專利名稱：一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細(xì)菌制備方法
一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細(xì)菌制備方法 技術(shù)領(lǐng)械
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù)，具體地說(shuō)是一種用于多環(huán)芳烴
(PAHs)污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其是以紅磚粉、焦炭 粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土等材料為載體的吸附固定化微生 物工藝。
背棄技術(shù)
多環(huán)芳烴(PAHs)在環(huán)境中普遍存在，由于該類化合物的辛醇-水分配系數(shù)高，水溶性差，常被吸附于土壤顆粒上。因此，土壤就成 為PAHs的主要載體。多環(huán)芳烴在自然界中的積累會(huì)對(duì)人類以及整個(gè) 自然界造成極大的危害， 一些多環(huán)芳烴進(jìn)入人體和動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)產(chǎn) 生致癌、致畸、致突變的后果。因此，有關(guān)PAHs污染土壤的修復(fù)技 術(shù)倍受關(guān)注。盡快幵發(fā)出安全、高效、實(shí)用性強(qiáng)的多環(huán)芳烴污染土壤 修復(fù)技術(shù)，是科研工作者面臨的艱巨而緊迫的任務(wù)。
近年來(lái)，發(fā)展起來(lái)的微生物修復(fù)技術(shù)為PAHs的降解提供了較好 的途徑，但也存在一些缺陷，如單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、反應(yīng) 啟動(dòng)慢、與土著菌竟?fàn)幪幱诹觿?shì)、抗毒性侵害能力差、對(duì)環(huán)境條件敏 感，加入到修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中的微生物可能由于竟?fàn)幓螂y以適應(yīng)環(huán)境而 導(dǎo)致作用結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大出入，使得不能很好的應(yīng)用于原位污 染土壤修復(fù)。因此，亟需開發(fā)更高效更適合于原位多環(huán)芳烴污染土壤 修復(fù)的新型生物技術(shù)，而微生物固定化技術(shù)可以克服這些缺點(diǎn)和弊 端。
所謂固定化技術(shù)，是利用化學(xué)或物理的手段，將游離的細(xì)胞(微 生物)或酶定位于限定的空間區(qū)域使其保持活性并能反復(fù)使用的一種 基本技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是可以大幅度提高參加反應(yīng)的微生物濃度，固定化 后的微生物耐環(huán)境沖擊性增強(qiáng)，根據(jù)需要可選擇適宜的微生物，可降 低二次污染等優(yōu)點(diǎn)。盡管固定化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于修復(fù)污染的流體 介質(zhì)(如廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)，但在修復(fù)污染的非流體介 質(zhì)(如土壤)中應(yīng)用該技術(shù)還未見成功的實(shí)例。因而被廣泛用于修復(fù) 受污染的流體介質(zhì)(如廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)環(huán)境中，但將 固定化微生物用于降解非流體介質(zhì)(如土壤)中有機(jī)污染物的研究， 國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。主要原因是因?yàn)榉橇黧w介質(zhì)本身所具有的復(fù)雜性 和特殊性給該技術(shù)提出了許多不同于在流體介質(zhì)中應(yīng)用固定化技術(shù) 時(shí)所面臨的科學(xué)問(wèn)題，如固定化微生物顆粒的載體如何選擇，如何克 服在非流體介質(zhì)中固定化顆粒的不可回收性，如何克服污染物濃度的
非均質(zhì)性對(duì)固定化顆粒造成的沖擊；如果提高固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng) 度以抵抗環(huán)境脅迫造成的物理?yè)p傷。
本發(fā)明在確定適宜的載體材料和固定化工藝的基礎(chǔ)上提出了一 種用于修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的固定化顆粒制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于修復(fù)多環(huán) 芳烴污染土壤的固定化顆粒制備方法。本發(fā)明以紅磚粉、焦炭粉、粉 煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土等為載體材料，采用吸附固定化方法， 對(duì)高效降解多環(huán)芳烴的菌株進(jìn)行固定化，將制得的固定化微生物應(yīng)用
于多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)，結(jié)果表明按照該配方制得的固定化生 物產(chǎn)品對(duì)高分子量多環(huán)芳烴污染土壤具有良好的修復(fù)效果，是一種可 信賴的新型環(huán)保生物產(chǎn)品。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為
一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細(xì)菌制備方法，以 0.25-1. G0mm紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉為 載體材料，滅菌后，接入菌液，然后增殖培養(yǎng)，制得所需固定化顆粒。
所述紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉在作為 載體以前需要經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)處理，具體處理過(guò)程為將過(guò)篩后的紅磚粉、 粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉按照0.5~1.5ml/g比例加 自來(lái)水或增殖培養(yǎng)基浸潤(rùn)12 ~ 24h。
所述菌為芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為25 3(TC;
種子培養(yǎng)基可為牛肉膏0. 3°/。，蛋白胨1. (T/。，NaCl 0. 5°/。，pH 7. 0 ~ 7. 2;或?yàn)槠咸烟?. 25%,牛肉膏0. 25。/。，NH萬(wàn)0. l%，MgS04 7H20 0. 02%, KC1 0. 02%, pH 7. 0—7. 2;
增殖培易基為牛肉膏0. 3%,蛋白胨1. W，NaClO. 5%,pH 7. 0一7. 2; 或?yàn)槠咸烟?. 0°Z。,酵母膏O. 3%, KH2P04 0. 05%, MgS04 7H20 0. 025%， (肌)風(fēng)0. 2%, pH 7. 0—7. 2。
所述接入菌液和增殖培養(yǎng)地過(guò)程為，按照載體重量2 ~ 4%的量加 入細(xì)菌菌液，25-28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天按lml/g 2ml/g載體 的量補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化載體材料，吸附固定化技術(shù)，制備的固定化 顆粒為微生物提供了更適合的微環(huán)境，與土著菌的竟?fàn)幜υ鰪?qiáng)，對(duì)環(huán) 境中毒物的抗性增加，可以在不良環(huán)境中仍然發(fā)揮高效降解菌對(duì)多環(huán) 芳烴的降解作用；經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)處理后再滅菌使得載體滅菌更徹底，單位 體積內(nèi)適宜微生物生長(zhǎng)的環(huán)境更大，提高了固定化效率擴(kuò)散傳質(zhì)性能 優(yōu)異，為微生物提供了良好的生活環(huán)境，從而提高了固定化效率；該 固定化方法簡(jiǎn)單易行，適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。 2、 本發(fā)明所釆用載體為紅磚粉、焦炭粉、粉煤灰、蛭石、泥炭 土、硅藻土等材料，他們對(duì)提高固定化微生物去除土壤中多環(huán)芳烴有 促進(jìn)作用。這些材料具有不同程度的隔熱、耐凍、吸水等優(yōu)異性能， 可為微生物提供在更佳的微環(huán)境。此外，泥炭土主要組分是木質(zhì)素和
纖維素，具有近乎95%的多孔結(jié)構(gòu)以及值為200mVg的特定表面積， 為微生物提供優(yōu)良的微環(huán)境，有利的屏蔽了外界土著菌的干擾，使固 定化微生物很好的發(fā)揮對(duì)多環(huán)芳烴降解作用；高分子量多環(huán)芳烴一般 以共代謝的方式被降解，泥炭土除作為微生物載體外，組分中的木質(zhì) 素和纖維素還可為微生物提供初級(jí)共代謝底物，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生降解 多環(huán)芳烴所必需的酶類，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高分子量多環(huán)芳烴的共代謝降 解。
3、 固定化顆粒對(duì)環(huán)境的耐性得到顯著增強(qiáng)，固定化細(xì)菌適應(yīng)更 低的環(huán)境溫度，在5 35'C范圍內(nèi)均能保持較好的活性，固定化細(xì)菌 對(duì)pH變化呈惰性，在pH-5 8范圍內(nèi)，固定化細(xì)菌的活性沒(méi)有發(fā)生 明顯的改變。
4、 該載體及其固定化工藝可用于芽孢桿菌屬(Saci'Hussp.)、 動(dòng)膠桿菌屬(ZoogJoea sp.)、微球菌(A/!'crococci;s sp.)等多菌 種的固定化，具有一定的廣譜適用性。
5、 固定化細(xì)菌對(duì)受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量 多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)中具有明顯的修復(fù)效果，在投粒比為2% ~ 10%、修復(fù)時(shí)間為42d的條件下，土壤中PYR去除率最高可達(dá)20. 3 ~ 60.4%,而對(duì)BaP的去除率為24~41. 3%，較游離菌提高20%。
6、 本發(fā)明所用載體材料價(jià)格便宜，成本低，來(lái)源廣泛，通氣性 良好，無(wú)毒，不會(huì)造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。
具體實(shí)施方案
下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 實(shí)施例1
(1)固定化細(xì)菌液體培養(yǎng)
在裝有種子培養(yǎng)基(葡萄糖L 25%，牛肉膏O. 25%, NH4NO30. 1%， MgS04 7H20 0. 02%， KC1 0. 02%, pH 6. 5 )的三角瓶中接種芽孢桿菌， 置于28 ~ 3(TC恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h。
(2) 固定化載體預(yù)處理
將過(guò)l.OO mm篩后的紅磚粉按照0.5~1.5ml/g比例加自來(lái)水浸 潤(rùn)12~2化，UrC高溫蒸汽滅菌90 min，備用。
(3) 固定化顆粒制備
取細(xì)菌菌懸液，均勻地加入無(wú)菌載體表面，接種量2%，密封后 放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每天按lml/g載體的量補(bǔ)加增殖 培養(yǎng)基(葡萄糖4, 0%，酵母膏0. 3%， K跳O. 05°/。， MgS04 -7H20 0. 025%,
(NH4)2HP04 0.2%, pH 7. 0~7. 2)， 3d后便制得固定化細(xì)菌顆粒。
經(jīng)上述步驟制得的固定化顆粒周期短，單位體積細(xì)胞密度大，5.4 xl()6個(gè)/g較游離細(xì)胞密度增加了 2個(gè)數(shù)量級(jí)。 (4)對(duì)受多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的效果
將制備好的固定化顆粒按土壤重量2%的投粒比，投入受多環(huán)芳 烴污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率為32%; 土壤中BaP 的去除率為21%。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，42d 后固定化顆粒仍然具有85%以上的活性。 實(shí)施例2
與實(shí)施例l不同處在于載體預(yù)處理時(shí)，將過(guò)0.25mm篩后的粉 煤灰按照1. 5ml/g比例加自來(lái)水浸潤(rùn)12h，12rC高溫蒸汽滅菌90min,備用。
將制備好的固定化顆粒按土壤重量6%投粒比，投入受多環(huán)芳烴 污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率為42%; 土壤中BaP的 去除率為36%。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，42d 后固定化顆粒仍然具有90%以上的活性。
實(shí)施例3
與實(shí)施例1不同處在于將過(guò)lmm篩后的蛭石按照0. 5ml/g比例 加自來(lái)水浸潤(rùn)24h, 12rC高溫蒸汽滅菌90min，備用。
將制備好的固定化顆粒按土壤重量6%投粒比，投入受多環(huán)芳烴 污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率為51%; 土壤中BaP的 去除率為39%。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，42d 后固定化顆粒仍然具有90%以上的活性。
實(shí)施例4
與實(shí)施例1不同處在于將過(guò)0.75mm篩后的泥炭土按照1. Oml/g 比例加自來(lái)水浸潤(rùn)18h， 12rC高溫蒸汽滅菌90min,備用。
將制備好的固定化顆粒按6%投粒比，投入受多環(huán)芳烴污染的土 壤中，42d后，土壤中PYR的去除率為62%; 土壤中BaP的去除率為 47%。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，42d后固定化 顆粒仍然具有90%以上的活性。
實(shí)施例5
與實(shí)施例1不同處在于將過(guò)0. 50mm篩后的硅藻土按照2ml/g比 例加自來(lái)水浸潤(rùn)15h， 12rC高溫蒸汽滅菌90min，備用。
將制備好的固定化顆粒按6 %投粒比，投入受多環(huán)芳烴污染的土 壤中，42d后，土壤中PYR的去除率為21%; 土壤中BaP的去除率為 13%。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，42d后固定化 顆粒仍然具有90%以上的活性。
實(shí)施例6
與實(shí)施例4不同處之一在于細(xì)菌斜面培養(yǎng)制備時(shí)，在牛肉膏蛋
白棟基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0. 3%牛肉膏，1.0%蛋白棟，0.5%NaCl， 1.5-2.0% 瓊脂，pH 7.0-7.2)的試管中分別接入動(dòng)膠桿菌(Zoog7oea sp.)、 微球菌(A/icrobaderiwn sp.)置于28-30。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
按照以上步驟制得的固定化顆粒機(jī)械強(qiáng)度達(dá)到42. 13kg/cm2，將 制得的固定化顆粒在搖床上增殖培養(yǎng)后，用于土壤中PAHs污染的修 復(fù)，當(dāng)土壤中初始PYR/BaP濃度為50mg/kg時(shí)，投粒比1M，修復(fù)42d, 動(dòng)膠桿菌(Zo一ea sp.)對(duì)PYR的去除率為31. 4 % ,對(duì)BaP去除 率為21.9%;微球菌(Micro6acten'咖sp.)對(duì)PYR的去除率為30.7 %,對(duì)BaP去除率為25. 7%。而且在4t:冰箱中經(jīng)過(guò)365d的保存后， 增殖培養(yǎng)后的固定化粒子活性保持均在85%以上。
權(quán)利要求
1.一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于以0.25～1.00mm紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉為載體材料，滅菌后，接入菌液，然后增殖培養(yǎng)，制得所需固定化顆粒。
2. 按照權(quán)利要求l所述固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所 述紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉在作為載體以前 需要經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)處理，具體處理過(guò)程為將過(guò)篩后的紅磚粉、粉煤灰、 蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉按照0. 5~1.5ml/g比例加自來(lái)水或 增殖培養(yǎng)基浸潤(rùn)12~24h。
3. 按照權(quán)利要求l所述固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所 述菌為芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為25~30°C;種子培養(yǎng)基可為牛肉膏0. 3%,蛋白胨1. 0%，NaC10. 5°/o,pH 7. 0 ~ 7. 2;或?yàn)槠咸烟?. 25%,牛肉膏0. 25%，NH4NO30. l%,MgS04 7H20 0. 02%, KC1 0. 02%， pH 7. 0~7. 2;增殖培養(yǎng)基為牛肉膏0. 3%，蛋白胨1.0%, NaClO. 5%， pH7.0~ 7. 2;或?yàn)槠咸烟?. 0%,酵母膏0. 3%, KH2PO4 0. 05°/。，MgSO4 7H20 0. 025%, (NH4)2HP04 0. 2%, pH 7. 0~ 7. 2。
4. 按照權(quán)利要求l所述固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所 述接入菌液和增殖培養(yǎng)地過(guò)程為，按照載體重量2~4%的量加入細(xì)菌 菌液，25-"。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天按lml/g-2ml/g載體的量補(bǔ) 加增殖培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù)，具體地說(shuō)是一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細(xì)菌制備方法，以0.25～1.00mm紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉為載體材料，滅菌后，接入菌液，然后增殖培養(yǎng)，制得所需固定化顆粒。按照本發(fā)明配方制得的固定化生物產(chǎn)品對(duì)高分子量多環(huán)芳烴污染土壤具有良好的修復(fù)效果，是一種可信賴的新型環(huán)保生物產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N11/00GK101177679SQ20061013420
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2006年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者李培軍, 丹 蘇, 鞠京麗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所