專利名稱：尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法。
背景技術(shù)：
枯萎病是一類植物病害的總稱，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫?？菸∮屑毦圆≡?如香蕉細菌性枯萎病等)和真菌性病原兩種。本發(fā)明所指的枯萎病為真菌性病原，是由鐮刀菌屬真菌寄生引起的一種世界性的真菌土傳病害，其中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum Schl.)是主要病菌種類之一。尖孢鐮刀菌屬半知菌類(Fungiimperfecti)、梗孢目(Moniliales)、痤孢科(Tubercular)、鐮刀菌屬(Fusarium).自從Snyder和Hansen(1940)把鐮刀菌屬美麗組內(nèi)的種合并為1個，成為尖孢鐮刀菌。寄主范圍(1)經(jīng)濟作物棉花、油桐、蓖麻、亞麻等；(2)茄科作物番茄、胡椒、茄子、煙草、馬鈴薯等；(3)瓜類作物黃瓜、節(jié)瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜、絲瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫蘆瓜、哈密瓜等；(4)豆科作物大豆、四季豆、豇豆、豬屎豆、豌豆等；(5)花卉植物康乃馨、郁金香、魚尾菊、非洲菊、鳶尾、水仙、翠菊、合歡、百合、仙人掌、穿心蓮、一品紅、草坪草等；(6)林果植物松樹、相思樹、柑桔、沙棘、水杉、鐵線蓮屬植物、梨樹等；(7)其它植物萵苣、小麥、大蒜、荸薺、蘆筍、姜、香蕉等。植株被尖孢鐮刀菌侵染后，發(fā)病癥狀多種多樣，一般導(dǎo)致維管束枯萎、植株枯黃、球莖和根腐爛，植株生長衰弱。植株發(fā)病后，最初的癥狀表現(xiàn)嫩葉上出現(xiàn)輕微的褪綠，而后老葉開始下垂。苗期植株發(fā)病后迅速死亡；成株期產(chǎn)生葉脈失綠和葉片下垂，植株生長緩慢、下部葉片黃化、不定根形成、葉片和嫩莖萎蔫、落葉、剩余葉片邊緣壞死，最終導(dǎo)致全株死亡。維管束組織的褐變是尖孢鐮刀菌引起的枯萎病最明顯的特征，如西瓜枯萎病在較老的植株上，從盛花期到果實成熟期，癥狀會變得更明顯。
通過應(yīng)用了弱株系交互保護作用的原理，利用無致病力尖孢鐮刀菌，可產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性作用枯萎病無致病力菌株能誘導(dǎo)寄主的抗病機制。如文獻“瓜類植物誘導(dǎo)抗病性研究”所示，王守正等研究了西瓜、黃瓜對枯萎病和炭疽病的誘導(dǎo)抗病機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜、黃瓜經(jīng)枯萎病無致病力菌株誘導(dǎo)后與抗病性有關(guān)的過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性明顯增強，酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量增多。西瓜、黃瓜對枯萎病的誘導(dǎo)抗病機制和黃瓜對炭疽病的誘導(dǎo)抗病機制基本一致。用從西瓜維管束中分離到的尖孢鐮刀菌無致病力菌株F0-3和茄病鐮刀菌無致病力株F5-1誘導(dǎo)處理西瓜幼苗，能使西瓜產(chǎn)生對枯萎病的抗性。
然而作為微生物之間的這種干擾作用，往往因各種因素影響產(chǎn)生變化，如無致病力尖孢鐮刀菌會恢復(fù)致病力、失去競爭力等，導(dǎo)致保護作用降低，因而，在大面積應(yīng)用上必須建立一套檢測技術(shù)，能有效的鑒別尖孢鐮刀菌無致病力菌株，使其能更好的利用無致病力尖孢鐮刀菌的誘導(dǎo)寄主的抗病機制，防治植物的枯萎病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，此檢測方法能有效的鑒別尖孢鐮刀菌無致病力菌株，從而利用尖孢鐮刀菌無致病力菌株作為免疫接種劑防治枯萎病病害。
為了達到上述目的，本發(fā)明的解決方案是一種尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，包括如下步驟(a)尖孢鐮刀菌同工酶檢測；(b)尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測；(c)尖孢鐮刀菌ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)測序檢測；(d)尖孢鐮刀菌特異性引物R10/L10檢測；(e)尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)檢測。
所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，采用的緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液(三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸緩沖液)，pH8.3。
所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，樣品保存溫度為-20℃冷凍保存。
所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定相對比移值Rf，Rf＝酶帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離。
尖孢鐮刀菌同工酶檢測步驟包括菌體的收集，菌株培養(yǎng)7d后，收集菌絲，-20℃保存?zhèn)溆?。樣品的制備，將菌絲置于研缽中，按照1∶2(W/V)的比例與10×Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)混合，冰浴研磨，冷凍離心，取上清液，加入等體積的40％蔗糖溶液混合，-20℃冷凍保存。過氧化物酶同工酶電泳，(1)凝膠的制備采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，(2)點樣用加樣器點樣，每個樣品上樣量為100μL，以0.01％的溴酚藍為前沿指示劑。(3)電泳加樣后，在冰箱內(nèi)電泳。(4)染色過氧化物酶(POD)同工酶染色聯(lián)苯胺用無水乙醇熱溶，分別加入乙酸和乙酸鈉，然后加入蒸餾水和H2O2混合，將凝膠放入染色液中，待酶帶全部顯示清晰后，用蒸餾水清洗凝膠，拍照，測定Rf值后，7％醋酸保存。(5)Rf值的計算Rf＝酶帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離。
所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，采用PSA液體培養(yǎng)基。
所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，采用的緩沖液為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液。
所述的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液加入量為0.9mL，Na2HPO4濃度為0.2mol/L，檸檬酸濃度為0.1mol/L。
所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，利用分光光度計進行吸廣度OD的測定。
尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測步驟包括(1)菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵濾液的收集，采用PSA液體培養(yǎng)基，25℃條件下，培養(yǎng)14d后，用雙層紗布過濾除去菌絲，取上清液進行測定。(2)β-葡萄糖苷酶活性測定方法，稀釋的粗酶液中加入0.9mL Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，經(jīng)反應(yīng)后測吸光值OD。以加熱失活的酶液按照同樣的方法處理作空白。(3)β-葡萄糖苷酶活性的表示方法，在上述條件下，每毫升酶液每分鐘水解產(chǎn)生1μmol的對硝基苯酚的酶活力，定義為一個酶活單位。
所述的尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，采用的緩沖液為Tris-HCl，NaCl，EDTA混合后的提取緩沖液。
所述的Tris-HCl，NaCl，EDTA提取緩沖液的加入量為500μL，其中Tris-HCl濃度為5mM/L，NaCl濃度為150mM/L，EDTA濃度為100mM/L。
所述的尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，采用的引物Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’；Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’。
所述的尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，采用在含有1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳以檢查結(jié)果。
尖孢鐮刀菌ITS測序檢測步驟包括(1)菌株DNA制備，①菌絲干粉放入離心管；②加入500μL提取緩沖液(Tris-HCl，NaCl，EDTA)懸浮干粉，在渦流振蕩器上混勻；③加入SDS和蛋白酶K，37℃溫??；④加入NaCl和CTAB/NaCl溶液，65℃溫??；⑤用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，離心，取上清液移至干凈管中；⑥將上清液，再加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次；⑦如水相與有機相之間仍有雜質(zhì)，再重復(fù)抽提過程；⑧上清液中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA(-20℃放置1-2h)，離心；⑨取沉淀，加70％乙醇洗1遍；⑩真空干燥后將DNA溶解在TE緩沖液(Tris-HCl，EDTA)中。
(2)設(shè)計引物及DNA聚合酶如圖5所示顯示了本發(fā)明引物及DNA聚合酶的設(shè)計結(jié)構(gòu)圖。
(3)PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)-擴增，(4)擴增產(chǎn)物檢測，取PCR產(chǎn)物在含有1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳以檢查擴增結(jié)果，然后在Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)上觀察并貯存圖像。
所述的尖孢鐮刀菌特異性引物R10/L10檢測，采用的引物R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
尖孢鐮刀菌特異引物R10/L10檢測步驟包括(1)菌株DNA制備，采用CTAB法。(2)PCR擴增體系總體積25ul，包含雙蒸水19.1ul，10 x PCR buffer2.5ul，dNTP 0.2ul，引物R10 1ul，引物L(fēng)10 1ul，DNA 1ul，Taq酶0.2ul。(3)PCR擴增程序94℃預(yù)變性3分鐘；接下來35個循環(huán)中包含94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；最后72℃延伸10分鐘。(4)擴增產(chǎn)物檢測，取PCR產(chǎn)物在含有1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳以檢查擴增結(jié)果，然后在Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)上觀察并貯存圖像。
尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)檢測步驟包括將各菌株在PSA平板上培養(yǎng)7d后，從平板上將菌絲刮入無菌水試管中配成了孢子懸浮液，過濾，濾液經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)后配成孢子數(shù)相同的懸浮液，吸1mL到盛有PSA液體培養(yǎng)基中，于25℃下振蕩培養(yǎng)14d。去除菌液接菌備用。各菌株分別取上述菌液處理黃瓜種子，每處吸適量菌液至已滅菌的三角瓶中，每瓶放入一定量粒黃瓜種子，以無菌水作對照。置于28℃，輕微振蕩培養(yǎng)(提高通氣量，促進發(fā)芽)，4d后轉(zhuǎn)移至30℃的人工氣候箱培養(yǎng)，觀察用各菌株不同處理組對黃瓜植株的致病力差異，選擇無發(fā)病組的菌株。培養(yǎng)至第14d時取各處理組植株，檢測植株的根、莖基部、莖中部、莖頂部的菌的存在情況。方法取植株的根、莖基部、莖中部、莖頂部組織用0.1％升汞表面消毒后用無菌水清洗后置于PSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。
本發(fā)明建立了一套尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，來有效的鑒別尖孢鐮刀菌無致病力菌株，枯萎病尖孢鐮刀菌無致病力菌株能誘導(dǎo)寄主的抗病機制，以產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性作用，是應(yīng)用弱株系交互保護作用的原理。本發(fā)明從同工酶、β-葡萄糖苷酶、鑒別基因引物、液體培養(yǎng)接種的方法，建立尖孢鐮刀菌無致病力菌株檢測體系。此檢測方法能有效的鑒別尖孢鐮刀菌無致病力菌株，從而利用尖孢鐮刀菌無致病力菌株作為免疫接種劑防治枯萎病病害。


圖1是本發(fā)明的對硝基苯酚-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2是本發(fā)明的黃瓜尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性。
圖3是本發(fā)明的9條序列兩端修剪整齊后的比對結(jié)果ClusterW方法。
圖4是本發(fā)明的強、弱毒株基因序列差異比較。
圖5是本發(fā)明引物及DNA聚合酶的設(shè)計結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式
1.尖孢鐮刀菌同工酶檢測步驟供試菌株及來源見表1，菌體的收集，將各菌株培養(yǎng)7d后，收集菌絲，用蒸餾水反復(fù)沖洗，最后用濾紙壓干，-20℃保存?zhèn)溆谩悠返闹苽?，將菌絲置于研缽中，按照1∶2(W/V)的比例與10×Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)混合，冰浴研磨，12000rpm冷凍離心20min，取上清液，加入等體積的40％蔗糖溶液混合，-20℃冷凍保存。
過氧化物酶(POD)同工酶同工酶電泳，(1)凝膠的制備采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠4％，分離膠7％。(2)點樣用加樣器點樣，每個樣品上樣量為100μL，以0.01％的溴酚藍為前沿指示劑。(3)電泳加樣后，在冰箱內(nèi)電泳，先將電壓調(diào)至120V，穩(wěn)壓電泳，待樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至150V，直至電泳結(jié)束，整個電泳過程大約7～8h。(4)染色，過氧化物酶(POD)同工酶染色0.1g聯(lián)苯胺用5mL無水乙醇熱溶，分別加入10mL，1.5mol/L乙酸和10mL，1.5mol/L乙酸鈉，然后加入75mL蒸餾水和250μL 30％H2O2混合，將凝膠放入染色液中，待酶帶全部顯示清晰后，用蒸餾水清洗凝膠，拍照，測定Rf值后，7％醋酸保存。(5)相對比移值Rf的計算，Rf＝酶帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離。
檢測結(jié)果如表2所示。從酶帶數(shù)量上來看，在相同培養(yǎng)條件下，同一寄主不同部位分離的鐮刀菌的POD同工酶條帶是相同的，都是3條POD同工酶酶帶，其遷移率分別為0.04；0.2；0.33。在POD同工酶表達的強弱上，同一寄主不同部位分離的鐮刀菌存在著細微的差別，主要是3#菌株的POD同工酶，其第一條酶帶和第二條酶帶的著色較深，表達強度較強；而第三條酶帶著色較淺，表達較弱。其它菌株的同工酶差別不大。同工酶酶帶之間也存在著一定的差別，主要是表現(xiàn)在第一條和第二條酶帶著色很深，表達很強；第三條酶帶著色較淺，表達較弱。在黃瓜不同部位分離的尖孢鐮刀菌的POD電泳顯示，在酶帶數(shù)量上是相同的，只是在表達強度上存在著一定的差別。
2.尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測步驟(1)菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵濾液的收集，采用馬鈴薯蔗糖(PS)液體培養(yǎng)基，裝瓶量為100mL，每瓶接入5個6mm的菌片，25℃條件下，120rpm，培養(yǎng)14d后，用雙層紗布過濾除去菌絲，6000rpm離心10min，取上清液進行測定，試驗重復(fù)3次。
(2)β-葡萄糖苷酶活性測定方法，取0.1mL適度稀釋的粗酶液，加入0.9mL pH5.0的0.2mol/L Na2HPO4-0.1mol/L檸檬酸緩沖液，于50℃恒溫水浴預(yù)熱5-10min，再加入已經(jīng)預(yù)熱5-10min的1mL 4mmol/L的p-NPG溶液，16min后立即加入1mL 1mol/L的NaCO3溶液終止反應(yīng)，室溫放置5min后，于400nm處測吸光值OD。以加熱失活的酶液按照同樣的方法處理作空白。
(3)β-葡萄糖苷酶活性的表示方法，在上述條件下，每毫升酶液每分鐘水解產(chǎn)生1μmol的對硝基苯酚的酶活力，定義為一個酶活單位。對硝基苯酚-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
試驗結(jié)果見表3和圖2所示。黃瓜尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性分別為54.89u/mL、23.84u/mL、21.57u/mL、35.52u/mL和34.56u/mL。黃瓜植株的尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性差別較大，病株來源的尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性較高，分別為35.52u/mL和34.56u/mL；健株來源的尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性較低，分別為23.84u/mL和21.57u/mL。菌株119的β-葡萄糖苷酶活性最高，為54.89u/mL。
3.尖孢鐮刀菌ITS測序檢測步驟(1)菌株DNA制備方法①25mg菌絲干粉于1.5mL離心管；②加入500uL提取緩沖液(5mM/L Tris-HCl，pH8.0；150mM/L NaCl，100mM/LEDTA)懸浮干粉，在渦流振蕩器上混勻；③加入50uL 10％SDS和2uL20mg/mL的蛋白酶K，37℃溫浴1h；④加入75uL 5M/L NaCl和65uLCTAB/NaCl溶液，65℃溫育20min；⑤用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，10,000g離心10min，取上清液移至干凈管中；⑥將上清液，再加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次；⑦如水相與有機相之間仍有雜質(zhì)，再重復(fù)抽提過程；⑧上清液中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA(-20℃放置1-2h)，10,000g離心10min；⑨取沉淀，加70％乙醇洗1遍；⑩真空干燥后將DNA溶解在TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5；0.1mMEDTA中，-70℃保存)。
(2)設(shè)計引物及DNA聚合酶Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’如圖形發(fā)生器所示，顯示本發(fā)明引物及DNA聚合酶的設(shè)計結(jié)構(gòu)圖。
(3)PCR擴增PCR反應(yīng)的總體積為25μL，含有1單位的Taq酶，10倍擴增緩沖液2.5μL，3mM/L MgCl2，每種dNTP 0.15mM/L，10pM/L的Primer 1和Primer 2各1μL，DNA模板25ng。PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性10min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共25個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
(4)擴增產(chǎn)物檢測PCR擴增結(jié)束后，取6μL PCR產(chǎn)物在含有1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳以檢查擴增結(jié)果，然后在Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)上觀察并貯存圖像。
檢測結(jié)果與分析目的片段18S-28S r DNA及ITS區(qū)的PCR擴增，PCR產(chǎn)物的純化及測序，未純化的PCR產(chǎn)物，通過用先割膠后過柱純化的方法繼續(xù)純化，在自動DNA測序儀上進行序列測定。ITS1+5.8S+ITS2序列在GeneBank進行比對的結(jié)果見表4所示。
將測序結(jié)果9條序列兩端修剪整齊后，用ClusterW方法，進行聚類分析，結(jié)果如圖3所示；分析結(jié)果表明，9株尖孢鐮刀菌分為2類，第1類包括了編號06、08、10、11尖孢鐮刀菌，它們分別是甜瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-132，F(xiàn)-T.1.7-030520，采集地福州永泰，豌豆枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-117，F(xiàn)-W.6.2-030304，采集地漳州漳浦；黃瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-121，F(xiàn)-H.6.5-030318-J1，采集地漳州詔安，黃瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-123，F(xiàn)-H.6.5-030318-B3，采集地漳州詔安。第2類包括了編號05、07、09、12尖孢鐮刀菌，它們分別是西瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-135，F(xiàn)-X.1.7-030520-(1-1)，采集地福州永泰，黃瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-124，F(xiàn)-H.6.5-030318-B1，采集地漳州詔安，黃瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-120，F(xiàn)-H.6.5-030318-J4，采集地漳州詔安，黃瓜枯萎病原尖孢鐮刀菌菌株12-124，F(xiàn)-H.6.5-030318-B1，采集地漳州詔安。分析的結(jié)果與未切齊的一樣，只是聚類的順序不同。
測序結(jié)果見圖4所示，強毒株與弱毒株之間基因存在著顯著差異，序列標(biāo)明的44個堿基弱毒株與強毒株之間不同，弱毒株內(nèi)部差異不大。
4.尖孢鐮刀菌特異性引物R10/L10檢測步驟(1)DNA制備方法取200mg菌絲，用液氮研磨后置于1.5ml離心管；加CTAB緩沖液(20g CTAB/L，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl，20mmol/LEDTA，PH8.0)500ul；65℃水浴加熱3min；加500ul苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混均；4℃，12000g，10min；取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混均；4℃，12000g，10min；取上清液至新管；加2倍體積沉淀液(5g CTAB/L，0.04mol/L NaCL)；室溫1h；4℃，12000g，5min；棄上清液；加350ul NaCl(1.2mol/L)溶解沉淀；沉淀溶解后，加350ul氯仿混勻；4℃，12000g，10min；取上清液至新管；加0.6倍體積異丙醇，混勻；4℃，12000g，10min；棄上清；70％乙醇洗滌沉淀；干燥，加TE溶解。
(2)設(shè)計引物及DNA聚合酶R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
(3)CR擴增體系總體積25ul，包含雙蒸水19.1ul，10 x PCRbuffer2.5ul，dNTP 0.2ul，引物R10 1ul，引物L(fēng)10 1ul，DNA 1ul，Taq酶0.2ul。
(4)PCR擴增程序94℃預(yù)變性3分鐘；接下來35個循環(huán)中包含94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；最后72℃延伸10分鐘。
(5)擴增產(chǎn)物檢測取PCR產(chǎn)物在含有1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳以檢查擴增結(jié)果，然后在Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)上觀察并貯存圖像。
檢測結(jié)果與分析尖孢鐮刀菌的強、弱菌株經(jīng)特異引物R10/L10PCR擴增后，強菌株擴增出單一條帶，大小為200bp；弱菌株擴增出兩條帶，大小分別為600bp和200bp。
5.尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)檢測步驟將各菌株在PSA平板上培養(yǎng)7d后，從平板上將菌絲刮入10mL的無菌水試管中配成了孢子懸浮液，用雙層紗布過濾，濾液經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)后配成孢子數(shù)相同的懸浮液，吸1mL到盛有100mL PSA液體培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于25℃下振蕩培養(yǎng)14d。過濾獲得孢子懸浮液。分別取上述菌株孢子懸浮液處理黃瓜種子，每處理吸10mL孢子懸浮液至已滅菌的150mL的三角瓶中，每瓶放入20粒黃瓜種子，以無菌水作對照。置于28℃，60r/min下輕微振蕩培養(yǎng)(提高通氣量，促進發(fā)芽)，4d后轉(zhuǎn)移至30℃的人工氣候箱培養(yǎng)，觀察用各菌株不同處理組對黃瓜植株的致病力差異，選擇無發(fā)病組的菌株。培養(yǎng)至第14d時取各處理組植株，檢測植株的根、莖基部、莖中部、莖頂部的菌的存在情況。方法取植株的根、莖基部、莖中部、莖頂部組織各1cm用0.1％升汞表面消毒后用無菌水清洗3遍后置于PSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。
第14d未發(fā)病植株組織體內(nèi)病病原菌平板分離的結(jié)果，表明各菌株處理組植株均有枯萎病原菌侵入，只是還未表現(xiàn)病癥，而清水對照組中未分離到枯萎病菌。
表1.供試菌種及來源

表2 同一寄主不同部位尖孢鐮刀菌POD同工酶條帶的分布及強弱對比情況

注強++++；中+++；弱++；淺+表3 黃瓜尖孢鐮刀菌的β-葡萄糖苷酶活性

表4 使用ITS1+5.8S+ITS2序列在GeneBank進行比對的結(jié)果


權(quán)利要求
1.一種尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(a)尖孢鐮刀菌同工酶檢測；(b)尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測；(c)尖孢鐮刀菌ITS測序檢測；(d)尖孢鐮刀菌特異性引物R10/L10檢測；(e)尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，采用的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，樣品需冷凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌同工酶檢測，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定相對比移值Rf。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，采用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，采用的緩沖液為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶檢測，利用分光光度計進行吸廣度的測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，采用的緩沖液為Tris-HCl，NaCl，EDTA混合后的提取緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，采用的DNA聚合酶為Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’；Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌R10/L10檢測，采用的特異性引物為R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于所述的尖孢鐮刀菌R10/L10檢測、尖孢鐮刀菌ITS測序檢測，都采用在瓊脂糖凝膠中電泳以檢查結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開一種尖孢鐮刀菌無致病力菌株的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(a)尖孢鐮刀菌同工酶檢測；(b)尖孢鐮刀菌β－葡萄糖苷酶檢測；(c)尖孢鐮刀菌ITS測序檢測；(d)尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)檢測，此檢測方法能有效的鑒別尖孢鐮刀菌無致病力菌株，從而利用尖孢鐮刀菌無致病力菌株作為免疫接種劑防治枯萎病病害。
文檔編號C12Q1/68GK101037704SQ20061013541
公開日2007年9月19日 申請日期2006年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日
發(fā)明者劉波, 朱育菁, 藍江林, 肖榮鳳, 林抗美, 鄭雪芳, 曹宜, 蘇明星, 史懷, 葛慈斌, 阮傳清, 劉蕓 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所