專利名稱：一種檢測白介素－6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地涉及一種檢測白介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法。
背景技術：
隨著人類基因組測序計劃的完成，人類已進入后基因組時代。該時代的研究重點是個體間的遺傳差異。這種差異最常見的是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性。這種多態(tài)性是決定人類疾病易感性的主要因素。已有研究表明白介素-6基因啟動子區(qū)存在四個多態(tài)性位點(Catherine F.Terry，Valerie Loukaci，Fiona R.Green.Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptionalregulation.J.Biol.Chem，Vol.275，Issue 24，18138-18144，June 16，2000)。其中，-597G/A，-572G/C，-174G/C三個位點的多態(tài)性是關于心血管方面的報道(Humphies SE，Luong LA，Ogg MS，et al.The interleukin-6-174G/C promoterpolymorphism is associated with risk of coronary heart disease and systolic bloodpressure in health men[J]，Eur Heart J，2001，22；2243-2252；Anna M.Bennet，Jonathan A.Prince，Guo-Zhong Fe，et al.Interleukin-6 serum level and genotypesinfluence the risk for myocardial infarction.Atherosclerosis 171(2003)359-367.)，并且兩個位點的多態(tài)性和心血管病相關。(Brull DJ，Montgomery HE，Sanders J，Dhamrait S，Luong L，Rumley A，Low GDO，Humphies SE.Interleukin-6 gene-174G＞C and-572G＞C promoter polymorphism are strong predictors of plasmainterleukine-6 leveles after coronary artery bypass surgery.；Humphrise SE，LuongLA，Ogg MS，et al.The interleukin-6-174G/C promoter polymorphism isassociated with risk of coronary heart disease and systolic blood pressure in healthmen[J]，Eur Heart J，2001，22；2243-2252).
白介素-6基因調控的機理尚未被完全了解，Catherine F，Terry的研究表明白介素-6的調控可能是由多態(tài)性位點之間的相互作用決定的，而不是由單一位點的多態(tài)性來決定(Terry CF，Loukaci V，Green FR..Cooperative influence ofgenetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptional regulation.Jour of BioChem，2000，275(24)；18-138)。因此，研究者從單一位點的多態(tài)性出發(fā)研究與白介素-6水平的關系時，不同的實驗會得到不同的結論，有的甚至相互矛盾。研究表明，白介素-6基因啟動子區(qū)-174G/C等位基因的頻率在中國，日本和韓國人群中非常低(Lim C.S；Zheng S；Kim Y.S；Cytokine，Volume 19，Number 1，July 2002，52-54(3))。鑒于中國人白介素-6基因啟動子區(qū)-174位點的突變頻率很低，我們推測中國漢族人白介素-6基因的調控可能是啟動子區(qū)-572位點和-597位點的多態(tài)性相互作用的結果，因此設想通過這兩個位點的同時檢測來評價中國漢族人心血管病的易感性。
目前，國內的報道大多采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析方法來檢測白介素-6基因啟動子區(qū)位點的多態(tài)性。例如付海霞等用此方法檢測了232例患者和260例對照組的白介素-6基因-572G/C的多態(tài)性(付海霞，張嘉瑩，李庚山等，白細胞介素6基因-572C/G多態(tài)性與心肌梗塞易感性的關聯研究中華醫(yī)學遺傳學雜志，2006，23(3)245-249)。這種傳統的檢測技術雖然在某種程度上能夠完成對SNP的檢測，但必須通過凝膠電泳檢測，耗時、費力，且難以達到自動化的程度。此外，盡管此方法對相關位點的限制性內切酶的活性進行了嚴格的限定，但已有假陽性的出現與相關位點的限制性內切酶的活性無關的報道。
因此，尋找一種快捷高效的能同時檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A，-572G/C位點多態(tài)性的方法成為下一步研究的關鍵。

發(fā)明內容
(一)要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一種檢測白介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法。
(二)技術方案本發(fā)明所述方法的基本原理為利用實時熒光定量PCR原理，采用熒光標記的特異性寡核苷酸探針，描繪目標DNA片段的熔點曲線，從而獲得擴增產物的特異性熔點曲線。任一突變位點最多只有三種熔點曲線。每種特征性熔點曲線相對應的PCR產物只需一次測序驗證其基因型，以后所有樣本就可以根據解鏈溫度(Tm)的峰值來判斷目標DNA的突變類型。具體講就是運用同一對引物，在實時熒光定量PCR分析儀上一次實驗同時擴增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C兩位點的DNA片段，實現在同一PCR反應體系中分別運用兩對探針對兩個突變位點進行檢測。由于兩個突變位點相距較近，設計探針的堿基序列分別與目標DNA的編碼鏈和模板鏈分別互補，以減少它們之間的競爭。熒光標記的探針與目標DNA堿基序列雜交時，進行完全和不完全的匹配反應，如果某處有突變，堿基錯配使得探針和目標序列結合不穩(wěn)定，降低了Tm。純合體的Tm曲線只有一個峰，雜合體樣本的Tm曲線有兩個峰，和目標序列形成完全互補DNA的Tm比含有錯配堿基的Tm高，可以很清楚的檢測到兩個熔鏈溫度的差異，從而達到通過探測Tm值來識別等位基因的目的。兩對探針分別標記不同的熒光，運用羅氏Lightcycler分析儀F2和F3通道可對此兩位點同時檢測(F2通道檢測-597位點，F3通道檢測-572位點)，從而建立同時分型白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A，-572G/C兩位點的方法。
本發(fā)明所述的方法，所用到的引物和探針是根據基因庫中人白介素-6基因的全基因序列(基因登錄號AF372214，Rieder，M.J，Carrington，D.P，Chung，M.-W.，Lee，K.L.，Poel，C.L.，Yi，Q.and Nickerson，D.A.Molecular Biotechnology，University of Washington，1705 NE Pacific，Seattle，WA 98195，USA)來設計的。
一種檢測白介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法，它包括下述步驟(1)設計用于擴增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C兩位點的DNA片段的引物正向引物5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；
反向引物5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；(2)設計分別用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A，572G/C兩位點的探針，并用不同的熒光素分別標記下述兩對探針用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A位點的探針為檢測探針5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基，檢測探針和錨定探針均與目標DNA的編碼鏈相互補；用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-572G/C位點的探針為檢測探針5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；由于付海霞等的研究表明中國漢族人此位點CC基因型占多數(付海霞，張嘉瑩，李庚山等，白細胞介素6基因-572C/G多態(tài)性與心肌梗死及血脂關系的研究.中國醫(yī)師進修雜志，2006，29(4)1-3.)，我們將檢測探針在此位點的堿基設為C，檢測探針和錨定探針的堿基序列與目標DNA的模板鏈相互補，檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基；以上所述的兩對探針分別用HPLC純化；(3)PCR擴增，并進行熒光檢測；(4)描繪熔點曲線；(5)根據得到的特征性熔點曲線，判斷待測樣品的基因型；(6)對所述的待測樣品的基因型進行測序驗證。
在本發(fā)明所述的方法中，所述步驟(3)的PCR反應體系為試劑成分 濃度 加入量(μL) 終濃度(含量)正向引物 10μM/L0.6-1.2 0.3-0.6μM/L反向引物 10μM/L0.6-1.2 0.3-0.6μM/L-597位點檢測探針 5μM/L 0.2-1.6 0.05-0.4μM/L
-597位點錨定探針 5μM/L 0.2-3.2 0.05-0.8μM/L-572位點檢測探針 5μM/L 0.2-3.2 0.05-0.8μM/L-572位點錨定探針 5μM/L 0.4-6.4 0.1-1.6μM/LLightCyclerFastStart 3-6DNAMasterplus HybprobeMix水模板DNA 50-150ng/μ 1-8 50-1200ng/μLLPCR循環(huán)條件為模板DNA變性1循環(huán)93-97℃變性8-15min，溫度變化速率18-20℃/s；目標DNA擴增30-45個循環(huán)93-97℃變性8-12s，50-54℃退火3-7s，70-74℃延伸7-11s，溫度變化速率設為從變性到退火18-20℃/s，從退火到延伸1-4℃/s，從延伸到變性18-20℃/s；擴增后進行解鏈分析1個循環(huán)92-97℃ 0-1s，38-45℃ 28-33s，溫度變化速率為18-20℃/s，然后以0.1-0.5℃/s的速率加熱到85-95℃；最后以8-12℃/s的速度將反應混合物冷卻到38-42℃保持28-32s。
熒光檢測參數設置為在擴增階段，將熒光通道設為F2/1或F3/F1，在每個退火點同時進行兩通道的熒光檢測；在描繪熔點曲線階段，將熒光通道顯示模式設為F2/1或F3/F1，連續(xù)記錄熒光值。
在本發(fā)明所述的方法中，所述步驟(4)的熔點曲線是以溫度為橫坐標，熒光值的倒數[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]為縱坐標建立起來的，分別記錄每一樣品兩個通道的Tm值。
運用LightCycler5.32解鏈分析軟件進行熔點溫度的檢測，Tm值相同的峰判定為同一種基因型，其步驟為(1)選適當的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手調來確定待檢樣品的熔點Tm值。(2)比較樣品中是否有熔點Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范圍內，可以看成同一個峰。因為不同樣本的DNA含量、無機、有機環(huán)境不可能完全一致，所以允許熔點Tm峰有±1.0℃范圍的偏差。當發(fā)現有Tm峰在1.0℃-2.0℃之間時，說明有少量非特異的擴增，其原因是樣本中含有的病毒序列可能與特異探針結合或有少量堿基錯配發(fā)生，導致Tm峰值為多個峰疊加。待檢DNA樣本用TE緩沖液(含10mM Tris，1mMEDTA)稀釋10倍即可減少誤差。本實驗通過412個樣本Tm值的測定發(fā)現在-572位點，原生純合型和野生純合型的Tm值分別為(60.67℃-63.83℃，平均值為62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值為54.41℃)；在-597位點，原生純合型和雜合型的Tm值分別為(62.02℃-65.25℃，平均值為64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值為55.61℃)。
在本發(fā)明所述的方法中，所述步驟(5)中待測樣品的基因型判斷是根據步驟(4)得到的特征性熔點曲線，每一種特征性的熔點曲線對應一種基因型，對照測序結果可知每一待檢樣品的基因型。
在本發(fā)明所述的方法中，所述步驟(6)中測序驗證過程為根據獲得的熔點曲線，在每一種Tm值相同的峰對應的樣本中任選一個樣本進行DNA測序驗證。具體過程為先用普通PCR在基因擴增雜交儀上擴增目的DNA片段，反應體系20μL。
試劑成分 濃度加入量(μL)TakaRa Taq酶 5U/μL 0.110XBuffer緩沖液 Tris-HCL(pH8.3，100mM， 2KCL(500mM)，MgCL2(15mM)dNTP 2.5mM 1.6正向引物 10μM/L 1
正向引物 10μM/L 1DNA50-150ng/μL5水 9.3循環(huán)條件模板DNA變性1循環(huán)94℃ 5min；目標DNA擴增35個循環(huán)94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。
PCR結束后，以DL2000(TakaRa)為分子量標尺，取目標DNA擴增液9μL和1μL上樣緩沖液混勻，點入1％瓊脂糖(每100m瓊脂糖凝膠加5μL北京賽百盛基因技術有限公司的GoldView)凝膠加樣孔內，以100V電壓泳動5分鐘，再以50V電壓泳動1小時，取下凝膠，在紫外燈下檢測擴增產物并照相。
將電泳陽性條帶對應的PCR產物18μL送去測序，根據測序結果可獲得不同熔點曲線所對應白介素-6的基因型。由熔點曲線的類型就可以直接判斷對應樣本的基因突變類型，不再需要對以后的PCR產物進行測序。測序結果發(fā)現，中國北方漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-572位點有三種基因型，分別為GG，GC，CC型；-597位點有兩種基因型，為GG型和GA型(通過對412例中國漢族人群的檢測，尚未發(fā)現AA型)。
本發(fā)明所述的方法在評價人心血管病易感性中的應用，特別是在評價中國漢族人心血管病易感性中的應用。
(三)有益效果本發(fā)明所述的方法運用實時熒光PCR儀結合熔點分析在同一反應體系中實現了同時對白介素-6基因啟動子區(qū)-572G/C，-597G/A兩位點多態(tài)性的檢測。解鏈得到的特征性熔點曲線均只對應一種基因型，一個多態(tài)性位點最多只會有3種特征性熔點曲線，因此只需DNA測序驗證一次即可得出以后所有相同峰型對應樣本的基因型。
該方法與直接測序的檢測方法相比，操作簡單，成本低廉，結果判斷直觀，反應快速，31個樣本在30分鐘內即可完成檢測過程，并且每一反應都是閉管進行，有效減少了PCR污染的風險。


圖1是本發(fā)明所述探針的設計原理圖；圖2是用實時熒光PCR儀的F3通道檢測31例中國北方漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-572位點多態(tài)性的熔點分析圖，其中，1為GG型，2為CC型，3為GC型，4為陰性對照；圖3是用實時熒光PCR儀的F2通道檢測31例中國北方漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-597位點多態(tài)性的熔點分析圖，其中，1為GA型，2為GG型，3為陰性對照。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1 用本發(fā)明所述的方法同時檢測31例中國北方漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A，-572G/C兩位點的多態(tài)性(1)設計用于擴增含白介素-6基因597G/A，572G/C兩位點的DNA片段的引物正向引物5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；反向引物5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；(2)設計分別用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A，572G/C兩位點的探針，并用不同的熒光素分別標記下述兩對探針，探針設計原理如附圖1所示用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A位點的探針為檢測探針5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基，檢測探針和錨定探針均與目標DNA的編碼鏈相互補；用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-572G/C位點的探針為檢測探針5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；檢測探針在此位點的堿基設為C，檢測探針和錨定探針的堿基序列與目標DNA的模板鏈相互補，檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基；以上所述的兩對探針分別用HPLC純化；(3)PCR擴增，并進行熒光檢測PCR反應體系為試劑成分 濃度加入量(μ終濃度(含量)L)正向引物 10μM/L 1 0.5μM/L反向引物 10μM/L 1 0.5μM/L-597位點檢測探針 5μM/L 0.4 0.1μM/L-597位點錨定探針 5μM/L 0.8 0.2μM/L-572位點檢測探針 5μM/L 0.8 0.2μM/L-572位點錨定探針 5μM/L 1.6 0.4μM/LLightCyclerFastStartDNAMasterplus Hybprobe 4Mix水 5.4模板DNA100ng/L 5 1200ng/μLPCR循環(huán)條件為模板DNA變性1循環(huán)95℃ 10min；溫度變化速率20℃/s；目標DNA擴增35個循環(huán)95℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸9s；溫度變化速率設為從變性到退火20℃/s，從退火到延伸3℃/s，從延伸到變性20℃/s；擴增后進行解鏈分析1個循環(huán)95℃ 0s，40℃ 30s，溫度變化速率為20℃/s，然后以0.2℃/s的速率加熱到95℃；最后以10℃/s的速度將反應混合物冷卻到40℃保持30s。
熒光檢測參數設置為在擴增階段，將熒光通道設為F2/1或F3/F1，在每個退火點同時進行兩通道的熒光檢測；在描繪熔點曲線階段，將熒光通道顯示模式設為F2/1或F3/F1，連續(xù)記錄熒光值。
(4)描繪熔點曲線熔點曲線是以溫度為橫坐標，熒光值的倒數[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]為縱坐標建立起來，分別記錄每一樣品兩個通道的Tm值。如附圖2所示，在-572位點，原生純合型和野生純合型的Tm值分別為(60.67℃-63.83℃，平均值為62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值為54.41℃)；如附圖3所示，在-597位點，原生純合型和雜合型的Tm值分別為(62.02℃-65.25℃，平均值為64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值為55.61℃)。
運用LightCycler5.32解鏈分析軟件進行熔點溫度的檢測，Tm值相同的峰判定為同一種基因型，其步驟為(1)選適當的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手調來確定待檢樣品的熔點Tm值。(2)比較樣品中是否有熔點Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范圍內，可以看成同一個峰。
(5)根據步驟(4)得到的特征性熔點曲線，每一種特征性的熔點曲線對應一種基因型，對照測序結果可知每一待檢樣品的基因型。
(6)對所述的待測樣品的基因型進行測序驗證根據獲得的熔點曲線，在每一種Tm值相同的峰對應的樣本中任選一個樣本進行DNA測序驗證。具體過程為先用普通PCR在基因擴增雜交儀上擴增目的DNA片段，反應體系20μL。
試劑成分濃度加入量(μL)
TakaRa Taq酶 5U/μL 0.110XBuffer緩沖液 Tris-HCL(pH8.3，100mM，2KCL(500mM)，MgCL2(15mM)dNTP 2.5mM 1.6正向引物 10μM/L1正向引物 10μM/L1DNA 50ng/μL 5水 9.3循環(huán)條件模板DNA變性1循環(huán)94℃ 5min；目標DNA擴增35個循環(huán)94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。
PCR結束后，以DL2000(TakaRa)為分子量標尺，取目標DNA擴增液9μL和1μL上樣緩沖液混勻，點入1％瓊脂糖(每100m瓊脂糖凝膠加5μL北京賽百盛基因技術有限公司的GoldView)凝膠加樣孔內，以100V電壓泳動5分鐘，再以50V電壓泳動1小時，取下凝膠，在紫外燈下檢測擴增產物并照相。
將電泳陽性條帶對應的PCR產物18μL送北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序，根據測序結果可獲得不同熔點曲線所對應白介素-6的基因型。由熔點曲線的類型就可以直接判斷對應樣本的基因突變類型，不再需要對以后的PCR產物進行測序。測序結果發(fā)現，中國北方漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-572位點有三種基因型，分別為GG，GC，CC型，如附圖2所示，圖中1為GG型，2為CC型，3為GC型；-597位點有兩種基因型，為GG型和GA型，如附圖3所示，圖中1為GA型，2為GG型。
根據附圖2和附圖3，我們可迅速直觀的判斷樣本的基因型，31個樣本在30分鐘內即可完成檢測過程，并且每一反應都是閉管進行，有效減少了PCR污染的風險。
實施例2 用本發(fā)明所述的方法同時檢測412例中國漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A，-572G/C兩位點的多態(tài)性(1)設計用于擴增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C兩位點的DNA片段的引物正向引物5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；反向引物5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；(2)設計分別用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A，572G/C兩位點的探針，并用不同的熒光素分別標記下述兩對探針，探針設計原理如附圖1所示用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A位點的探針為檢測探針5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基，檢測探針和錨定探針均與目標DNA的編碼鏈相互補；用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)572G/C位點的探針為檢測探針5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；檢測探針在此位點的堿基設為C，檢測探針和錨定探針的堿基序列與目標DNA的模板鏈相互補，檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基；以上所述的兩對探針分別用HPLC純化；(3)PCR擴增，并進行熒光檢測PCR反應體系為試劑成分 濃度加入量(μL) 終濃度(含量)正向引物 10μM/L 0.6 0.6μM/L
反向引物 10μM/L 0.6 0.6μM/L-597位點檢測探針 5μM/L 1.6 0.05μM/L-597位點錨定探針 5μM/L 3.2 0.05μM/L-572位點檢測探針 5μM/L 3.2 0.05μM/L-572位點錨定探針 5μM/L 6.4 0.1μM/LLightCyclerFastStart 3DNAMasterplus HybprobeMix水模板DNA 50ng/μL150ng/μLPCR循環(huán)條件為模板DNA變性1循環(huán)93℃變性15min，溫度變化速率18℃/s；目標DNA擴增45個循環(huán)93℃變性12s，50℃退火7s，70℃延伸11s，溫度變化速率設為從變性到退火18℃/s，從退火到延伸4℃/s，從延伸到變性18℃/s；擴增后進行解鏈分析1個循環(huán)92℃ 1s，38℃ 33s，溫度變化速率為18℃/s，然后以0.5℃/s的速率加熱到85℃；最后以8℃/s的速度將反應混合物冷卻到38℃保持32s。
熒光檢測參數設置為在擴增階段，將熒光通道設為F2/1或F3/F1，在每個退火點同時進行兩通道的熒光檢測；在描繪熔點曲線階段，將熒光通道顯示模式設為F2/1或F3/F1，連續(xù)記錄熒光值。
(4)描繪熔點曲線熔點曲線是以溫度為橫坐標，熒光值的倒數[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]為縱坐標建立起來，分別記錄每一樣品兩個通道的Tm值。在-572位點，原生純合型和野生純合型的Tm值分別為(60.67℃-63.83℃，平均值為62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值為54.41℃)；在-597位點，原生純合型和雜合型的Tm值分別為(62.02℃-65.25℃，平均值為64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值為55.61℃)。
運用LightCycler5.32解鏈分析軟件進行熔點溫度的檢測，Tm值相同的峰判定為同一種基因型，其步驟為(1)選適當的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手調來確定待檢樣品的熔點Tm值。(2)比較樣品中是否有熔點Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范圍內，可以看成同一個峰。
(5)根據步驟(4)得到的特征性熔點曲線，每一種特征性的熔點曲線對應一種基因型，對照測序結果可知每一待檢樣品的基因型。
(6)對所述的待測樣品的基因型進行測序驗證根據獲得的熔點曲線，在每一種Tm值相同的峰對應的樣本中任選一個樣本進行DNA測序驗證。具體過程為先用普通PCR在基因擴增雜交儀上擴增目的DNA片段，反應體系20μL。
試劑成分 濃度加入量(μL)TakaRa Taq酶 5U/μL 0.110XBuffer緩沖液Tris-HCL(pH8.3，100mM， 2KCL(500mM)，MgCL2(15mM)dNTP 2.5mM 1.6正向引物 10μM/L 1正向引物 10μM/L 1DNA150ng/μL 5水 9.3循環(huán)條件模板DNA變性1循環(huán)94℃ 5min；目標DNA擴增35個循環(huán)94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。
PCR結束后，以DL2000(TakaRa)為分子量標尺，取目標DNA擴增液9μL和1μL上樣緩沖液混勻，點入1％瓊脂糖(每100m瓊脂糖凝膠加5μL北京賽百盛基因技術有限公司的GoldView)凝膠加樣孔內，以100V電壓泳動5分鐘，再以50V電壓泳動1小時，取下凝膠，在紫外燈下檢測擴增產物并照相。
將電泳陽性條帶對應的PCR產物18μL送北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序，根據測序結果可獲得不同熔點曲線所對應白介素-6的基因型。由熔點曲線的類型就可以直接判斷對應樣本的基因突變類型，不再需要對以后的PCR產物進行測序。測序結果發(fā)現，中國漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-572位點有三種基因型，分別為GG，GC，CC型；-597位點有兩種基因型，為GG型和GA型。
根據建立的熔點曲線圖，我們可迅速直觀的判斷樣本的基因型，并且每一反應都是閉管進行，有效減少了PCR污染的風險。
實施例3用本發(fā)明所述的方法同時檢測100例中國漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A，572G/C兩位點的多態(tài)性(1)設計用于擴增含白介素-6基因597G/A，572G/C兩位點的DNA片段的引物正向引物5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；反向引物5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；(2)設計分別用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A，572G/C兩位點的探針，并用不同的熒光素分別標記下述兩對探針，探針設計原理如附圖1所示用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)597G/A位點的探針為檢測探針5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；錨定探針5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基，檢測探針和錨定探針均與目標DNA的編碼鏈相互補；用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)572G/C位點的探針為檢測探針5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；
錨定探針5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；檢測探針在此位點的堿基設為C，檢測探針和錨定探針的堿基序列與目標DNA的模板鏈相互補，檢測探針和錨定探針之間相隔兩個堿基；以上所述的兩對探針分別用HPLC純化；(3)PCR擴增，并進行熒光檢測PCR反應體系為試劑成分 濃度 加入量(μL) 終濃度(含量)正向引物 10μM/L 1.2 0.3μM/L反向引物 10μM/L 1.2 0.3μM/L597位點檢測探針5μM/L0.2 0.4μM/L597位點錨定探針5μM/L0.2 0.8μM/L572位點檢測探針5μM/L0.2 0.8μM/L572位點錨定探針5μM/L0.4 1.6μM/LLightCyclerFastStart 6DNAMasterplus HybprobeMix水模板DNA150ng/L 8 1200ng/μLPCR循環(huán)條件為97℃變性8min，溫度變化速率20℃/s；目標DNA擴增30個循環(huán)97℃變性8s，54℃退火3s，74℃延伸7s，溫度變化速率設為從變性到退火20℃/s，從退火到延伸1℃/s，從延伸到變性20℃/s；擴增后進行解鏈分析1個循環(huán)97℃ 0s，45℃ 28s，溫度變化速率為20℃/s，然后以0.1℃/s的速率加熱到95℃；最后以12℃/s的速度將反應混合物冷卻到42℃保持28s。
熒光檢測參數設置為在擴增階段，將熒光通道設為F2/1或F3/F1，在每個退火點同時進行兩通道的熒光檢測；在描繪熔點曲線階段，將熒光通道顯示模式設為F2/1或F3/F1，連續(xù)記錄熒光值。
(4)描繪熔點曲線熔點曲線是以溫度為橫坐標，熒光值的倒數[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]為縱坐標建立起來，分別記錄每一樣品兩個通道的Tm值。在-572位點，原生純合型和野生純合型的Tm值分別為(60.67℃-63.83℃，平均值為62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值為54.41℃)；在-597位點，原生純合型和雜合型的Tm值分別為(62.02℃-65.25℃，平均值為64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值為55.61℃)。
運用LightCycler5.32解鏈分析軟件進行熔點溫度的檢測，Tm值相同的峰判定為同一種基因型，其步驟為(1)選適當的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手調來確定待檢樣品的熔點Tm值。(2)比較樣品中是否有熔點Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范圍內，可以看成同一個峰。
(5)根據步驟(4)得到的特征性熔點曲線，每一種特征性的熔點曲線對應一種基因型，對照測序結果可知每一待檢樣品的基因型。
(6)對所述的待測樣品的基因型進行測序驗證根據獲得的熔點曲線，在每一種Tm值相同的峰對應的樣本中任選一個樣本進行DNA測序驗證。具體過程為先用普通PCR在基因擴增雜交儀上擴增目的DNA片段，反應體系20μL。
試劑成分 濃度加入量(μL)TakaRa Taq酶 5U/μL 0.110XBuffer緩沖液 Tris-HCL(pH8.3，100mM， 2KCL(500mM)，MgCL2(15mM)dNTP 2.5mM 1.6
正向引物 10μM/L1正向引物 10μM/L1DNA 100ng/μL 5水 9.3循環(huán)條件模板DNA變性1循環(huán)94℃ 5min；目標DNA擴增35個循環(huán)94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。
PCR結束后，以DL2000(TakaRa)為分子量標尺，取目標DNA擴增液9μL和1μL上樣緩沖液混勻，點入1％瓊脂糖(每100m瓊脂糖凝膠加5μL北京賽百盛基因技術有限公司的GoldView)凝膠加樣孔內，以100V電壓泳動5分鐘，再以50V電壓泳動1小時，取下凝膠，在紫外燈下檢測擴增產物并照相。
將電泳陽性條帶對應的PCR產物18μL送北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序，根據測序結果可獲得不同熔點曲線所對應白介素-6的基因型。由熔點曲線的類型就可以直接判斷對應樣本的基因突變類型，不再需要對以后的PCR產物進行測序。測序結果發(fā)現，中國漢族人白介素-6基因啟動子區(qū)-572位點有三種基因型，分別為GG，GC，CC型；-597位點有兩種基因型，為GG型和GA型。
根據建立的熔點曲線圖，我們可迅速直觀的判斷樣本的基因型，并且每一反應都是閉管進行，有效減少了PCR污染的風險。
權利要求
1.一種檢測白介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法，它包括下述步驟(1)設計用于擴增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C兩位點的DNA片段的引物正向引物5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；反向引物5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；(2)設計分別用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A，-572G/C兩位點的探針，并用不同的熒光素分別標記所述的兩對探針用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-597G/A位點的探針為檢測探針5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’；錨定探針5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’；用于檢測白介素-6基因啟動子區(qū)-572G/C位點的探針為檢測探針5’-ACAACAGCCCCTCACAGG-3’；錨定探針5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’；(3)PCR擴增，并進行熒光檢測；(4)描繪熔點曲線；(5)根據得到的特征性熔點曲線，判斷待測樣品的基因型；(6)對所述的待測樣品的基因型進行測序驗證。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)中的PCR反應體系為試劑成分 濃度 加入量(μL) 終濃度(含量)正向引物 10μM/L 0.6-1.2 0.3-0.6μM/L反向引物 10μM/L 0.6-1.2 0.3-0.6μM/L-597位點檢測探針 5μM/L 0.2-1.6 0.05-0.4μM/L-597位點錨定探針 5μM/L 0.2-3.2 0.05-0.8μM/L-572位點檢測探針5μM/L 0.2-3.2 0.05-0.8μM/L-572位點錨定探針5μM/L 0.4-6.4 0.1-1.6μM/LLightCyclerFastStart 3-6DNAMasterplus HybprobeMix水模板DNA 50-150ng/μ 1-8 50-1200ng/μLL
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)中的PCR循環(huán)條件為模板DNA變性1循環(huán)93-97℃變性8-15min，溫度變化速率18-20℃/s；目標DNA擴增30-45個循環(huán)93-97℃變性8-12s，50-54℃退火3-7s，70-74℃延伸7-11s，溫度變化速率設為從變性到退火18-20℃/s，從退火到延伸1-4℃/s，從延伸到變性18-20℃/s；擴增后進行解鏈分析1個循環(huán)92-97℃ 0-1s，38-45℃ 28-33s，溫度變化速率為18-20℃/s，然后以0.1-0.5℃/s的速率加熱到85-95℃；最后以8-12℃/s的速度將反應混合物冷卻到38-42℃保持28-32s。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)中的熒光檢測參數設置為在擴增階段，將熒光通道設為F2/1或F3/F1，在每個退火點同時進行兩通道的熒光檢測；在描繪熔點曲線階段，將熒光通道顯示模式設為F2/1或F3/F1，連續(xù)記錄熒光值。
5.根據權利要求1-4之任一項權利要求所述的方法在評價人心血管病易感性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測白介素－6基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點的方法，它運用實時熒光PCR儀結合熔點分析在同一反應體系中實現了同時對白介素－6基因啟動子區(qū)－572G/C，－597G/A兩位點多態(tài)性的檢測。本發(fā)明所述的方法與直接測序的檢測方法相比，操作簡單，成本低廉，結果判斷直觀，反應快速，并且每一反應都是閉管進行，有效減少了PCR污染的風險。
文檔編號C12Q1/68GK1952179SQ20061014046
公開日2007年4月25日 申請日期2006年10月9日 優(yōu)先權日2006年10月9日
發(fā)明者田亞平, 賈興旺, 鄧心新, 汪德清, 董振南 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院