15(H5);a/pGahpCw-G6(Hl);ahpCw—C10(11);ahpCw—G9(I4);ahpCw_C12(16)。圖1中的白色顯示了包^it樣的寡核苷酸的膠墊，所i^fe苷^W應(yīng)于下面的在基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的^J^J^核苷酸的位置處，與野生型DM形成錯(cuò)配的雜交雙鏈體輛腦7(A2);Ile515(B2);Leu522(C2);Pro533(D2);Val516(A4);Tyr516(A5);Gly516(A6);Glu516(A7);Asp526(B4);Leu526(B5);Gln526(B6);Cys526(B7);Tyr526(C4);Asn526(C5);Arg526(C6);Pro526(C7);Leu531(D4);Trp531(D5);Cys531(D6);Gln531(D7);Pro511(E4);Arg511(E5);Thr512(E7);Arg512(E6);Leu513(B8);Lys513(C8);Gly513(D8);ir""Thr315i(E2);Thr3152(F2);Asn315(F3);Ile315(F4);Arg315！(F5);Arg3152(F6);Gly315(F7);Gly328(G2);Leu328(G3);Cys328(G4);Val335(G6);7/2M固一T24(G7);inhA一A8(H7);inhA一G8(H6);inhA一T15(H4);inhA一G16(H3);ahpC一A6(H2);ahpC-T10(12);ahpC一A10(13);ahpC腸A9(15);ahpC一T12(17)。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>69F8，I8--WTCCGGAGCTGCGTGAGCG1359-1375*寡核普酸的位置顯示為它們?cè)趫D1中的位置。200610130976.6轉(zhuǎn)滔*被23/60:K墊F8和18包含與插入因子IS6110序列的片段互補(bǔ)的寡核苷酸，所述插入因子IS6110通常存在于結(jié)核^^支桿菌復(fù)#的DNA內(nèi)。實(shí)施例2.臨床樣品的處理1.將臨斜品(痰、滲出物、洗出液、支氣管肺泡灌'絲)與現(xiàn)制備的在2%NaOH中的N-乙酰基-L-半皿酸(NALC)的0.5%皿以1:1(v/v)比率混合。用Vortex劇烈^樣品并在室溫下維持20分鐘。以比率1:5(v/v)將磷雌緩沖鹽水pH6.8加AJ'J樣品中，然后以3,000rpm離心濕^的30分鐘。當(dāng)^^I腦脊液時(shí)，以10，000rpm進(jìn)行10^4中的初步離心。對(duì)于j6i^"析，根l^f^IFicoll的常見方法初步分離淋巴細(xì)^l分。接下來(lái)的處3^t所有樣品都^_相同的。2.用1.5raLTE緩沖液(10mMTris-HCl、1mMEDTA)(pH8.0)懸浮沉淀的墊，然后以3，000rpm離心30分鐘。多次重復(fù)洗^Ht程。3.將30jLilTE緩沖液(pH8.0，包含1°/。(v/v)TritonX-l00)加Ai'J獲得的沉淀中，然后將樣品置于95'C的干燥箱內(nèi)30分鐘。4.將樣品以10，000rpm離心10^4中，然后用上清液(3mD進(jìn)行PCR。實(shí)施例3.擴(kuò)增IS6110可動(dòng)因子、"o及化W、//W、a力pC基因的片段；用多重pcr法制4^單鏈^by射己的片段在第一步驟中，進(jìn)行r;^(212b.p.)、ia^7(166b.1).)、/Vz/^(133b.p.)、a知C(126b.p.)基因和IS6110可動(dòng)因子(309b.p.)的片段的多重?cái)U(kuò)增。將在實(shí)施例2第4段中獲得的3|j1^^。加A^25ja1PCR-^^中。PCR-;^^的城1XPCR-緩沖洗lOmMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3)(Sileks，俄羅斯)；1.5mMMgCl2;讚，dCTP，dGTP，dUTP(Sileks)各為200|oM;濃度如下的引物(序列列在表2中)的"^物pl05f，p293r，katG—f，katG—rl，IS-f,IS一rl;InhA—f，InhA一rl，ahpc—f，ahpC一rl—100nM;5U熱穩(wěn)定的TaqDNA聚絲(Sileks);0.5U尿微-DNA老基摘(Sileks)。才娘下面的殺件在可編程的恒溫器MiniCycler(MJResearch,USA)上進(jìn)4対廣增95'C-30s，67X:-30s，-30s;循環(huán)36次(第一次循環(huán)的變性時(shí)間增加到5分鐘，i^一次循環(huán)的敘己時(shí)間增加到5分鐘)。在PCR的第一步,獲得的1m1M^4^用作第二步驟的模板。用特異于r/M(126b.p.)、(140b.p.)、//z/^(93b.p.)、(96b.p.)基因和IS6110(110b.p.)的片段的引物進(jìn)行PCR的第二步驟。PCIK^^的減(50jal):1XPCR-緩沖波10mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3)(Sileks，俄羅斯)；1.5mMMgCl2;每種dNTP(Sileks)各200nM;濃度如下的引物(序列列在表2中)的混合物:pl272"/pl398r，100nM;katG-f/katG-r2*，100nM;inhA—f/inhA_r2*，100nM;ahpC-f/ahpC_r2*，100nM;IS—f/IS—r2*，100nM;10U熱穩(wěn)定的TaqDNA聚M(Sileks)。用*表示的引物5'-絲包^"接頭C6^tJ^辨劑(GlenResearchCorp.，USA),在^JJi附著有吲^^菁染料(Biochip-1MB，^)。才娥下面的條件在可編程的恒溫器MiniCycler(MJResearch,USA)上進(jìn)4tr增95X:-30s,65匸-30s，72'C-20s;循環(huán)46次(第一次循環(huán)的變性時(shí)間增加到5分鐘，:^一次循環(huán)的敘己時(shí)間增加到5分鐘)。獲得的產(chǎn)物(12jul)用于在生物芯片上雜交。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*引物的5'-;W包含躲C6^^"f辦劑(GlenResearchCorp.,USA),^t^Ji附著有吲^^著染料IMD~504(Biochip"IMB，^*^)。200610130976.6勢(shì)溢龍被26/60:K實(shí)施例4.擴(kuò)增出的才科己產(chǎn)物在生物芯片上雜交向12jLi1在PCR的第二步g獲得的并包含對(duì)應(yīng)于5個(gè)分析片段的主要是單鏈熒;b^i己的DNA片段的A^;^^中，加入雜交緩沖液的絲液以iiJiJ終^!^石錄郝-1M,HEPES-50mM，pH7.5，EDTA—5mM。將獲得的;^^(28jul);^A^f車列的雜交室中。所述室由"Biochip-IMB"Ltd.(俄羅斯)生產(chǎn)。在37匸雜交6-12小時(shí)。之后在37匸用蒸餾7jc洗滌微陣列三次。實(shí)施例5.雜交數(shù)據(jù)的記^解析在便攜式熒光分析儀("Biochip-IMB"Ltd.,俄羅斯)上利用相同公司研發(fā)的111^6^"@軟件進(jìn)行生物芯片的熒光圖像的記錄。以下面的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)的解析。包含絲苷酸的膠t^t^成22群(這些群在圖1中用實(shí)線分割)，這樣通過tb^每群內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度使得能夠得出關(guān)于突變(次要多態(tài)性)存在/^^在的結(jié)論，所述突變導(dǎo)致單個(gè)#^^4的取代或缺失，或者/^和a知C基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的核普酸取代。實(shí)施例6.利用在生物芯片上雜交的方法;JM^測(cè)臨斜品中對(duì)利福平和異煙肼敏感的結(jié)核^f支桿菌復(fù)M(野生型DNA)將獲自被證實(shí)(通過^^r)具有抗酸細(xì)菌(AFB-P曰性)的患者的痰樣品分成2份，其中~"#在凈化(N-乙^t4-L-半賦酸和NaOH)和中和后接種至Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基。在37。C孵育樣品6個(gè)星期，并且每周監(jiān)控細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)菌落后，通it^tZiehl-Neelsen染色后進(jìn)#^^揭示出樣品中存在有抗酸細(xì)菌。通過生物化學(xué)測(cè)試來(lái)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(KentPT，KubicaGP.Publichealthmycobacteriology.AguideforlevelIIIlaboratory.Atlanta,GA:CentersforDiseaseControlandPrevention,1985)。通過在分別包含濃度為40mg/1和0.2mg/1的利福平和異煙肼的Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基中的比例法(proportionmethod)來(lái)觀lj試藥物抗性。如果與無(wú)藥物的培養(yǎng)勤目比，在含藥物的培養(yǎng)JJi有多于iy。的菌落生長(zhǎng)，那么就認(rèn)為該分離物具有拔f生。通過在實(shí)施例2-5中描述的本發(fā)明方法來(lái)分析第二部分的痰樣品。圖2顯示了M核^f支桿菌復(fù)+沐的對(duì)于利福平和異煙l^t感的菌抹中分離的DM樣品的雜交數(shù)梧。才財(cái)居提漢的數(shù)據(jù)解析算法，含有與野生型DM互補(bǔ)的tt苷酸的墊的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于^-群中的雞墊。因此，測(cè)餅品的DNA與互補(bǔ)于野生型DNA序列(對(duì)利福平和異煙耕敏感的結(jié)核分枝桿菌菌林)的寡核苷酸形成完美的雜交雙鏈體。通過比g含有互補(bǔ)于IS6110的固定的S^苷酸的墊(F8，18)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度和在起陰'feW照作用的空白墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)確定菌林屬于結(jié)核射支桿菌復(fù)M。這意味著結(jié)核分枝桿菌復(fù)^^在于測(cè)試的臨床樣品中，并且不存樹利福平和異煙肼具有拔性的細(xì)菌。通it^固，養(yǎng)JJi進(jìn)^f辨養(yǎng)和生物化學(xué)測(cè)^^證實(shí)痰樣品中存在結(jié)核分枝桿菌。含藥物的培養(yǎng)Ui沒有菌落的生長(zhǎng)。因此，用培養(yǎng)法揭示了臨斜品中存在野生型結(jié)核^f支桿菌，這與用本發(fā)明的方法獲得的數(shù)據(jù)完4^-致。實(shí)施例7.通過在生物芯片上雜交的方法檢測(cè)臨床樣品中對(duì)利福平和異煙肼具有抗性的結(jié)核^t桿菌復(fù)合昧(包含突變的DNA)將獲自被證實(shí)(通過^)具有抗酸細(xì)菌(AFB-陽(yáng)性)的患者的痰樣品分成2份，其中一份在凈化(N-乙i^-L-半J^酸和NaOH)和中和后接種至Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基。在37匸醉育樣品6個(gè)星期，并且每周監(jiān)控細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)菌落后，通過在Ziehl-Neelsen染色后進(jìn)^t^揭示出樣品中存在有抗酸細(xì)菌。通過生物化學(xué)測(cè)試來(lái)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合沐(KentPT，KubicaGP.Publichealthmycobacteriology.AguideforlevelIIIlaboratory.Atlanta,GA:CentersforDiseaseControlandPrevention,1985)。通#分別包含濃度為40mg/1和0.2mg/1的利福平和異煙肼的Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基中的比例法來(lái)測(cè)試藥物抗性。如果與無(wú)藥物的培養(yǎng)基相比，在含藥物的培養(yǎng)uit多于iy。的菌落生長(zhǎng)，那么可以認(rèn)為該分離物具有紙通過在實(shí)施例2-5中描述的本發(fā)明方法來(lái)分析第二部分的痰樣品。圖3顯示了M核^f支桿菌復(fù)M的對(duì)于利福平和異煙肼具有抅性的菌林中分離的DNA樣品的雜交數(shù)據(jù)。在^-群生物芯片元件中，在含有互補(bǔ)于野生型DNA的絲苷酸的墊中的熒光強(qiáng)度tb^所有雞墊中的信號(hào)強(qiáng)度高。只有元件D3-D7和El、E2、F1-F7這些群斷(圖3)。在D3-D7f辦中，元件D4具有最大的熒光強(qiáng)度。因此，測(cè)^#/口的DNA在r/;o"基因(GenbankAcc,NoL27989)的第2431位包含點(diǎn)核苷酸取代A〉T,這導(dǎo)致在第531位Ser至Leu的泰J^取代，并且使得測(cè)試菌樹利福平有抗性。在E1、E2、F1-F7i辦中，元件E2具有最大的熒光強(qiáng)度。因此，測(cè)試的DNA在iaW基因(GenbankAcc.NoU06262)的第1013位包含點(diǎn)核苷酸取代G〉C，這導(dǎo)致在第315位Ser315至Thr的遵J^取代，并且使得測(cè)試菌^Mt異煙肼有抗性。通過比絲含有互補(bǔ)于IS6110的固定的絲苷酸的墊(F8、18)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度和在起陰l樹照作用的空白墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)確定該菌株屬于結(jié)核械桿菌復(fù)棘。因此，可以推斷對(duì)利福平和異煙肼具有^性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)^4在于測(cè)試的臨斜品中。對(duì)利福平的抝f生是由rpo5基因的第531位Ser至Leu的氨^^^取代而引起的。對(duì)異煙肼的拔性是由hW基因的Ser315至Thr的^tj^^M戈而引起的。通過在固，養(yǎng)^Jii^t^養(yǎng)和生物化學(xué)測(cè)試來(lái)證實(shí)痰樣品中存在結(jié)核分枝桿菌。因此，通錄含有利福平和異煙肼的培養(yǎng)JJi菌落的穩(wěn)^^長(zhǎng)證實(shí)了具有抗藥性的結(jié)核^f支桿菌的存在，這與用本發(fā)明的方法獲得的數(shù)據(jù)完4^致。實(shí)施例8.通過在生物芯片上雜交的方法檢測(cè)臨M品中對(duì)利福平和異煙肼具有拔l"生的結(jié)核^f支桿菌復(fù)^(具有突變的DNA)將獲自被i正實(shí)(通過4^r)具有抗酸細(xì)菌(AFB-陽(yáng)性)的患者的痰樣品分成2份，其中^"^在凈化(N-乙^tJ^-L-半M^酸和NaOH)和中和后接種至Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基。在37'C孵育樣品6個(gè)星期，并且每周監(jiān)控細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)菌落后，通過在Ziehl-Neelsen染色后進(jìn)^^^揭示出樣品中存在有抗酸細(xì)菌。通過生物化學(xué)測(cè)試來(lái)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合沐(KentPT，KubicaGP.Publichealthmycobacteriology.AguideforlevelIIIlaboratory.Atlanta,GA:CentersforDiseaseControlandPrevention,1985)。通it^分別包含濃度為40mg/1和0.2mg/1的利福平和異煙肼的Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基中的比例法來(lái)測(cè)試藥物拔f生。如果與無(wú)藥物的培養(yǎng)基相比，在含藥物的培養(yǎng)JJit多于l。/。的菌落生長(zhǎng)，那么可以i^H亥分離物具有抗性。通過在實(shí)施例2-5中描述的本發(fā)明方法來(lái)分析第二部分的痰樣品。圖4顯示了M核^f支桿菌復(fù)M的對(duì)于利福平和異煙肼具有抗性的菌林中分離的DNA樣品的雜交數(shù)據(jù)。在^-群生物芯片元件中，在含有互補(bǔ)于野生型DNA的苷酸的墊中的熒光強(qiáng)度tb^E所有雞墊中的信號(hào)強(qiáng)度高。只有元件A3-A7和H3-H5這些群除外(圖4)。在A3-A7該群中，元件A4具有最大的熒光強(qiáng)度。因此，測(cè)^品的DNA在r;w"基因(GenbankAcc.NoL27989)的第2384位包含點(diǎn)核苷酸取代OG，這導(dǎo)致在第516位Asp至Val的^iJ^取代，并且使得測(cè)試菌林對(duì)利福平有抗性。在H3-H5該群中，元件H4具有最大的熒光強(qiáng)度。因此，測(cè)試DNA在//zA4基因的啟動(dòng)子區(qū)中相對(duì)于勤會(huì)^H立點(diǎn)的-15位置處包含點(diǎn)核苷酸取代OT。通過》b^L含有互補(bǔ)于IS6110的固定的，苷酸的墊(F8、18)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度和在起陰性對(duì)照作用的空白墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)確定該菌林屬于結(jié)核狄桿菌復(fù)棘因此，可以推斷對(duì)利福平和異煙肼具有掄性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)^^在于測(cè)試的臨床樣品中，對(duì)利福平的掄性是由i770"基因的第516位Asp至Val的氨J^^取代而引起的。對(duì)異煙肼的抗性是由//z^基因的啟動(dòng)子區(qū)中核苷酸取代OT(-15)而引起的。通錄固*養(yǎng)^^辨養(yǎng)和生物化學(xué)測(cè)試來(lái)證實(shí)痰樣品中存在結(jié)核分枝桿菌。因此，通錄含有利福平和異煙肼的培養(yǎng)JJi菌落的穩(wěn);^長(zhǎng)證實(shí)了具有抗藥性的結(jié)核^f支桿菌的存在，這與用本發(fā)明的方法獲得的數(shù)據(jù)完4^-"致。實(shí)施例9.利用在生物芯片上雜交的方法檢測(cè)分離自對(duì)利福平和異煙^t感的牛^f支桿菌"07菌林的DNA通過在實(shí)施例2-5中描述的本發(fā)明方法來(lái)分析屬于結(jié)核^f支桿菌復(fù)合沐的^i的牛^f支桿菌507菌林的培#^。圖5顯示了M核^^支桿菌復(fù)^^的對(duì)于利福平和異煙Wt感的菌株中分離的DNA樣品的雜交數(shù)據(jù)。才l^提漢的數(shù)據(jù)解析算法，含有與野生型DNA互補(bǔ)的寡核苷酸的墊具有比^-群中雞墊更強(qiáng)的熒光信號(hào)。因此，測(cè)^#品的DNA與互補(bǔ)于野生型DNA序列(對(duì)利福平和異煙^:感的結(jié)核分枝桿菌復(fù)M的菌抹)的苷酸形成完美的雜交雙鏈體。通過比絲含有互補(bǔ)于IS6110的固定的絲苷酸的敏F8、18)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度和在起陰性對(duì)照作用的空白墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)確定該菌^于結(jié)核^^支桿菌復(fù)*。因此，可以推斷^fc^析的DM屬于對(duì)利福平和異煙Wt感的結(jié)核^4支桿菌復(fù)合沐。同時(shí)，牛^^支桿菌及W菌林的雜交圖式與結(jié)核^f支桿菌的野生型菌林的雜交圖式一致。實(shí)施例10.利用在生物芯片上雜交的方法來(lái)分析分離自鳥分枝桿菌Wi菌抹的■通過在實(shí)施例2-5中描述的本發(fā)明方法來(lái)分析不屬于結(jié)核^^支桿菌復(fù)^的^4^的鳥^f支桿菌i^菌抹的培4^。圖6顯示了從不屬于結(jié)核^f支桿菌復(fù)M的菌林中分離的DM樣品的雜交數(shù)據(jù)。#^提議的數(shù)據(jù)解析算法，通過tb^含有互補(bǔ)于IS6110的固定的絲苷酸的墊(F8、18)中的熒光信號(hào)強(qiáng)度和4^陰'M"照作用的空白墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)確定^^析的菌林屬于結(jié)核^^支桿菌復(fù)合水。如從圖6中所見，在雜交圖式中，墊F8和I8中沒有信號(hào)。這:l^木著測(cè)試的微生物的基因組不包含插入因子IS6110。因此，^L^析的DNA分離自不屬于結(jié)核^f支桿菌復(fù)^的微生物，并且可以省g藥性的分析。因此，本發(fā)明允許直^^吏用臨席浙料決iiiiM^測(cè)不同形式的對(duì)利福平和異煙肼具有抗性的結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明的方法不同于目前存在的M類似方法的有利^t^于其實(shí)現(xiàn)的簡(jiǎn)單4沐廉價(jià)。利用原始的引物組而進(jìn)行的優(yōu)化的兩步多重PCR允許獲得高靈m(樣品中乾的至少500個(gè)基因組等餘)。利用含有原始的區(qū)分j錄核苷酸組的生物芯片，還可以允許在基因型7jC平上進(jìn);ft^核^^支桿菌的分型(才斜己)。雖然本發(fā)明的實(shí)施方案和它們的優(yōu)點(diǎn)在上面已經(jīng)詳細(xì)描述，但是4^頁(yè)域的專妖員可以4嫁易贈(zèng)加糾和附加物，或者反之，省略一些內(nèi)容，而仍然保持在由下述的相力J要求所闡明的本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列表<110〉INSTITUTMOLEKULYA咖OIBIOLOGIIIM.V.A.ENGELGARDTAROSSIISKOIAKADEMIINAUK<120〉在生物微陣列上同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和復(fù)寫導(dǎo)致微生物對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，該方法中使用的引物組、生物芯片和寡核苷酸探針組<160〉85<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉16<212〉DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>1tggctggtgccgaaga16〈210〉2〈211〉17<212>DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>2ctcagctggctgaagaa<210>3<211〉16<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉3ttggctcagctggctg〈210>4<211>15<212〉,〈213>結(jié)核分枝桿菌〈400〉4ttggctcggctggct<210〉5<211>15<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌171615<400>5ttggctccgctggct〈210〉6<211>16<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>6aattggctcagctggc<210〉7<211>15<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>7aattgggtcagctgg<210〉8〈211〉14<212〉腿〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉8肌ttggcgcagctg的寡核苷酸探針，而且其中所述探針的序列為SEQIDNO:1-69。13、用于制備生物芯片的寡核苷酸探針組，所述生物芯片用于在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致菌林對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DM突變的方法，其中所述探針的序列為SEQIDNO:1-69?！?10〉9<211>19<212〉腿<213>結(jié)核分枝桿菌<400>9tccatgaattggctcagct<210>10<211>17<212>醒<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>10catgaataggctcagct〈210>U〈211>17<212>DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<11catgaatttgctcagct191717<210>12<211>17<212>廳<213>結(jié)核分枝桿菌〈400〉12catgaatgggctcagct<210〉13<211〉18<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>13ttctggtccatgaattgg<210〉14<211>19<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>14gttctggtctatgaattgg<210〉15〈211>18<212>腿〈213〉結(jié)核分枝桿菌〈400〉15ttgttctggtccatgaat<210>16<211>18<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>16ttgttctggaccatgaat<210〉17〈211〉18<212〉腿〈213〉結(jié)核分枝桿菌〈400>17ttgttctggtacatgaat〈210〉18<211〉1818181842<212>DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>18ttgttctggcccatgaat〈210>19<211>18<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉19ttgttctgctccatgaat〈210〉20<211>15〈212〉DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>20tcaaccccgacagcg<210>21<211>15<212〉DNA181815<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉21tcaaccccaacagcg<210>22<211〉17<212>腿<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>22ggcgcttgtgggtcaac<210>23<211>17〈212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉23ggcgcttgtcggtcaac<210>24<211>17<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>24ggcgcttgagggtc咖〈210〉25<211>17<212〉歸<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉25ggcgcttttgggtcaac<210〉26<211〉17<212>畫<213>結(jié)核分枝桿菌〈400>26ggcgcttgcaggtcaac<210〉27<211>17<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌171717<400>27ggcgcttgtaggtcaac<210>28<211>17〈212〉醒<213>結(jié)核分枝桿菌<400>28ggcgcttgttggtcaac<210>29<211>17〈212〉腿<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>29ggcgcttgcgggtcaac<210>30〈211〉17<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉30ggcgcttgggggtcaac17171717<210>31<211>15<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌〈400〉31C3gCgCCg3C3gtCg<210〉32<211>16<212>腿<213〉結(jié)核分枝桿菌〈400〉32ccagcgccaacagtcg<210>33〈211>15<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>33cagcgcccscagtcg151615<210>34〈211〉15<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>34cagcgcacacagtcg<210〉35<211〉15〈212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌〈400>35C3gCgCCtgC3gtCg<210>36<211>17<212〉賺〈213>結(jié)核分枝桿菌<400>36tgccccagcgccgacag<210〉37〈211〉17<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉37tgccccggcgccgac3g<210>38<211>16<212>腿<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>38Cg3tC3CC3gCggC3t<210〉39〈211>15<212>腿〈213〉結(jié)核分枝桿菌〈400〉39cgatcaccacggcat〈210>40<211〉17<212〉腿<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>40cgatcaccacaggcatc<210〉41<211>16<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉41gatcaccaacggcatc<210〉42<211>16<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>42gatcaccatcggcatc<210>43<211>15<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>43gatnccgcggcat,〈210〉44<211>16〈212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉44atcaccagaggcatcg<210>45<211>15<212>鵬<213>結(jié)核分枝桿菌〈400>45gatcaccggcggcat<210>46<211〉15<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌15161551<400>46cgaaatgggEic肌c3<210>47<211〉15<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉47cgaaaggggacaaca〈210>48<211〉16<212>薩<213〉結(jié)核分枝桿菌〈400>48cgaaattggacaacag<210>49<211〉15<212>DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌151516<婦49cgaaatgcgacaaca<210>50<211〉18<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>50tcctcgagatcctgtacg<210〉51<211>18<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>51tcctcgaggtcctgtacg<210〉52〈211〉12<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌〈400>52ccggccgcggeg<210〉53<211>12<212〉DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉53ccggcctcggeg〈210〉54<211〉15<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>54gst鄉(xiāng)ttgtcgggg<210>55<211>15<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>55gataggatgtcgggg121515<210〉56<211〉15<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉56gatagggtgtcgggg<210>57<211>15〈212〉隱<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉57CggCg3g3Cg3t3gg〈210>58〈211〉15〈212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉58cggcg卿tgat鄉(xiāng)<210〉59〈211〉14<212〉腿〈213>結(jié)核分枝桿菌<400>59ggCg3ggCg3t3gg<210>60<211>17<212>腿<213>結(jié)核分枝桿菌〈400>60gcacgatggaatgtcgc<210>61<211>18〈212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉61gcacgatagaatgtcgca<210>62〈211〉16141718<212>腿〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉62tcacggcacgatggaa〈210〉63<211〉16<212>DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>63tC3CggC3tg3tgg33<210>64〈211〉16<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>64tcacggcaagatggaa〈210〉65〈211〉16<212>DNA161616<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>65cacggcacgatggaat<210〉66<211〉16<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉66C3cggcac肌tgg肌t<210〉67<211>16<212〉腿<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉67cttcacggcacgatgg<210>68<211>18<212〉麗<213>結(jié)核分枝桿菌161616〈400〉68acttcscggtacgatgga<210>69<211〉17<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉69ccggagctgcgtgagcg〈210〉70<211>28〈212〉腿<213>結(jié)核分枝桿菌<400>70Cgtgg3ggCg3tC3C3CCgC3g3Cgttg<210>71<211>27<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌181728<400〉71agtgagacgggtgcacgtcgcggacct<210〉72<211>20<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>72cgccgcgatcaaggagttct〈210〉73<211〉20<212>腿〈213>結(jié)核分枝桿菌〈400〉73tcacgtgacagaccgccggg<210>74<211>27<212>DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌■>74tggaagagctcgtatggcaccggaacc27202027<210〉75<211>24<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400〉75cggtgtattgccaagcgccagcag〈210>76<211〉27<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400>76gctctccgtcagctcccactcgtagcc〈210〉77<211〉24〈212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>77ccggaaatcgcagccacgttacgc242724〈210〉78〈211〉27<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<400〉78ggtaaccaggactgaacgggatacgaa〈210>79<211〉23<212>DNA〈213>結(jié)核分枝桿菌<400>79ggccccttcagtggctgtggcag<210〉80<211>31〈212〉腿<213>結(jié)核分枝桿菌<400>80atggtgtgatatatcacctttgcctgacagc<210>81272331<211〉28<212>腿<213>結(jié)核分枝桿菌<400>81ggaattgatcgcc朋tggttagcagtgg<210〉82<211>27<212〉DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>82tgactctxctcatcatcaaagcggaca<210>83<211〉30<212〉醒<213>結(jié)核分枝桿菌〈400>83aggatggggtcatgtc鄉(xiāng)tggttcatcga<210>84<211〉30282730<212〉DNA<213〉結(jié)核分枝桿菌<■〉84gcgaagaaagccgacgcggtctttaaaatc30〈210〉85<211〉22<212〉DNA〈213〉結(jié)核分枝桿菌<400>85cgctgcccactccgaatcgtgc2權(quán)利要求1.一種用于在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致微生物對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其包括(A)-使用一組用于第一PCR步驟的特異性引物對(duì)，多重?cái)U(kuò)增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可動(dòng)因子的片段；(B)-使用在步驟(A)中獲得的PCR產(chǎn)物作為模板、和一組用于第二PCR步驟的特異性引物對(duì)來(lái)多重?cái)U(kuò)增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可動(dòng)因子的片段，其中每對(duì)引物中有一個(gè)引物被熒光標(biāo)記以獲得主要是單鏈熒光標(biāo)記的片段；(C)-制備能夠同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的突變的生物芯片，所述生物芯片由具有膠墊的基質(zhì)組成，每個(gè)墊中固定有獨(dú)特的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸的序列選自如下序列a)與野生型rpoB基因片段序列相應(yīng)的序列；b)與導(dǎo)致微生物對(duì)利福平產(chǎn)生抗性的突變型變體rpoB基因片段序列相應(yīng)的序列；c)與a)和b)中描述的序列互補(bǔ)的序列；d)與野生型katG基因片段序列相應(yīng)的序列；e)與導(dǎo)致微生物對(duì)異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體katG基因片段序列相應(yīng)的序列；f)與d)和e)中描述的序列互補(bǔ)的序列；g)與野生型inhA基因片段序列相應(yīng)的序列；h)與導(dǎo)致微生物對(duì)異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體inhA基因片段序列相應(yīng)的序列；i)與g)和h)中描述的序列互補(bǔ)的序列；j)與野生型ahpC基因片段序列相應(yīng)的序列；k)與導(dǎo)致微生物對(duì)異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體ahpC基因片段序列相應(yīng)的序列；1)與j)和k)中描述的序列互補(bǔ)的序列；m)與可動(dòng)因子IS6110的序列相應(yīng)的序列；o)與描述于m)中的序列互補(bǔ)的序列；(D)-在能為雜交時(shí)形成的區(qū)配和錯(cuò)配的雙鏈體之間提供一個(gè)核苷酸的分辨率的條件下，在生物芯片上讓在步驟(B)中獲得的擴(kuò)增出的標(biāo)記產(chǎn)物雜交；(E)-記錄和解析雜交數(shù)據(jù)。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第一步驟(A)中使用的該組特異性引物對(duì)的序列為SEQIDN0:70、71、74、75、77、78、80、81、83、84。3、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用的該組特異性引物對(duì)的序列為SEQIDNO:72、73、74、76、77、79、80、82、83、85。4、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用的熒光標(biāo)記的引物相對(duì)于來(lái)自該引物對(duì)的另一引物來(lái)說(shuō)是摩爾過量的，以便對(duì)于所有引物對(duì)都獲得主要是單鏈熒光標(biāo)記的片段。5、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基因和可動(dòng)因子/5Vf/"的片段的擴(kuò)增直接使用來(lái)自臨床樣品的材料(痰、滲出物、洗出液、支氣管肺泡灌洗液)或微生物的初步生長(zhǎng)培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行。6、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，使用的生物芯片包含具有由SEQIDNO:1-69所示序列的固定的寡核苷酸組。7、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于使用雜交緩沖液，該緩沖液允許在擴(kuò)大的溫度區(qū)間內(nèi)進(jìn)行雜交以便為雜交時(shí)形成的匹配和錯(cuò)配的雙鏈體之間提供一個(gè)核苷酸的分辨率。8、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于使用便攜式熒光分析儀和軟件進(jìn)行步驟(E)中的數(shù)據(jù)記錄，所述軟件允許進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度的自動(dòng)處理以用于隨后的數(shù)據(jù)解析。9、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(E)中獲得的數(shù)據(jù)的解析是通過比較墊中的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行的，在所述墊中形成了匹配和錯(cuò)配的雜交雙鏈體。10、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中解析結(jié)果可以用于利用存在一個(gè)或另一個(gè)作為標(biāo)記的突變來(lái)證實(shí)結(jié)核病的臨床診斷和進(jìn)行流行病學(xué)遺傳分型。11、特異性引物對(duì)組，所述引物對(duì)組用于實(shí)現(xiàn)在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致菌株對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其中所述引物的序列為SEQIDN0:70-85。12、生物芯片，其用于在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致菌林對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其中所述生物芯片由具有膠墊的基質(zhì)組成，其中在每個(gè)墊中固定有獨(dú)特的寡核苷酸探針，而且其中所述探針的序列為SEQIDNO:1-69。13、用于制備生物芯片的寡核苷酸探針組，所述生物芯片用于在臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致菌林對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DM突變的方法，其中所述探針的序列為SEQIDNO:1-69。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和醫(yī)學(xué)，并且提供在區(qū)分性生物芯片上在臨床樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體并同時(shí)評(píng)價(jià)菌株對(duì)利福平和異煙肼的敏感性的方法。該方法基于2步多重PCR來(lái)獲得熒光DNA片段，然后讓這些片段在包含特異的區(qū)別性寡核苷酸組的微陣列上雜交。通過評(píng)價(jià)在微生物DNA中的點(diǎn)核苷酸取代來(lái)確定結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的抗性。本發(fā)明允許直接分析臨床樣品，以便能同時(shí)評(píng)價(jià)大量突變，從而降低分析成本，減少實(shí)施時(shí)間。本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的引物組、生物芯片、和寡核苷酸探針組。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101210265SQ20061013097公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月26日優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日發(fā)明者A·D·米爾加貝科夫,A·S·加塞達(dá)特勒夫,A·Y·索博勒夫,D·A·格亞杜諾夫,S·A·拉帕,V·M·米卡伊洛維奇申請(qǐng)人:俄羅斯科學(xué)院V·A·恩格爾哈特分子生物學(xué)研究所