專利名稱：煙草生物質(zhì)的用途的制作方法
本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，母案申請(qǐng)日為2002年6月5日，申請(qǐng)?zhí)枮?2811426.4(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US02/17706)，發(fā)明名稱為“煙草生物質(zhì)的用途”。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供了將低煙堿煙草用作(除了其他用途外)蛋白，纖維，乙醇和動(dòng)物飼料來(lái)源的方法。
背景技術(shù)：
煙草植物可被有效地用以獲得大量生物質(zhì)。這些生物質(zhì)可以通過(guò)在田地里將煙草種子簡(jiǎn)單而緊密地直接種植在一起來(lái)生產(chǎn)。由于煙草在割除后再生旺盛，因此種植煙草的田地可以在煙草植物長(zhǎng)至18至24英寸的高度時(shí)即進(jìn)行收割(傳統(tǒng)煙草植物一般在大約4英尺時(shí)收割)，稠密的新生植物即會(huì)替代被刈除的植物。如果植物在每一個(gè)收割季節(jié)按這樣的方式被收割3至4次，那么每英畝即可生出大約100噸的煙草生物質(zhì)。在脫去80％至90％的水分后，正如大部分植物包含的，保留的干燥固體重量大約為10-20噸。除了能高效生產(chǎn)生物質(zhì)以外，煙草還是一種具有非常多用途的植物。與谷類，如小麥和玉米不同的是，煙草不缺乏必需氨基酸。煙草是一種基本無(wú)過(guò)敏原的蛋白來(lái)源，所述蛋白含有對(duì)人類和大部分家畜非常重要的全部20種氨基酸，而且含有高比例的可消化糖和淀粉。煙草還是一種高級(jí)食用纖維源，反芻動(dòng)物對(duì)其有比羊茅(fescue hay)更好的消化能力。煙草的纖維容量要比苜蓿和麥麩高很多。通過(guò)種植煙草生物質(zhì)，優(yōu)質(zhì)農(nóng)田可轉(zhuǎn)向種植其他農(nóng)植物這對(duì)耕地有限的國(guó)家或地區(qū)具有重要的意義。
因此，提供一種以多產(chǎn)、有效和無(wú)毒的方式利用這一植物的新方法具有重要價(jià)值。 發(fā)明概述 本發(fā)明基于如下認(rèn)識(shí)低煙堿重組煙草能很好地適用于多種替代用途，包括但不限于(a)作為給家畜及類似動(dòng)物的草料農(nóng)作物；(b)作為動(dòng)物的飼料或飼料成分；(c)作為蛋白來(lái)源；(d)作為添加至動(dòng)物飼料和食品中的纖維來(lái)源；(e)作為乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的底物；(f)作為通過(guò)“分子農(nóng)業(yè)(molecular farming)”技術(shù)生產(chǎn)的重組或轉(zhuǎn)基因蛋白來(lái)源；(g)為完成兩個(gè)或兩個(gè)以上前述用途的基于單一植物，或批量或大批量植物的聯(lián)合步驟。
通常，用于實(shí)施本發(fā)明的低煙堿重組煙草植物包含并表達(dá)至少編碼煙草中煙堿生物合成所需酶的一個(gè)片段的異源DNA，該煙草植物與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物相比，表現(xiàn)為減低的酶水平和減低的煙堿含量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該煙草植物與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物相比，更進(jìn)一步表現(xiàn)為還原糖水平的增加。
本發(fā)明的第一個(gè)方面為一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括提供上述低煙堿重組煙草植物；將該植物置于發(fā)酵容器中發(fā)酵足夠長(zhǎng)的時(shí)間以從中生產(chǎn)乙醇；隨后從發(fā)酵容器中收集乙醇。術(shù)語(yǔ)“植物”包括其物理和化學(xué)部分，比如植物各部分以及植物提取物，水解產(chǎn)物等。
在上面所述生產(chǎn)乙醇的方法中，其還包含在所述發(fā)酵步驟之前或之后從所述植物或植物部分中收集蛋白級(jí)分的步驟。
本發(fā)明的第二個(gè)方面為一種維持動(dòng)物對(duì)象的方法，包括飼以動(dòng)物體上述低煙堿重組煙草。飼養(yǎng)可以采用任何適用的方式，如飼以動(dòng)物體包含煙草的飼料農(nóng)作物；飼以動(dòng)物煙葉；飼以動(dòng)物包含煙草的青貯飼料；和/或飼以動(dòng)物包含煙草的食品，可任意地與至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑聯(lián)合使用。
本發(fā)明的第三個(gè)方面為一種食品，其包括低煙堿重組煙草植物。該食品可被制成任何適用形式，如青貯飼料或與至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑聯(lián)合使用的煙草植物。該食品可包括葉子(即，來(lái)自植物的可辨別的葉子或葉子碎片或植物碎片)或其他從植物中分離的級(jí)分。
本發(fā)明的第四個(gè)方面為一種從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)蛋白級(jí)分的方法(舉例來(lái)說(shuō)，級(jí)分I蛋白和/或級(jí)分II蛋白)，包括如下步驟提供上述低煙堿重組煙草植物，然后從重組煙草植物中收集蛋白級(jí)分。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面包括將上述低煙堿重組煙草植物用作分子農(nóng)業(yè)的用途。
本發(fā)明的前述和其他目標(biāo)及方面將在如下表述中給出更詳細(xì)的解釋。
優(yōu)選實(shí)施例詳述 用于本方法的植物為煙草屬植物，或煙草，包括但不限于普通煙草(N tabacum)，黃花煙草(N rustica)，心葉煙草(N glutinosa)。此處涉及的“煙草”意指和包括煙草屬的任意植物，種類，或雜合體。任何品系或種類的煙草都是可用的。優(yōu)選的是已經(jīng)表現(xiàn)為低煙堿含量的品系，如Nic1/Nic2雙突變體。該植物通過(guò)下面更為詳述的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行修飾以減低其煙堿含量。
如本文所使用的，涉及的“低煙堿”意指包含少于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的非轉(zhuǎn)基因親本(或無(wú)修飾的對(duì)照)植物中煙堿含量一半，優(yōu)選少于25％，更優(yōu)選少于20％或少于10％煙堿含量的重組(或轉(zhuǎn)基因)煙草。與相應(yīng)非修飾對(duì)照植物相比，可以在本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)基因植物中保留至少1％或5％級(jí)別的低水平的煙堿殘余量。
需要特別指出的是，納入本文作為參考的全部美國(guó)專利均為整體引用。
A.低煙堿煙草植物 用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的低煙堿煙草植物一般地為包含并表達(dá)異源核酸的重組煙草植物，所述異源核酸的表達(dá)可以減量調(diào)節(jié)植物中的酶，如喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(quinolate phosphoribosyl transferase)(QPRTase)，腐胺甲基轉(zhuǎn)移酶(PMTase)，精氨酸脫羧酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，NADH脫氫酶，或磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶，從而可以減少植物中煙堿的生成。適用的植物已被公開(kāi)于M.Conkling等的PCT申請(qǐng)WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申請(qǐng)WO00/67558(2000年11月16日公布)中，這一公開(kāi)的內(nèi)容納入本文作為參考。一般的，異源核酸包括編碼待減量調(diào)節(jié)的酶的核酸的至少一個(gè)片段，該片段以有義或反義方向存在。
優(yōu)選地，低煙堿煙草還包括減低的(例如，至少90％，95％或99％重量百分比，或更高)煙草特異的亞硝胺水平，這一減低是與沒(méi)有相應(yīng)煙堿減少的植物中所含量相比較而言的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用了與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比具有減低的喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPRTase)表達(dá)水平的低煙堿重組植物，所述重組植物包含重組植物細(xì)胞，該細(xì)胞包含外源DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從5’至3’方向，在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶mRNA的至少一個(gè)片段的異源DNA，所述異源DNA可操作性地與所述啟動(dòng)子聯(lián)合，且所述異源DNA可以是有義或反義方向；所述植物與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比表現(xiàn)為喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPRTase)表達(dá)水平的減低和煙堿含量的減低。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例可以用與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比具有減低的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMTase)表達(dá)水平的低煙堿重組植物，所述重組植物包含重組植物細(xì)胞，該細(xì)胞包含外源DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從5’至3’方向，在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物PMT mRNA的至少一個(gè)片段的異源DNA，所述異源DNA可操作性地與所述啟動(dòng)子聯(lián)合，且所述異源DNA可以是有義或反義方向的；所述植物與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比表現(xiàn)為PMT表達(dá)水平的減低和煙堿含量的減低。其他實(shí)施例同樣可以用上面列舉的其他酶用上述相似的方法來(lái)實(shí)施。
前述核酸構(gòu)建體可包括上游(5’端)和/或下游(3’端)的絕緣子元件，舉例來(lái)說(shuō)，正如Thompson等的美國(guó)專利6,100,448和6,037,525中指出的那樣。另外，前述構(gòu)建體可包括上游和/或下游的基質(zhì)(或支架)結(jié)合區(qū)域，舉例來(lái)說(shuō)，正如Thompson等的美國(guó)專利5,773,695和5,773,689中指出的那樣。
雖然本文所述植物通常被描述為含有一個(gè)能減量調(diào)節(jié)煙堿合成途徑中單個(gè)酶的單個(gè)重組核酸，但很清楚，本發(fā)明所使用的植物也可含有多種能減量調(diào)節(jié)煙堿合成途徑中多個(gè)酶(例如，PMTase和QPRTase)的重組核酸。所述包含單個(gè)重組核酸的植物因此也包括那些含有多個(gè)重組核酸的。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中使用同時(shí)包含與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比減少的QPRTase和減少的PMTase的低煙堿重組植物，所述重組植物包含重組植物細(xì)胞，該細(xì)胞包含(i)第一外源DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從5’至3’方向，在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶mRNA的至少一個(gè)片段的異源DNA，所述異源DNA可操作性地與所述啟動(dòng)子聯(lián)合，(ii)第二外源DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從5’至3’方向，在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物PMT mRNA的至少一個(gè)片段的異源DNA，所述異源DNA可操作性地與所述啟動(dòng)子聯(lián)合，且所述異源性DNA可以是有義或反義方向的；所述植物與非轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比表現(xiàn)為PMT表達(dá)水平的減低和煙堿含量的減低。在所述有義和反義減量調(diào)節(jié)的情況下，其他技術(shù)如核酶或干預(yù)性互補(bǔ)mRNA也是可以使用的。
可用于實(shí)施本發(fā)明的核酸序列實(shí)例包括，但不限于，編碼煙草喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶基因的DNA(NtQPT1)，其為已知的(參見(jiàn)，如，Conkling等的PCT申請(qǐng)WO98/5556923；和編碼煙草腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA如PMTl，PMT2，PMT3和PMT4)，編碼煙草精氨酸脫羧酶的DNA如ADCl和ADC2，編碼煙草鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的DNA，編碼煙草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的DNA，編碼煙草NADH脫氫酶的DNA，編碼煙草磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶的DNA(其為已知的并被描述于M.Timko等的PCT申請(qǐng)WO00/67558中)。
編碼表達(dá)上述具有期望酶活性的蛋白的其他DNA序列與上述DNA，或與其他編碼上述酶蛋白的DNA序列的雜交條件可以用常規(guī)方法予以確定。例如，所述序列的雜交可以在低嚴(yán)格條件或甚至嚴(yán)格條件(如，在編碼上述蛋白的DNA的標(biāo)準(zhǔn)原位雜交試驗(yàn)中，雜交條件以洗滌條件表示為0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉，0.1％SDS，溫度為60℃或甚至是70℃。參見(jiàn)J.Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第2版.1989)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室))下進(jìn)行。通常，此類序列與前述序列或編碼前述蛋白的DNA序列相比，有至少65％的相似性，75％的相似性，80％的相似性，85％的相似性，90％的相似性，或甚至95％的相似性，或更高的相似性。(可以通過(guò)利用兩個(gè)比對(duì)以獲得最大匹配程度的序列來(lái)確定序列相似性，匹配的兩序列的任一個(gè)中的缺口在做最佳匹配時(shí)均被考慮在內(nèi)。優(yōu)選的缺口長(zhǎng)度為10或小于10，更優(yōu)選的缺口長(zhǎng)度為5或小于5，而更優(yōu)選的缺口長(zhǎng)度為2或小于2)。
本發(fā)明方法所使用的異源序列可經(jīng)選擇以便生成與編碼酶序列的完整信息，或其部分互補(bǔ)的RNA產(chǎn)物。序列可互補(bǔ)于天然信使RNA的任何連續(xù)序列，即，其可以與內(nèi)源mRNA序列互補(bǔ)于接近5’端或加帽位點(diǎn)，加帽位點(diǎn)的下游，在加帽位點(diǎn)與起始密碼子之間，并且可以覆蓋全部或部分非編碼區(qū)，跨過(guò)非編碼區(qū)和編碼區(qū)，互補(bǔ)于全部或部分編碼區(qū)，互補(bǔ)于編碼區(qū)的3’端，或互補(bǔ)于mRNA的3’非翻譯區(qū)。適用的反義序列可以為從約12，14或15至約15，25或35個(gè)核苷酸，至少約為50個(gè)核苷酸，至少約為75個(gè)核苷酸，至少約為100個(gè)核苷酸，至少約為125個(gè)核苷酸，至少約為150個(gè)核苷酸，至少約為200個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸。另外，序列可在其3’或5’端延伸或縮短(例如，增加1至4或8個(gè)額外的核酸殘基)。反義產(chǎn)物可互補(bǔ)于天然存在的靶RNA的編碼或非編碼(或兩者)部分。特定的反義序列和反義序列的長(zhǎng)度將會(huì)根據(jù)需要的抑制程度，反義序列的穩(wěn)定性等而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)以及本文提供的信息中可以得到選擇適當(dāng)?shù)拿阜戳x序列的提示。
如上述，本發(fā)明還能使用實(shí)施了有義共抑制煙堿生成的植物來(lái)實(shí)施。用于實(shí)施本發(fā)明的有義DNAs，當(dāng)其在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，具有適用于能抑制所述植物酶在植物細(xì)胞中天然表達(dá)的長(zhǎng)度。該有義DNAs可以基本上是完整基因組或編碼酶的互補(bǔ)DNA，或其片段，所述片段的典型長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在現(xiàn)有技術(shù)中獲得確定抑制細(xì)胞中天然基因表達(dá)的有義DNA長(zhǎng)度的方法。本發(fā)明還可用包含編碼由反義序列和有義序列互補(bǔ)組成的雙鏈RNAs的DNAs的植物進(jìn)行實(shí)施，該序列表達(dá)時(shí)能夠抑制或使包含該序列的內(nèi)源基因沉默。適用的互補(bǔ)區(qū)域可為至少約20至25個(gè)核苷酸，且可被至少約5個(gè)核苷酸分開(kāi)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，用包含編碼RNA酶分子(即，核酶)的DNA片段的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草屬植物細(xì)胞，所述RNA酶分子針對(duì)(即，剪切)編碼所述植物酶的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本。核酶包含底物結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域與靶mRNA的可接近區(qū)域相結(jié)合，還含有催化RNA的剪切，阻止翻譯和蛋白生成的結(jié)構(gòu)域。該結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包括與靶mRNA序列互補(bǔ)的反義序列；該催化基序可為錘頭基序或其他基序，如發(fā)卡基序。RNA靶的核酶剪切位點(diǎn)可通過(guò)掃描尋找靶分子的核酶剪切位點(diǎn)(如，GUA，GUU或GUC序列)來(lái)作初始識(shí)別。一經(jīng)識(shí)別，與包含剪切位點(diǎn)的靶基因區(qū)域相應(yīng)的15，20，30或更多個(gè)核苷酸的短RNA序列可被評(píng)估以確定預(yù)期的結(jié)構(gòu)特征。候選靶標(biāo)的適用性同樣可以通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的可實(shí)現(xiàn)性從而得到評(píng)價(jià)。編碼核酶分子的DNA可根據(jù)公知技術(shù)來(lái)獲得。參見(jiàn)，例如，T.Cech等的美國(guó)專利4,987,071；Donson等的美國(guó)專利5,589,367；Torrence等的美國(guó)專利5,583,032；Joyce的美國(guó)專利5,580,967；Wagner等的美國(guó)專利5,591,601和美國(guó)專利5,622,854。在植物細(xì)胞中生成所述核酶分子和中斷酶蛋白生成以減低酶活性的方式基本上與生成反義RNA分子的方式相同也即是說(shuō)，通過(guò)中斷mRNA在生成酶的細(xì)胞中的翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)。本文中所用術(shù)語(yǔ)“核酶”指含有RNA的核酸，其具有酶的功能，(如核糖核酸內(nèi)切酶)，而且可以與“核酶分子”相互替換。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，減量調(diào)節(jié)煙堿生成可以通過(guò)采用干預(yù)性互補(bǔ)mRNA以實(shí)現(xiàn)抑制mRNA翻譯的方法來(lái)實(shí)施，所述干預(yù)性互補(bǔ)mRNA如美國(guó)專利5,272,065中的記載。
為了生產(chǎn)與未轉(zhuǎn)化對(duì)照煙草植物相比具有低酶水平的煙草植物(并由此減低煙堿含量)，可以在煙草細(xì)胞中轉(zhuǎn)入含有部分酶核酸序列，全長(zhǎng)酶核酸序列(有義或反義方向)，適當(dāng)?shù)目刹僮餍赃B接的調(diào)節(jié)序列或編碼上述核酶的序列的外源轉(zhuǎn)錄單位。合適的調(diào)節(jié)序列包括在轉(zhuǎn)化的植物中可操作的轉(zhuǎn)錄起始序列(“啟動(dòng)子”)，和聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列。如限制性酶切作圖，DNA印跡雜交，和核苷酸序列分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于確定具有反義方向的并與調(diào)節(jié)序列可操作性連接的酶序列的克隆。隨即用成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成煙草植物。最優(yōu)選的，所用的反義序列與內(nèi)源序列互補(bǔ)，但是，外源或內(nèi)源序列的較小變異是可以容忍的。優(yōu)選的，反義DNA序列具有充分的序列相似性，其能夠在下述嚴(yán)格條件下與欲調(diào)節(jié)的細(xì)胞中的外源序列相結(jié)合。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)而言，生產(chǎn)重組煙草植物的特定技術(shù)可以從現(xiàn)有技術(shù)中獲得，且被詳細(xì)記載于前面提及的M.Conkling等的PCT申請(qǐng)WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申請(qǐng)WO00/67558(2000年11月16日公布)中。
B.煙葉作為動(dòng)物飼料或食品添加劑 本發(fā)明的第二個(gè)方面為一種維持動(dòng)物對(duì)象的方法，包括飼以動(dòng)物體前述低煙堿重組煙草(包括植物和植物部分兩者)。可飼以依照本發(fā)明的植物(或下述食品)的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物(包括反芻動(dòng)物)，如奶牛，綿羊和豬，還有家禽如雞和火雞，魚(yú)和其他。
在一個(gè)實(shí)施例中，被用作食物，或用于生產(chǎn)食品的植物或植物部分包含前述升高的還原糖水平。
飼養(yǎng)可以采用任何適用的方式，如飼以動(dòng)物體包含煙草的飼料農(nóng)作物；飼以動(dòng)物煙葉；飼以動(dòng)物包含煙草的青貯飼料；和/或飼以動(dòng)物包含煙草的食品，并與至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑聯(lián)合使用。
本發(fā)明的食品包含低煙堿重組煙草植物。該植物可以任何形式包含于食品中，如葉子或切碎的葉子，植物部分(例如，含有還原糖的提取物)，等等。該食品可含有任意適用量的重組植物(或植物部分)例如，從1％，5％或10％至90％，95％或99％的重量百分比(或更大重量比)，余量則包含另外的營(yíng)養(yǎng)劑或添加劑.該食品可采用任何適用形式，如青貯飼料或煙草植物，其與至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑聯(lián)合使用.該食品可包括葉子(即，來(lái)自植物的可辨別的葉子或葉子碎片或植物碎片)或其他從植物分離的級(jí)分。如有需要，該食品也可被干燥或凍干。當(dāng)作為飼料農(nóng)作物時(shí)，煙草植物可以簡(jiǎn)單地通過(guò)來(lái)自田地里種植的，或干燥的或部分干燥的和捆扎留用的莖稈來(lái)喂飼動(dòng)物，也可選擇性地用其他級(jí)分處理(參見(jiàn)，例如，Glabe的美國(guó)專利4,034,117)，或儲(chǔ)藏和至少部分發(fā)酵并用于青貯飼料(參見(jiàn)，例如，Glabe等的美國(guó)專利4,015,018)。
按照本發(fā)明的用作動(dòng)物食物或用于食品生產(chǎn)的煙草植物可用遺傳工程使之含有并表達(dá)編碼肌醇六磷酸酶的異源核酸，從而使其與無(wú)修飾的植物相比，含有提高的肌醇六磷酸酶水平，如S.Austin-Phillips等的美國(guó)專利5,900,525中描述的那樣(WARF)。
可以與所述植物或植物部分聯(lián)合使用以生產(chǎn)本發(fā)明的食品的其他營(yíng)養(yǎng)劑或添加劑可包括糖，脂肪，脂類和/或蛋白。用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料的糖源包括，如，谷物，燕麥，大麥，高粱，或其組合。這些谷類優(yōu)選地磨為粗粉以用于動(dòng)物飼料。增補(bǔ)性蛋白源包括，例如，大豆粗粉，魚(yú)粗粉，血粗粉，家禽副產(chǎn)品(磨碎的家禽下水)，內(nèi)粗粉，羽毛溶解產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如，Shin的美國(guó)專利4,908,220)以及其組合。動(dòng)物飼料包含來(lái)自全部蛋白源(來(lái)自煙草植物及其他)的約13％至約25％重量比的蛋白。植物或植物部分可為單一蛋白源，或如上被增補(bǔ)的。如有需要，飼料中可包含少量的其他營(yíng)養(yǎng)劑，如維生素，礦物質(zhì)，抗生素和其他物質(zhì)或組合物。這些成分可用任何適用步驟混合在一起，并可被制成任何適用的形式，如食物小球。如有需要，煙草可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因修飾以生成所述的附加營(yíng)養(yǎng)劑。
C.使用煙草的乙醇發(fā)酵 從植物材料中生產(chǎn)乙醇或其他物質(zhì)如丙酮的發(fā)酵方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)，例如，C.Weizmann，Production of Acetone and Alcoholby Bacteriological Processes，美國(guó)專利1,315,585(1919)。所需產(chǎn)品可從某些成分，如生物質(zhì)中的糖，生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素，或二者，中制備。一般來(lái)說(shuō)，糖和淀粉要比纖維素和半纖維素容易發(fā)酵。發(fā)酵方法可以用很多方法中的任何一種進(jìn)行實(shí)施，下面將舉出其中的一些實(shí)施方式。認(rèn)識(shí)到發(fā)酵可以通過(guò)使用未處理的植物材料或植物材料中的多種成分(例如，糖和纖維素級(jí)分)來(lái)實(shí)施，因此當(dāng)其他成分如蛋白級(jí)分從植物材料中分離出以作為其他目的(如下述分離級(jí)分I和/或級(jí)分II蛋白)時(shí)，后者就是優(yōu)選的。而且，生物質(zhì)可經(jīng)預(yù)處理以使之適用于特殊的發(fā)酵過(guò)程，這要依賴于所采用的發(fā)酵方法(例如，用酶消化纖維素以制備可溶性糖)。
可用于實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)發(fā)酵方法的特定實(shí)施例已經(jīng)披露于Jeffries的美國(guó)專利4,663,284中，該專利提供了用木糖代謝酵母與D-木糖一起發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇的方法，在所述發(fā)酵方法期間于發(fā)酵介質(zhì)中加入微量葡萄糖。
Gong的美國(guó)專利4,511,656提供了一種用酵母突變體發(fā)酵D-木糖而直接從D-木糖中生產(chǎn)乙醇的方法。該方法進(jìn)一步提供了通過(guò)酵母發(fā)酵D-葡萄糖和D-木糖，從而直接和同時(shí)地從纖維素和半纖維素混合物中獲得乙醇的方法。
Gong的美國(guó)專利4,490,468中提供了一種針對(duì)木糖預(yù)先異構(gòu)化得到的木酮糖的厭氧發(fā)酵方法。
Gong的美國(guó)專利4,368,268中提供了一種從木酮糖中生產(chǎn)乙醇的方法。該方法包括木糖異構(gòu)化為木酮糖和將木酮糖發(fā)酵為乙醇。本質(zhì)上，該方法是用需氧或厭氧酵母菌突變體，對(duì)半纖維素水解產(chǎn)物中的木糖單獨(dú)或與其他糖一齊發(fā)酵。
Wu的美國(guó)專利4,840,903提供了一種從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法。該方法包括從生物質(zhì)中產(chǎn)生底物，該底物包括纖維素和半纖維素的水解產(chǎn)物。一種擬青霉真菌同時(shí)具有將纖維二糖和木糖發(fā)酵為乙醇的能力(例如，擬青霉菌種NF1)，該真菌被選用并被分離，然后將其接種于底物上。接種的溶液在利于細(xì)胞存活和利于水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為乙醇的條件下進(jìn)行發(fā)酵，然后從發(fā)酵液中回收乙醇。
D.Spindler等的美國(guó)專利5,100,791公開(kāi)了一種從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法。該方法包括從生物質(zhì)中產(chǎn)生底物，該底物包含纖維素和半纖維素的水解產(chǎn)物。一種卡斯酒香酵母(Brettanomycescustersii)(CBS 5512)同時(shí)具有發(fā)酵纖維二糖和葡萄糖為乙醇的能力，該真菌被選用并被分離。然后將其接種于底物上。接種的底物在利于細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)化水解產(chǎn)物為乙醇的條件下進(jìn)行發(fā)酵。
M.Lastick等的美國(guó)專利5,372,939公開(kāi)了一種從木糖和纖維素混合物中生產(chǎn)乙醇的方法，且在預(yù)定條件下用酶將上述這些碳水化合物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖。在存在粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)ATCC編號(hào)2476的情況下，同時(shí)用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素為葡萄糖和用木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖來(lái)完成該方法。該酶方法可以允許在同一個(gè)發(fā)酵過(guò)程中用酵母將這些可發(fā)酵糖類，葡萄糖和木酮糖轉(zhuǎn)化為乙醇。
前述為可用于實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵方法的說(shuō)明性描述，但并不是限制性的。很多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其他方法也可用于實(shí)施所述的發(fā)酵。而且，雖然所述發(fā)酵主要是指乙醇生成，但其他溶劑如丙酮也可以用所述發(fā)酵方法制得。
D.從煙葉中分離級(jí)分I和級(jí)分II蛋白 如S.Wildman和P.Kwanyuen(Leaf Porteins Inc.)的美國(guó)專利4,347,324和4,268,632中所描述的，特定植物(包括煙草)的多汁葉片，由10％-20％的固型物以及剩余量的水組成。固型物部分由水溶性成分和水不溶性成分組成，對(duì)大多數(shù)而言，后者為葉片的纖維性結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
水溶性成分可分為兩類。一類包括分子量相對(duì)較低的化合物。另一類幾乎全部是分子量約為30,000道爾頓或更大分子量的蛋白。該類蛋白可分為兩部分。一部分包含分子量從大約30,000道爾頓至100,000道爾頓的蛋白混合物。這些蛋白有時(shí)被稱為“級(jí)分2蛋白”。剩余的部分包含分子量約為550,000道爾頓的單一蛋白，其有時(shí)被稱為“級(jí)分1蛋白”。
級(jí)分1蛋白是一種與光合作用有關(guān)的酶，且已作為核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，羧基歧化酶，核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，和核酮糖-1，5二磷酸羧化酶-加氧酶而為本領(lǐng)域所熟知。級(jí)分1蛋白可以占葉子總蛋白含量的多至25％，占葉子固型物的多至10％。
提純的級(jí)分1蛋白為無(wú)嗅，無(wú)味，無(wú)色，且具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？紤]到這些特性，且因?yàn)槠淇色@得高純化狀態(tài)，級(jí)分1蛋白被認(rèn)為具有作為動(dòng)物和人的食品添加劑的潛在用途。用于人時(shí)，該添加劑可以是高蛋白或其他特定飲食的成分。例如，其已經(jīng)被建議作為需透析的腎臟病人的食物補(bǔ)充品。
分離級(jí)分1蛋白的多種方法是本領(lǐng)域所熟知的。S.Wildman和P.Kwanyuen的美國(guó)專利4,347,324和4,268,632中已經(jīng)描述了分離級(jí)分1蛋白的三個(gè)基本方法。這三種基本方法都是從將葉子，或植物的葉和莖，漿液化開(kāi)始，然后從漿液中榨出綠汁。對(duì)該包含細(xì)碎微粒狀綠色物質(zhì)的綠汁進(jìn)行澄化處理，如，用過(guò)濾或離心的方法進(jìn)行處理，以便從液體中分離出細(xì)碎微粒狀固體物質(zhì)。最終的液體呈褐色。
第一種方法包括，濃縮級(jí)分1蛋白，同時(shí)用分子過(guò)濾的方法將其從褐液中較低分子量的化合物中部分分離出來(lái)。通過(guò)使用篩孔能夠通過(guò)較小分子但不能濾過(guò)級(jí)分1蛋白的分子篩，褐液在壓力下過(guò)篩，從而使小分子通過(guò)篩孔。包含級(jí)分1蛋白的溶液隨即被濃縮約10倍，然后進(jìn)行透析處理，以除去溶液中其他小分子。透析過(guò)程中使用火棉膠型透析袋。透析袋的篩孔不能通過(guò)級(jí)分1蛋白但允許小分子通過(guò)透析袋進(jìn)入水中。在透析過(guò)程中，級(jí)分1蛋白晶體形成。
第二種方法包括，將獲自葉子的褐液通過(guò)Sephadex層析柱。Sephadex G-25或G-50均可用于該分離過(guò)程。選擇其內(nèi)部可以滲透進(jìn)小分子的合適珠子，從而將大分子排除在外。因此，大分子僅存在于緊密壓緊的Sephadex珠子間隙的液體中。該間隙被稱為 “空體積”。為獲得有效的分離，褐液體積不能超過(guò)約25％的全部珠子體積。珠子首先用緩沖液平衡，隨后包含同樣緩沖液的一定量的褐液加于Sephadex柱上。褐液用緩沖溶液經(jīng)過(guò)柱子而進(jìn)行洗脫。當(dāng)液體自上而下流經(jīng)柱子時(shí)，由于小分子滲透進(jìn)珠子內(nèi)部，因此小分子的通過(guò)即被阻滯。另一方面，級(jí)分1大分子以較快的速率通過(guò)由珠子間隙形成的迷路而流經(jīng)柱子后，呈現(xiàn)為澄清褐色溶液。但是，洗脫會(huì)造成溶液至少2倍的稀釋。除去小分子會(huì)改變級(jí)分1蛋白分子周圍的環(huán)境，從而引發(fā)級(jí)分1分子結(jié)晶。
第三種方法包含將上述褐液通過(guò)Sephadex-G25柱。如果級(jí)分1蛋白未發(fā)生結(jié)晶，象處理煙草以外所有植物提取物那樣，則加入硫酸銨直至溶液處于30％一50％的飽和狀態(tài)。這使得無(wú)定型物質(zhì)沉淀，再用離心方法將其回收。分離后，沉淀重溶于較之沉淀前體積小的緩沖液中，然后加入8％的聚乙二醇。該混合物被置于一開(kāi)口盤(pán)中，該盤(pán)與另一含有硅膠的開(kāi)口盤(pán)毗鄰，所述兩盤(pán)置于一密閉容器中。水分逐漸從蛋白溶液中蒸發(fā)而被硅膠吸收。在該過(guò)程中，級(jí)分1晶體增長(zhǎng)。
Wildman和Kwanyuen的美國(guó)專利4,268,632中公開(kāi)了一種分離級(jí)分1蛋白的方法，包括如下步驟將葉子漿液化，在低于導(dǎo)致蛋白變性的溫度下加熱漿液中的液體部分，隨后在能使級(jí)分1蛋白，即核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，結(jié)晶的溫度下冷卻液體部分。Wildman和Kwanyuen的美國(guó)專利4,347,324中公開(kāi)了一種針對(duì)前述方法的改進(jìn)方法，該改進(jìn)方法中將原先認(rèn)為很重要的加熱步驟去除。在該改進(jìn)方法中，采用調(diào)整來(lái)自葉子的漿液的液體部分的pH值的方法來(lái)獲取晶體形式的核酮糖-1，5二磷酸羧化酶，pH值在如下范圍內(nèi)調(diào)整從約6的pH值至大于能使蛋白變性并沉淀為無(wú)定型物質(zhì)的pH值，即大于等電點(diǎn)(出現(xiàn)于大約pH5.0)的pH值。在分離出不溶的物質(zhì)后，靜置所述液體，優(yōu)選的在低于環(huán)境溫度下冷卻，從而使得級(jí)分1蛋白結(jié)晶。
D.Bourque(University Patents，Inc.)的美國(guó)專利4,400,471中公開(kāi)了一種從光合作用生物中結(jié)晶級(jí)分I蛋白的方法，所述方法包括從植物中分離并純化蛋白；在適用溶劑中混合蛋白，于預(yù)定pH下制得蛋白溶液；將沉淀液與蛋白溶液混合，所述沉淀液具有低于蛋白溶液的pH值，其范圍為4.8至7.2，從而使混合溶液的pH處在6.6至7.0的范圍內(nèi)；然后從混合溶液中除去部分溶劑，從而使蛋白發(fā)生結(jié)晶。
S.Johal的美國(guó)專利4,400,471中公開(kāi)了一種從植物材料如煙葉中制備核酮糖-1，5二磷酸羧化酶(RuBisCO)的方法，所述方法包括如下步驟在水溶液中粉碎植物材料而制成懸液；分餾懸液以從植物材料渣滓中釋放RuBisCO至溶液中；在溶液中加入足夠量的聚乙二醇(PEG)從而使RuBisCO晶體選擇性形成，所述晶體中含有雜質(zhì)；從溶液中分離晶體；于水中重溶晶體；將重溶的晶體通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂床；洗滌交換柱以去除未結(jié)合物質(zhì)；將含有預(yù)定濃度二價(jià)金屬離子的單一溶液在足以選擇性從樹(shù)脂上洗脫出RuBisCO的濃度下通過(guò)交換柱。同樣參見(jiàn)S.Johal的美國(guó)專利4,588,691。
級(jí)分II蛋白可以在分離級(jí)分I蛋白的期間從分離級(jí)分1蛋白后殘留的可溶的蛋白中分離出來(lái)，或使用從上述關(guān)于分離級(jí)分I蛋白的描述中可以顯而易見(jiàn)得到的其他技術(shù)。
E.分子農(nóng)業(yè) 如M.Conkling等的PCT申請(qǐng)WO98/56923中的描述，低煙堿生成水平的，或無(wú)煙堿生成的煙草植物，被認(rèn)為可作為表達(dá)有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)品如藥物，化妝品成分，或食品添加劑的轉(zhuǎn)基因受體。分子農(nóng)業(yè)適用的技術(shù)被描述于，除其他文獻(xiàn)外，Goodman等(Calgene)的美國(guó)專利6,096,547；5,629,175和5,550,038中。煙草作為將編碼所需產(chǎn)品基因轉(zhuǎn)入的受體植物是很有吸引力的，因?yàn)闊煵菀走M(jìn)行基因工程操作，而且每英畝能夠產(chǎn)出非常多的生物質(zhì)；因此，具有減少的煙堿生成源的煙草植物將會(huì)具有生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的更多的可用資源。用生產(chǎn)所需產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化煙草的方法是本領(lǐng)域所熟知的；任何適用的技術(shù)都可以用于本發(fā)明的低煙堿煙草植物。
可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因編碼并在上述煙草植物(包括描述于PCT申請(qǐng)WO00/67558中的煙草)中表達(dá)的所需產(chǎn)品例子包括，但不限于，哺乳動(dòng)物的，特別是人類的，蛋白和肽，如白介素-1(IL-1)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12和其他淋巴因子，促紅細(xì)胞生成素或EPO，干擾素如α，β和γ干擾素，生長(zhǎng)因子如G-CSF，GM-CSF，和M-CSF，血液因子如因子I至XII，特別是凝血因子VII和IX，組織型纖溶酶原激活因子或tPA，胰島素樣生長(zhǎng)因子，表皮生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α，β等，生長(zhǎng)激素，胰島素，膠原蛋白型纖溶酶原激活因子，組織相容性抗原，受體，受體拮抗劑，抗體，單鏈抗體，酶，神經(jīng)多肽，抗原，疫苗，肽激素，降鈣素，人生長(zhǎng)激素，和肌醇六磷酸酶，還有抗微生物肽或蛋白如，protegrins，爪蟾抗菌肽，殺菌肽，尾孢菌素，蜂毒素，indolicidins，defensions，β-防御素，cryptdins，clavainins，植物防御素，nicin，bactenecins等。
與涉及煙堿合成通路中的酶的構(gòu)建體相似的，被插入煙草植物中的編碼前述蛋白和肽的構(gòu)建體可包括上述構(gòu)建體上游(5’方向)和/或下游(3’方向)的絕緣子元件，例如，參見(jiàn)Thompson等的美國(guó)專利6,100,448和6,037,525中的記載，或可包含前述構(gòu)建體上游和/或下游的基質(zhì)(或支架)結(jié)合區(qū)域，例如，參見(jiàn)Thompson等的美國(guó)專利5,773,695和5,773,689中的記載。
轉(zhuǎn)基因蛋白或肽可用任何適用技術(shù)從重組植物中收集，一般包括壓碎或磨碎植物或植物部分，如葉子，用適用溶劑提取蛋白或肽，然后用純化技術(shù)如層析法分離蛋白或肽，方法的選擇要依賴于需要分離的蛋白或肽的特性。S.Garger等(Biosource Technologies Inc.)的美國(guó)專利6,037,456中公開(kāi)了一種從植物中獲取可溶性蛋白或肽的方法，所述方法包括如下步驟(a)將植物均質(zhì)化以制備綠色汁液勻漿；(b)調(diào)整綠色汁液勻漿的pH值低于或等于約5.2(例如，從約4.0至5.2)；(c)加熱綠色汁液勻漿至最少約45℃(例如，在約45-50℃之間)；(d)離心綠色汁液勻漿以獲取上清(并且隨后可選擇地將上清經(jīng)過(guò)一個(gè)或一個(gè)以上超濾步驟的處理)；和(e)從上清中純化蛋白或肽(例如，采用層析法，基于親和的純化方法或鹽析法)。適用的蛋白例子包括，但不限于，由上述轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白。應(yīng)當(dāng)清楚的是，某些蛋白或肽并不需要從植物或植物部分中分離出來(lái)，當(dāng)該蛋白或肽作為飼料成分與植物包含在一起時(shí)。
下述非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1 與親本系比較的Vector Burley 21-41的煙堿和還原糖水平 低煙堿的煙草品種，Vector Burley 21-41，是用二元農(nóng)桿菌載體pYTY32轉(zhuǎn)化Burley 21 LA種而制得的，其描述于按照專利合作條約公布的國(guó)際申請(qǐng)WO98/56923中。Burley 21 LA種是與Burley 21相比煙堿水平充分減低的Burley 21的一個(gè)品種，(即，Burley 21 LA的煙堿水平為Burley21的8％，參見(jiàn)Legg等，(1971)Can.J.Genet.Cytol.13287-91；Legg等，(1969)J.Hered.60213-17)。Vector Burley 21-41與其親本系，Burley 21 LA，是非常相似的。通常Vector Burley 21-41與Burley 21 LA在除生物堿含量(例如，煙堿和去甲煙堿)和還原糖含量以外的其他全部測(cè)評(píng)特性上都是相似的。Vector Burley 21-41可憑借其明顯減少的煙堿，去甲煙堿和總生物堿含量與其親本系Burley 21 LA相區(qū)分。如下顯示，Vector Burley 21-41中總生物堿濃度減低至接近其親本系Burley 21LA 10％的水平。Vector Burley 21-41與其親本系Burley 21 LA相比，煙堿和去甲煙堿的濃度分別低于大約6.7％和32％。因此，VectorBurley 21-41的煙堿濃度相當(dāng)于Burley 21煙堿水平的0.54％。如下面表1所示，出乎意料地發(fā)現(xiàn)Vector Burley 21-41與Burley 21 LA相比，還含有更高的(+87％)還原糖水平(約為10.29％對(duì)5.51％)。因而，發(fā)現(xiàn)Vector Burley 21-41中含有高于其親本大約90％的還原糖，這使得該植物更適用于本發(fā)明所述的用途，特別是生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法中。
表1Vector Burley 21-41與Burley 21 LA間的比較 數(shù)據(jù)來(lái)自中央農(nóng)作物研究站(克萊頓，NC.)的2000農(nóng)田試驗(yàn)。使用去頂?shù)闹参镞M(jìn)行化學(xué)分析。重復(fù)15次/每次10株植物。數(shù)據(jù)分析使用T檢驗(yàn)。
*＝無(wú)顯著性差異，**＝1％水平的顯著性。
前述數(shù)據(jù)可作為本發(fā)明的例證，但并不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
本發(fā)明被限定為如下權(quán)利要求，及包含在其內(nèi)的權(quán)利要求相等物。
權(quán)利要求
1.一種維持動(dòng)物的方法，該方法包括將低煙堿重組煙草植物或其部分作為所述動(dòng)物的食物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物或部分與對(duì)照植物相比，表現(xiàn)為低煙堿含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述植物或部分包含能在所述植物中減量調(diào)節(jié)煙堿生產(chǎn)的異源核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物或部分與對(duì)照植物相比，包含增高的還原糖含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物或部分包含編碼煙堿生物合成所需酶的至少一個(gè)片段的異源DNA，其中所述植物與對(duì)照植物相比表現(xiàn)為所述酶和煙堿水平減低，煙堿含量減低，還原糖增高。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法通過(guò)對(duì)所述動(dòng)物飼以包含所述低煙堿重組煙草植物或植物部分的草料農(nóng)作物來(lái)進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法通過(guò)對(duì)所述動(dòng)物飼以來(lái)自所述低煙堿重組煙草植物或植物部分的葉子來(lái)進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法通過(guò)對(duì)所述動(dòng)物飼以包含所述低煙堿重組煙草植物或植物部分的青貯飼料來(lái)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法通過(guò)對(duì)所述動(dòng)物飼以包含所述低煙堿重組煙草植物或植物部分并聯(lián)合至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑的食品來(lái)進(jìn)行。
10.一種包含低煙堿重組煙草植物或其部分的食品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述植物或部分與對(duì)照植物相比，表現(xiàn)為煙堿量減低。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的食品，其中所述植物或部分包含能在所述植物中減量調(diào)節(jié)煙堿生產(chǎn)的異源核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述植物或部分與對(duì)照植物相比，包含增高的還原糖含量。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述植物或部分包含編碼煙堿生物合成所需酶的至少一個(gè)片段的異源DNA，其中所述植物與對(duì)照植物相比表現(xiàn)為所述酶水平減低，煙堿含量減低，還原糖增高。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述植物或部分包含煙葉。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述食品包含青貯飼料。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中所述食品包含所述植物或部分并聯(lián)合至少一種附加營(yíng)養(yǎng)劑。
18.一種從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括提供低煙堿重組煙草植物或其部分；和從所述植物或部分中收集蛋白級(jí)分。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述植物或植物部分與對(duì)照植物相比，表現(xiàn)為減低的煙堿含量。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物或部分包含能在所述植物中減量調(diào)節(jié)煙堿生產(chǎn)的異源核酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述植物或部分與對(duì)照植物相比，包含增高的還原糖含量。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述植物或部分包含編碼煙堿生物合成所需酶的至少一個(gè)片段的異源DNA，其中所述植物與對(duì)照植物相比表現(xiàn)為所述酶水平減低，煙堿含量減低，還原糖增高。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白級(jí)分包含核酮糖-1，5二磷酸羧化酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白級(jí)分基本上由核酮糖-1，5二磷酸羧化酶組成。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白級(jí)分包含級(jí)分II蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白級(jí)分基本上由級(jí)分II蛋白組成。
27.一種在植物或其部分中降低煙堿合成的方法，包括(a)相對(duì)于對(duì)照植物減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的表達(dá)；和(b)減量調(diào)節(jié)煙草中煙堿生物合成所需的至少一種其它酶。
28.權(quán)利要求27的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入抑制喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)表達(dá)的干預(yù)性互補(bǔ)mRNA(mRNAi)而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的表達(dá)。
29.權(quán)利要求27的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入酶活性RNA分子(核酶)而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的表達(dá)，所述酶活性RNA分子能裂解編碼喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本。
30.權(quán)利要求27的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA構(gòu)建體而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的表達(dá)，所述外源DNA構(gòu)建體按5’至3’方向含有有效連接于編碼喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的異源核酸的啟動(dòng)子。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述異源核酸處于有義方向。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述異源核酸處于反義方向。
33.一種在植物或其部分中降低煙堿合成的方法，包括(a)相對(duì)于對(duì)照植物減量調(diào)節(jié)腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的表達(dá)；和(b)減量調(diào)節(jié)煙草中煙堿生物合成所需的至少一種其它酶。
34.權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入抑制腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)表達(dá)的干預(yù)性互補(bǔ)mRNA(mRNAi)而減量調(diào)節(jié)腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的表達(dá)。
35.權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入酶活性RNA分子(核酶)而減量調(diào)節(jié)腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的表達(dá)，所述酶活性RNA分子能裂解編碼腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本。
36.權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA構(gòu)建體而減量調(diào)節(jié)腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的表達(dá)，所述外源DNA構(gòu)建體按5’至3’方向含有有效連接于編碼腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的異源核酸的啟動(dòng)子。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述異源核酸處于有義方向。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述異源核酸處于反義方向。
39.一種在植物或其部分中降低煙堿合成的方法，包括相對(duì)于對(duì)照植物減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的表達(dá)和腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的表達(dá)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入(a)抑制喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)表達(dá)的第一干預(yù)性互補(bǔ)mRNA(mRNAi)和(b)抑制腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)表達(dá)的第二干預(yù)性互補(bǔ)mRNA(mRNAi)，而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)和腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)。
41.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入(a)裂解編碼喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本的第一酶活性RNA分子(核酶)和(b)裂解編碼腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本的第二酶活性RNA分子(核酶)，而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)和腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)。
42.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入下列DNA構(gòu)建體而減量調(diào)節(jié)喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)和腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)(a)第一外源DNA構(gòu)建體，按5’至3’方向其含有有效連接于編碼喹啉酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(QPT)的異源核酸的啟動(dòng)子；和(b)第二外源DNA構(gòu)建體，按5’至3’方向其含有有效連接于編碼腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的異源核酸的啟動(dòng)子。
43.權(quán)利要求42的方法，其中至少一種異源核酸處于有義方向。
44.權(quán)利要求42的方法，其中至少一種異源核酸處于反義方向。
45.一種在植物或其部分中降低煙堿合成的方法，包括相對(duì)于對(duì)照植物減量調(diào)節(jié)酶的表達(dá)，其中所述酶選自精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和NADH脫氫酶。
46.權(quán)利要求45的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入抑制所述酶表達(dá)的干預(yù)性互補(bǔ)mRNA(mRNAi)而減量調(diào)節(jié)所述酶。
47.權(quán)利要求45的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入酶活性RNA分子(核酶)而減量調(diào)節(jié)所述酶，所述酶活性RNA分子能裂解編碼所述酶的DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄本。
48.權(quán)利要求45的方法，其中通過(guò)向所述植物的植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA構(gòu)建體而減量調(diào)節(jié)所述酶，所述外源DNA構(gòu)建體按5’至3’方向含有有效連接于編碼所述酶的異源核酸的啟動(dòng)子。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述異源核酸處于有義方向。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述異源核酸處于反義方向。
51.根據(jù)權(quán)利要求1-9的低煙堿重組煙草植物或其部分。
52.根據(jù)權(quán)利要求10-26的低煙堿重組煙草植物或其部分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，包括提供低煙堿重組煙草植物或其部分，將植物或其部分置于發(fā)酵容器中發(fā)酵足夠長(zhǎng)的時(shí)間以從中生產(chǎn)乙醇；然后從發(fā)酵容器中收集乙醇。本發(fā)明還公開(kāi)了一種維持動(dòng)物對(duì)象的方法，包括給動(dòng)物體飼以低煙堿重組煙草植物或其部分。本發(fā)明還公開(kāi)了一種從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)蛋白級(jí)分的方法，包括提供低煙堿重組煙草植物或其部分，隨后從低煙堿重組煙草植物或其部分中收集蛋白級(jí)分。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1954688SQ200610132149
公開(kāi)日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月6日
發(fā)明者J·潘多爾菲諾 申請(qǐng)人:二十二世紀(jì)有限責(zé)任公司