專利名稱：一種混合菌固定化顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及混合菌固定化顆粒的制備方法，具體地說是釆用沸石為載 體對混合菌進(jìn)行固定化及固定化顆粒對底泥中硝基苯類污染物進(jìn)行去除。
背景技術(shù)：
微生物固定化技術(shù)的發(fā)展始于上世紀(jì)70年代，在醫(yī)藥、食品、化工以 及點源污水治理方面取得了很多成果，但在污染地表水體修復(fù)特別是底泥 修復(fù)方面的研究還未見報道。
微生物固定化技術(shù)是指利用化學(xué)或物理的方法，將游離細(xì)胞(微生物) 定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，并保持活性，且能反復(fù)使用的基本技術(shù)。固定 化技術(shù)可對完整細(xì)胞進(jìn)行固定，可最大限度地維持生物酶活性和穩(wěn)定性， 提高單位體積內(nèi)微生物密度和流動速率，修復(fù)過程不受稀釋率高于微生物
生長率的限制，固定化微環(huán)境有利于屏蔽外界環(huán)境的不利影響，固定化顆 粒的水力性質(zhì)和沉降性能可靈活控制，是一項高效實用的污染環(huán)境修復(fù)技 術(shù)。
硝基苯、苯胺類污染物，它們在水體和底泥中具有較高的穩(wěn)定性。其 密度分別為1.205、 1.022,其密度>水，進(jìn)入水體的硝基苯、苯胺會沉入 水底，使底泥遭受污染。它們在水中又都有一定的溶解度，隨時間延長又 會造成水體污染。
2005年11月13日吉林雙苯廠苯胺車間發(fā)生爆炸，引發(fā)大量硝基苯泄 漏。雙苯廠的含硝基苯廢水流入松花江，導(dǎo)致江水和底泥污染。
松花江污染區(qū)域大、土著微生物很難自發(fā)形成優(yōu)勢降解菌群，污染底 泥的特殊性質(zhì)無疑對生物修復(fù)提出更高的要求，必須篩選組合優(yōu)勢降解菌 群，而且微生物固定化顆粒其密度>水，才能使優(yōu)勢降解微生物菌群接觸 到污染底泥，達(dá)到去除有機污染物的目的。
為了實現(xiàn)上述微生物固定化修復(fù)技術(shù)對硝基苯類污染底泥的有效修 復(fù)，本技術(shù)發(fā)明了一種沸石為載體的微生物混合菌固定化沸石顆粒制備方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種沉積效果好、應(yīng)用方便的混合菌固定化顆粒 的制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是用沸石為載體將對數(shù)生長 期的混合菌進(jìn)行吸附固定，即為將15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加 入到含有硝基苯類溶液中的培養(yǎng)基，在兼性厭氧條件下，恒溫培養(yǎng)4-6天， 取出40-50ml菌懸液，而后補充相同體積的含有硝基苯的培養(yǎng)基，在兼性
厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)2-3天即為增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有
混合菌的沸石顆粒。
所述含有硝基苯類污染物的培養(yǎng)基中硝基苯類污染物的濃度為25-35 mg/L。
所述沸石為粒度在0.05-0.15 cm3，用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風(fēng)干 的沸石。所述培養(yǎng)基為葡萄糖0.05-0.2%、蛋白胨0.02-0.06%、酵母嗇 0.03-0.06 %、 NaCl 0.3-0.6%、 K2HPO40.4-0.5% 、 KH2P04 0.1-0.4 %、 MgS04.7H20 0.02-0.06 0/o 、 pH7.2 ~ 7.5
原理用于修復(fù)污染底泥以無機載體沸石作為載體材料，釆用吸附固 定方法。對選擇的高效降解硝基苯的混合微生物進(jìn)行固定化，制備混合菌 顆粒；將制備的固定化生物產(chǎn)品對硝基苯和苯胺污染的底泥進(jìn)行修復(fù)。
本發(fā)明可修復(fù)污染底泥中的硝基苯、苯胺類污染物及密度〉水的有機
5虧_^物
本i:明具有如下優(yōu)點
1. 本發(fā)明選擇沸石為載體，沸石平均比重為2.12g/cr^，體積在0.05-0.15
cm3范圍較合適，其孔隙度適合微生物的吸附固定，可對完整的微生物細(xì)胞 進(jìn)行固定，避免人為破壞生物酶的活性和生化反應(yīng)的穩(wěn)定性；增殖速度快、 效果好。
2. 本發(fā)明選擇的微生物為兼性厭氧混合菌，固定化后的微生物能長期 保持活性；固定化細(xì)胞顆粒的微環(huán)境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物 質(zhì)對微生物體的惡性竟?fàn)?、吞噬和毒害，使其在?fù)雜環(huán)境條件下穩(wěn)定地發(fā) 揮高效能。
3. 沸石為載體的固定化細(xì)胞顆粒對于靜止或緩流污染水體中的底泥， 可根據(jù)污染程度直接投加，操作簡單，無需改變自然環(huán)境和修筑大規(guī)模構(gòu) 筑物，不產(chǎn)生二次污染。
4. 沸石來源豐富，價格便宜。節(jié)省投資，簡化流程，實踐上安全可靠， 經(jīng)濟上費用低廉，工程投資僅為物理法、化學(xué)法修復(fù)的30-50%。
5. 本發(fā)明采用生物修復(fù)主要指微生物修復(fù)，具體為無機載體沸石吸附 固定微生物，對混合菌吸附速度快、增殖效果好。將其制備的固定化 細(xì)胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環(huán)境中，可使底泥中硝基苯和 苯胺得到有效去除，當(dāng)?shù)啄嘀邢趸健⒈桨烦跏紳舛葹?.41 mg/kg、 37.84mg/kg時，硝基苯的降解率可達(dá)100%，苯胺降解率為52. 51%。


圖1為本發(fā)明固定化微生物沸石顆粒降解底泥中硝基苯的處理圖。 圖2為本發(fā)明固定化微生物沸石顆粒降解底泥中苯胺的處理圖。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 實施例i
沸石固定微生物的方法，具體步驟為先制備種子液，同時處理無機
載體沸石；然后混合菌株在沸石中進(jìn)行吸附固定增殖。具體步驟如下
U)種子液的制備
在兼性厭氧條件下，所述兼性厭氧條件，將160ml富集培養(yǎng)基加入到 250ml厭氧瓶中，滅菌，冷卻后加入18 ml種液，放入28'C的培養(yǎng)箱中恒 溫靜止培養(yǎng)一周，使其微生物處于對數(shù)生長期，備用。
所述厭氧瓶為醫(yī)用輸液瓶；培養(yǎng)基按重量百分比計為葡萄糖0.1%、 蛋白胨0.05 % 、酵母膏0.05 % 、 NaCl 0.5%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04'7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分屏。所述 種液為含有1. 5ml濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，兼 性厭氧混合微生物包括施氏假單胞菌(尸化wA/wo"os WMteerO、糞產(chǎn)堿菌 (」/ea/Zge""々eca/zS )、巨大芽孢桿菌(5ac/〃船)和陰溝腸桿菌 (五"fera^"erc/oacae),(上述菌種均可通過巿購得到)，其體積份數(shù)比為1: 1: 1: 1 ,加入的硝基苯溶液使其濃度達(dá)到26. 25mg/L。
(2) 載體的預(yù)處理
沸石(購自遼寧省法庫沸石礦)，將大塊沸石破碎，使粒度范圍為 0.05-0.15 cm3。用自來水洗滌3次，并用自來水浸泡過夜，次日除水后風(fēng)干， 然后稱沸石30g加入到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放 入滅菌鍋中滅菌，備用。滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在沸石無機載體中的固定
將上述裝有30g沸石的100ml廣口瓶中分別加入45ml富集培養(yǎng)基、 0. 45ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3 mg/ml )和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28'C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。所述富集培養(yǎng)基與種子液制備所 用的培養(yǎng)基相同，所述種子液為上述已制備好的兼性厭氧混合菌液。
(4) 固定化細(xì)胞的增殖
從上述裝有沸石載體的廣口瓶中倒出40ml殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮培養(yǎng)基及0. 35ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為 "."mg/L。在兼性厭氧條件下、28'C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約3天即為增殖一 次，共增殖三次，分別增殖69h 、 51 h和48h;所述培養(yǎng)基與種子液制備 所用的培養(yǎng)基相同。完成每次增殖時瓶中增殖液呈現(xiàn)渾濁，有氣體逸出， 苦杏仁味消失并產(chǎn)生臭味，此時需更換新鮮的培養(yǎng)基即為一次增殖。用上 述方法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混 合菌提供了更多的吸附固定點，提高了固定化效率，使單位質(zhì)量細(xì)胞數(shù)量 增多、密度增大，經(jīng)過三批增殖后固定化沸石顆粒吸附固定的微生物細(xì)胞 數(shù)可達(dá)到l.lxl08cfu/g。
(5) 對底泥的修復(fù)效果
實驗采用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數(shù)比為l: 4,所述泥為吉林石
化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標(biāo)為泥水混合物，
即600g泥，2400g水，共3. OL.投加NaH2P041.5g K2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5%固定化沸石顆粒投入到 上述污染水體和底泥環(huán)境中。處理前首先測定底泥中硝基苯的初始濃度為 4.41 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C)靜止放置。固 定化沸石顆粒對底泥中硝基苯的處理效果參見圖1。從圖1看出經(jīng)過5天處 理，底泥中硝基苯污染物的濃度從4.41 mg/kg (干泥)降低到0.95mg/kg， 降解率為78.46%。 7天后測定底泥中硝基苯的含量，為未檢出，全部被降 解，說明固定化沸石顆粒對底泥中硝基苯污染物修復(fù)效果是另人滿意的。 實施例2
與實施例l不同之處在于
(1) 種子液的制備
在兼性厭氧條件下，將180ml富集培養(yǎng)基加入到250ml厭氧瓶中，滅 菌，冷卻后加入16 ml種液，放入28'C的培養(yǎng)箱中恒溫靜止培養(yǎng)一周，使 其微生物處于對數(shù)生長期，備用。
所述培養(yǎng)基按重量百分比計為葡萄糖0.2%、蛋白胨0.06%、酵母 膏0.06%、 NaC10.6%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04.7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌，滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分鐘。所述種液為含有2ml 濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，硝基苯的濃度為 30mg/L。
(2) 載體的預(yù)處理
沸石(購自遼寧省法庫沸石礦)，將大塊沸石破碎，使粒度范圍為 0.05-0.15 cm3。用自來水洗滌3次，并用自來水浸泡過夜，次日撈出風(fēng)干， 然后稱沸石40g加入到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放 入滅菌鍋中滅菌，備用。滅菌條件為0. 1Mpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在沸石無機載體中的固定
將上述裝有40g沸石的100ml廣口瓶中分別加入40ml富集培養(yǎng)基、 0. 40ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3mg/ml)和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28X:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。
(4) 固定化細(xì)胞的增殖
從上述裝有沸石載體的廣口瓶中倒出50ml殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮增殖培養(yǎng)基及0.5ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為 30mg/L。在兼性厭氧條件下、28X:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約2天即為增殖一次， 共增殖三次，分別增殖60h 、 50 h和48h;所述培養(yǎng)基與種子液制備所用 的培養(yǎng)基相同。完成每次增殖時瓶中增殖液呈現(xiàn)渾濁，有氣體逸出，苦杏 仁味消失并產(chǎn)生臭味，此時需更換新鮮的培養(yǎng)基即為一次增殖。用上述方 法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混合菌 提供了更多的吸附固定點，提高了固定化效率，使單位質(zhì)量細(xì)胞數(shù)量多、 密度大，經(jīng)過三批增殖后固定化沸石顆粒吸附固定的微生物細(xì)胞數(shù)可達(dá)到
1.4xl010cfb/g。
(5)固定化沸石顆粒使用方法及對底泥的修復(fù)效果 實驗釆用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數(shù)比為1: 2，所述泥為吉林石 化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標(biāo)為泥水混合物， 1000 g泥，2000g水，共3. OL.投加NaH2PO41.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5%固定化沸石顆粒投入到 上述污染水體和底泥環(huán)境中。處理前首先測定底泥中苯胺的初始濃度分別 為37.84 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C)靜止放置。 固定化混合菌沸石顆粒對底泥中苯胺的處理效果參見圖2。苯胺較難處理， 從圖2可以看出處理5天后，降解率僅為41.70%。經(jīng)過2個月的處理，底 泥中苯胺污染物的濃度從37.84 mg/kg降低到17.97mg/kg，降解率為52. 51%。 結(jié)果說明混合菌固定化沸石顆粒能夠抗底泥中的不同毒物，在不良環(huán)境中 可發(fā)揮多種菌的協(xié)同作用，使底泥中污染物含量不斷降低，能夠逐漸達(dá)到 徹底去除的目標(biāo)，固定化混合菌沸石顆粒修復(fù)底泥中苯胺污染物也是可行 的。
權(quán)利要求
1.一種混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于用沸石為載體將對數(shù)生長期的混合菌固定，即為將15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加入到含有硝基苯類溶液中的培養(yǎng)基，在兼性厭氧條件下，恒溫培養(yǎng)4-6天，取出40-50ml菌懸液，而后補充相同體積的含有硝基苯的培養(yǎng)基，在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)2-3天即為增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石顆粒。
2. 按權(quán)利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 所述含有硝基苯類污染物的培養(yǎng)基中硝基苯類污染物的濃度為25-35 mg/L。
3. 按權(quán)利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 對數(shù)生長期的混合菌為施氏假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌和陰溝腸 桿菌，其按體積份數(shù)比計1: 1: 1: 1，在含有硝基苯類污染物的培養(yǎng)基中 恒溫培養(yǎng)4-6天得到的混合菌。
4. 按權(quán)利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 沸石為用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風(fēng)干的。
全文摘要
本發(fā)明涉及混合菌固定化顆粒的制備方法，具體地說是采用沸石為載體對混合菌進(jìn)行固定。具體為將制備好的種子液接種到處理過的沸石載體上，并在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)4-6天條件下進(jìn)行吸附、培養(yǎng)和增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石顆粒。本發(fā)明具體采用無機載體沸石吸附固定混合菌，對多種菌吸附速度快、增殖效果好，操作簡單，無需改變自然環(huán)境和修筑大規(guī)模構(gòu)筑物，不產(chǎn)生二次污染。將其制備的固定化細(xì)胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環(huán)境中，可使底泥中硝基苯和苯胺得到有效去除，當(dāng)?shù)啄嘀邢趸?、苯胺初始濃度?.41mg/kg、37.84mg/kg時，硝基苯的降解率可達(dá)100％，苯胺降解率為52.51％。本發(fā)明的沸石來源豐富，價格便宜。
文檔編號C12N11/00GK101177680SQ200610134238
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者張春桂, 張海榮, 李培軍, 許華夏, 鞠京麗 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所