專利名稱：重組日本七鰓鰻口腔腺Grimin蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其抗腫瘤的作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
日本七鰓鰻口腔腺GRIMIN蛋白的基因克隆與表達(dá)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中GRIMIN蛋白的cDNA序列及克隆、與之對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達(dá)，及該重組蛋白通過(guò)抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子)的活性而特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞，而且可以利用質(zhì)脂體進(jìn)行包被作為藥物劑型在抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
日本七鰓鰻(Lampetra japonica)屬圓口綱(Cyclostomata)、七鰓鰻目、七鰓鰻科、七鰓鰻屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老的無(wú)頜脊椎動(dòng)物。其為海洋洄游性魚(yú)類，成體生活在海洋，經(jīng)常用吸盤(pán)附在其它魚(yú)體上吸食其血與肉，七鰓鰻的這種獨(dú)特的生活習(xí)性暗示著其體內(nèi)必定含有某些不同于其它生物物種的生物活性物質(zhì)。
GRIMIN為源自于日本七鰓鰻口腔腺的GRIM-19樣抗腫瘤基因重組蛋白。GRIM-19因可被干擾素beta和視黃酸所誘導(dǎo)表達(dá)而得名，其能通過(guò)抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子)的活性而特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞。因此，GRIM-19被認(rèn)為是一種新的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子。
由于GRIM-19能特異性抑制STAT3分子發(fā)揮作用來(lái)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳遞途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或者逆轉(zhuǎn)惡性表現(xiàn)型，而日本七鰓鰻GRIMIN與GRIM-19具有相同的功能結(jié)構(gòu)域及較高的序列同源性，這使得GRIMIN有望成為高效低毒、副作用小的抗腫瘤基因工程新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明于日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一條能翻譯出GRIMIN蛋白的開(kāi)放閱讀框，經(jīng)對(duì)其mRNA全長(zhǎng)的進(jìn)行釣取、測(cè)序及cDNA克隆，對(duì)其重組蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行了高效誘導(dǎo)表達(dá)。這個(gè)重組蛋白的生物學(xué)活性涉及到通過(guò)抑制STAT3的活性而特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞，因此，有望開(kāi)發(fā)臨床治療腫瘤新的蛋白藥物。
本發(fā)明從日本七鰓鰻口腔腺中分離提取mRNA，利用從前期構(gòu)建的cDNA文庫(kù)、EST文庫(kù)中獲得的生物學(xué)信息及mRNA全長(zhǎng)釣取的測(cè)序結(jié)果選取開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法獲得了GRIMIN蛋白的cDNA及其序列，本發(fā)明還提供了在大腸桿菌Rosetta菌中成功表達(dá)的蛋白及其序列，該GRIMIN重組蛋白具抗腫瘤的生物學(xué)活性，可利用脂質(zhì)體包被作為藥物劑型在抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
GRIMIN蛋白的cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列如下1.GRIMIN的cDNA序列435bp長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)由144個(gè)氨基酸組成，蛋白分子量為20.42051KD。其cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列為
1 atggcggcgtccaaggtgaagcaggacatgcctccgccgggaggtM A A S K V K Q D M P P P G G46 tacgggcccgtggactacaaacgaaacctccccaagaggggcctcY G P V D Y K R N L P K R G L91 tctggatactccatgtttgccattgggattggactcatgttatacS G Y S M F A I G I G L M L Y136 ggccagtataggattttcaagtggaaccgagagagaaggcggttgG Q Y R I F K W N R E R R R L181 cagattgaagagttggaatctcggattgcaatcttgccccttctgQ I E E L E S R I A I L P L L226 caagcggagcaagatagacatgttttgcagcaggtgcgcgagaacQ A E Q D R H V L Q Q V R E N271 ctggaggaggaggccaagatcatgaaggacgtgcccgggtggaagL E E E A K I M K D V P G W K316 gttggcgagagcgtgtacaactcgaaccgctggcacacgcccaccV G E S V Y N S N R W H T P T361 attgaccagctctacttcctgagggacgacgtcgacttggctcgcI D Q L Y F L R D D V D L A R406 gataagctcaaccacctcttccacgtgtag 435D K L N H L F H V *GRIMIN蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡的生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)如下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，收集細(xì)胞。未加蛋白作用的細(xì)胞作陰性對(duì)照；未加蛋白僅加脂質(zhì)體的細(xì)胞做脂質(zhì)體對(duì)照；加入蛋白和脂質(zhì)體混合物的結(jié)果與對(duì)照相比；結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)脂質(zhì)體包裹的蛋白作用的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，而同時(shí)證明脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞沒(méi)有作用。這說(shuō)明GRIMIN蛋白具有能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的活性。


圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)流程圖。
圖2為細(xì)胞凋亡測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
(1)MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，純化并復(fù)性后的脂質(zhì)體包被GRIMIN對(duì)人白血病細(xì)胞HL60及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖均具有顯著抑制作用，對(duì)HL60及ECV304作用的半劑量效應(yīng)IC50分別為4.6umol/L及5umol/L。
(2)純化并復(fù)性后的脂質(zhì)體包被GRIMIN能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL60及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。
圖3為DNA LADDER法示脂質(zhì)體包被的5umol/L的GRIMIN能誘導(dǎo)HL60及ECV304細(xì)胞發(fā)生凋亡。
(1)ECV304細(xì)胞發(fā)生DNA斷裂；(2)HL60細(xì)胞發(fā)生DNA斷裂。
圖4為流式細(xì)胞儀測(cè)定脂質(zhì)體包被的5umol/L的GRIMIN誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡。
III區(qū)示HL60部分細(xì)胞發(fā)生早期凋亡；IV區(qū)示部分HL60細(xì)胞發(fā)生了晚期凋亡。
圖5為Hoechst染色法示脂質(zhì)體包被GRIMIN誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞發(fā)生凋亡(Olympus熒光顯微鏡，400X)(1)PBS對(duì)照示正常ECV304細(xì)胞的細(xì)胞核只被染成淡藍(lán)色；
(2)脂質(zhì)體作用對(duì)照ECV304細(xì)胞的細(xì)胞核只被染成淡藍(lán)色，表明脂質(zhì)單獨(dú)作用細(xì)胞不發(fā)生凋亡。
(3)脂質(zhì)體包被的8umol/L的GRIMIN誘導(dǎo)發(fā)生凋亡細(xì)胞核由于致密濃縮，吸收Hoechst染料能力增強(qiáng)，細(xì)胞核發(fā)出亮藍(lán)色熒光。
具體實(shí)施例方式
1.總RNA的提取采用GIBCOBRL的Trizol試劑。具體如下(1)取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中保存；(2)稱取0.2g口腔腺組織，加1ml TRIzol試劑制備毒腺勻漿，4℃孵育5min；(3)加0.2ml氯仿，蓋緊蓋后用力振搖15sec，然后置于冰上5min；(4)4℃，12000xg，離心15min；(5)將上層水相移入另一離心管，加0.5ml異丙醇，并在冰上孵育10min；(6)4℃，12000xg，離心15min；(7)棄上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗滌，旋渦混勻；(8)4℃，10000xg離心5min，得到RNA沉淀；(9)空氣干燥后，用適量TE或無(wú)Rnase水溶解備用。
2.以自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺GRIMIN蛋白的cDNA；按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃20min，99℃5min，5℃5min引物序列如下P1-15’-XXcatatggcggcgtccaaggtgaagcag-3’P1-25’-XXaagcttcacgtggaagaggtggttgag-3’3.將獲取的目的cDNA與pET23b(Novagen公司產(chǎn)品)載體相連接，轉(zhuǎn)化入克隆菌DH5a后進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。
為產(chǎn)生帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，選擇pET23b做為基因克隆的載體，克隆具體操作如下(1)目的基因的回收與測(cè)序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit進(jìn)行，對(duì)回收DNA進(jìn)行測(cè)序。
(2)質(zhì)粒的提取采用寶生物的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行。
(3)目的基因DNA片段與載體pET23b的連接由于所設(shè)計(jì)的引物分別帶有Nde I和Hind III酶切位點(diǎn)，而這兩個(gè)酶切位點(diǎn)也是pET23b的多克隆位點(diǎn)，這使得將目的基因DNA片段與載體pET23b的連接成為可能。
(4)將連接產(chǎn)物CaCl2法轉(zhuǎn)化至克隆菌E.coli Rosetta菌中。
(5)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。
4.對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃誘導(dǎo)5h。
5.對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行組氨酸親和層析純化。
1)10000g離心10min收獲菌體，棄上清，并使殘液盡量流出。以每100ml的原培養(yǎng)液加40ml冰冷的1X Binding buffer的比例重懸細(xì)胞。
2)將上述樣品置于冰上超聲裂解細(xì)胞，直至溶液不再粘稠。
3)再以每100ml的原培養(yǎng)液加20ml冰冷的1X Binding buffer的比例重懸細(xì)胞。
4)10000g離心15min收集菌體，棄上清，以每100ml加5ml的比例加入6M尿素Binding buffer冰浴1h，進(jìn)行變性。
5)14000g離心30min以去除細(xì)胞碎片。
6)上清以0.45μm的濾膜過(guò)濾。
7)吸去His.Bind Column上室的貯液，并打開(kāi)下面管口；8)用10ml的1x Binding Buffer對(duì)柱子進(jìn)行平衡；
9)將過(guò)濾好的上清液上樣；10)用10ml的1x Binding Buffer(含6M尿素)洗柱；11)用10ml的20mM 1x Wash Buffer(含尿素)洗柱；12)用5ml的1x Elute Buffer(含尿素)洗脫目的蛋白。
6.培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定.
具體實(shí)驗(yàn)步驟如下MTT實(shí)驗(yàn)(1)培養(yǎng)人白血病細(xì)胞HL60及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，收集細(xì)胞。
(2)于96孔板中種好細(xì)胞，留出PBS對(duì)照，然后分別以2、4、6、8、10、12、14、16、18、20微升濃度加入蛋白，于CO2浮箱中孵育4h。
(3)酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。
DNA lader實(shí)驗(yàn)(1)收集人白血病細(xì)胞HL60及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304。
(2)分別取一瓶作對(duì)照，然后分別在另一瓶細(xì)胞中加入160微升蛋白和40微升脂質(zhì)體的混合的物，于CO2浮箱中孵育24h。
(3)按說(shuō)明書(shū)提取DNA lader。
(4)電泳觀察照相。
流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)(1)收集人白血病細(xì)胞HL60。
(2)種于六孔板中，加入100微升蛋白，CO2浮箱孵育過(guò)夜，蛋白作用16h。
(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度。
Hoechst染色實(shí)驗(yàn)(1)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，收集細(xì)胞。
(2)以未加蛋白作用的和只加脂質(zhì)體的細(xì)胞株分別作對(duì)照；另一株則加入160微升蛋白和40微升的脂質(zhì)體混合物，于CO2浮箱中培養(yǎng)48h。
(3)取出細(xì)胞，分別進(jìn)行普通光學(xué)染色和熒光染色處理。
(4)分別進(jìn)行普通光學(xué)和熒光顯微鏡觀察照相。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于日本七鰓鰻口腔腺被命名為GRIMIN，具如下氨基酸序列的GRIM-19蛋白，它由144個(gè)氨基酸組成，蛋白分子量為20.42051KD，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列為，M A A S K V K Q D M P P P G GY G P V D Y K R N L P K R G LS G Y S M F A I G I G L M L YG Q Y R I F K W N R E R R R LQ I E E L E S R I A I L P L LQ A E Q D R H V L Q Q V R E NL E E E A K I M K D V P G W KV G E S V Y N S N R W H T P TI D Q L Y F L R D D V D L A RD K L N H L F H V
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本七鰓鰻口腔腺GRIM-19蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本七鰓鰻口腔腺GRIM-19蛋白基因連接于pET23b載體的重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的日本七鰓鰻口腔腺GRIM-19蛋白基因連接于pET23b載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基因工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌重組蛋白的制備方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述來(lái)源于日本七鰓鰻口腔腺的GRIM-19蛋白，其生物學(xué)活性涉及到通過(guò)抑制信息轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)的活性而特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞，利用質(zhì)脂體進(jìn)行包被作為藥物劑型在抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
全文摘要
一具抗腫瘤作用的“日本七鰓鰻口腔腺GRIMIN蛋白的基因克隆與表達(dá)”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中GRIMIN蛋白的cDNA序列及克隆、與之對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達(dá)，及該重組蛋白通過(guò)抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信息轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子)的活性而特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞，而且可以利用質(zhì)脂體進(jìn)行包被作為藥物劑型在抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101033253SQ20061013468
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者李慶偉, 王繼紅, 麻曉慶 申請(qǐng)人:遼寧師范大學(xué)