專利名稱：對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因特異的引物以及利用該引物識別鹿茸品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對于赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(C.nippon)、馬鹿(C.canadensis)以及馴鹿(Rangifer tarandus)特異的引物以及利用該引物識別鹿茸品種的方法，尤其涉及，對于梅花鹿、赤鹿、馬鹿以及馴鹿的基因具有特異序列的引物以及通過利用該引物的多重PCR來識別鹿茸品種的方法。
背景技術(shù)：
鹿茸(Cervi Parvum Cornu)是將梅花鹿(Cervus nippon)、赤鹿的亞種(C.elaphus L.)或者馬鹿(C.elaphus canadensis)的未骨化的幼角切割而使之干燥的物質(zhì)，其中包括多種氨基酸、無機物、糖類等(Kim et al.，1973)。
梅花鹿(Cervus nippon)，廣泛分布在東北部(Ohtaishi 1986，Ohtaishiet.Al.1990，Whitehead 1972，White head 1993)，大小比其他鹿稍微小并且體重為80kg、體長為95～180cm、肩高為65～109cm，具有明顯的臀部斑點(Geist 1982)。赤鹿與馬鹿(C.canadensis)雖然外貌相似但可以明顯區(qū)分。北美赤鹿的亞種與歐洲馬鹿大小相似而被稱為北美馬鹿(Alces alces或者moose)，因?qū)Τ嗦蛊鹆俗鳛椴煌贩N的名字的‘馬鹿’而導(dǎo)致了品種名的混淆。從而，北美馬鹿被稱為糜鹿(wapiti)，但糜鹿與歐洲馬鹿在外觀上不能明顯區(qū)分。
麋鹿與歐洲馬鹿在外觀上不易區(qū)分，并且由此得到的鹿茸也不易區(qū)分。由于鹿茸按照產(chǎn)地和部位其價格之差相當(dāng)大，因此為了區(qū)分這兩個而試圖進(jìn)行各種研究，公開了染色體核型分析(karyotyping，F(xiàn)ontana andRubini，1990)、重復(fù)性的DNA分析(Lima-de Faria et al.，1984；Bogenbergeret al.，1987；Scherthan，1991)、線粒體DNA的RFLP分析(Cronin，1992)、線粒體DNA的RNA基因堿基序列分析(Miyamoto et al.，1990)等研究。
由于鹿茸按照產(chǎn)地和部位其價格之差相當(dāng)大并且在形態(tài)上被同定，因此在完整狀態(tài)下能鑒別，但在切片狀態(tài)下由于其形態(tài)極其相似而即使是專家也難以正確地進(jìn)行鑒別。從而，構(gòu)思了不僅識別從麋鹿和歐洲馬鹿切割出來的鹿茸的種類之外還要識別從糜鹿、赤鹿、梅花鹿、狍(roe deer，Capreolus capreolus)等切割出來的鹿茸的種類的各種方法，其中公知利用堿基序列晶體的分類法(Polziehn and Strobeck，1998)、利用12種鹿茸藥材的外部形態(tài)的性質(zhì)形狀鑒別(Daixian et al，1999)、使用微衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellite polymorphism)的變異的方法等(Poetsch et al.，2001)。
在各種方法中利用PCR識別物種的方法是由于過程簡單且正確而最近較常用的方法之一。其中多重(multiplex)PCR以制作對于物種特異的引物而同時分析各個試樣的方法來能夠快速分析并且能夠保證特異性和正確性(Dean et al.，2005)。
線粒體DNA(mt DNA)是實施PCR時適合用作模板的DNA，這是因為，mt DNA的堿基置換率比核DNA(nuclear DNA)高很多而呈現(xiàn)較高多態(tài)性(Upholt and Dawid，1997，Brown et.al.1979)，并且在物種之間以及物種內(nèi)保留很多變異的事實從包括人類的各種哺乳動物已被公開(Potter et.al.1975，Brown et.al.1982，Lansman et.al.1983)，在mtDNA中存在的D-loop因hypervariable region而堿基置換率比其他的mtDNA高于五倍(Aquadro et.al.1983)而在多樣的物種的個體內(nèi)容易觀察遺傳多樣性(Bernatchez et.al.1992，Giuffra et.al.1994，Randi et.al.1994，Richardet.al.1996，Wilkinson et.al.199l，Yang et.al.1994)。
PCR-RFLP(Murray et.al.1995)等作為識別鹿茸的物種的傳統(tǒng)的方法廣泛公知，但是由于需要較長的實驗過程和時間，因此公知利用對于物種特異的探針(probe)的方法(Li et al，2005)、堿基序列范圍分類方法(Polziehan and Strobeck，1998)、microsatellite polymorphism(Poetsch et.al.2001)、RAPD分析法(Hidetoshi et al.，1995，Perez et al.，1998)，但還是認(rèn)為PCR方法是能夠快速且正確地識別鹿茸的具有一致性和可靠性的合適方法。尤其，通過一次PCR能夠確認(rèn)多種物種的多重(multiplex)PCR方法能夠節(jié)省時間和金錢并且能夠提高正確性和特異性，因此作為非常有效的方法備受矚目(Dean et al.，2005)。
在韓國專利1998-0014747中記載了利用多重PCR方法的病原性大腸桿菌檢測方法。
在韓國專利1997-002483中記載了通過利用特定寡核苷酸(oligonucleotide)引物的PCR方法來診斷弧菌感染的方法。
在韓國專利1996-0057885中記載了利用引物擴增判別高麗人參的產(chǎn)地的方法。
如上所述，雖然有很多利用基因特異引物而檢測疾病或者個體的方法，但從來沒有在鹿茸的品種選別上引入的例。
鑒于此，本發(fā)明者們確認(rèn)了通過利用對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿特異的引物的多重PCR方法能夠從鹿茸的混合試樣簡單且正確地區(qū)別鹿茸品種，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因特異結(jié)合的引物。
另外，本發(fā)明的目的在于提供一種利用上述引物識別鹿茸品種的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供與赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因的D-loop特異結(jié)合的引物。
另外，本發(fā)明提供利用上述引物識別鹿茸品種的方法。
以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明提供與赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因特異結(jié)合的引物。
如本發(fā)明，在混合對于多種類型(赤鹿、梅花鹿、馬鹿、馴鹿)基因的引物并同時執(zhí)行一次PCR而選別鹿的物種以及馴鹿的多重PCR反應(yīng)中，設(shè)計引物時與單個PCR的情況相比要求更嚴(yán)格的條件，并且為了結(jié)束反應(yīng)后在凝膠體(gel)上區(qū)別被擴增的基因產(chǎn)物而基因產(chǎn)物的大小需要不同。在反應(yīng)條件的設(shè)定上需設(shè)定對于所有的多對引物的相同的反應(yīng)條件因此條件設(shè)定與單個PCR相比難度高。
本發(fā)明者們?yōu)榱酥谱鳚M足上述條件的引物而進(jìn)行如下過程。
首先，為了在從赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿中分離的所有DNA中擴增線粒體DNA的D-loop區(qū)進(jìn)行堿基序列分析，利用了Polziehn et al.(1998)中公開的CST2引物(序列號1)，CST39引物(序列號2)。
利用上述引物對D-loop整體進(jìn)行擴增的結(jié)果取得與赤鹿(1134bp)、梅花鹿(1228bp)、馬鹿(1209bp)以及馴鹿(1142bp)的每一個的D-loop對應(yīng)的PCR產(chǎn)物。對現(xiàn)有的已登記的鹿種類的D-loop堿基序列(htt//www.ncbi.nlm.nih.gov)與在本研究中分離的上述D-loop區(qū)的鹿茸堿基序列進(jìn)行比較而確認(rèn)被使用的堿基序列的正確性的結(jié)果，呈現(xiàn)95％以上的相似性，從而確認(rèn)了在本發(fā)明中用PCR擴增的D-loop為各物種的D-loop堿基序列(參照圖1和圖2)。
由于確定了各物種的標(biāo)準(zhǔn)D-loop堿基序列，因此基于該堿基序列制作了在將要用于選別物種的PCR上使用的引物。正向引物是作為赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的D-loop的共同堿基序列在以序列號15記載了堿基序列內(nèi)被選擇的18至32mer的引物，優(yōu)選正向引物是以序列號4記載的引物。反向引物由物種特異堿基序列部分制作，對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿特異的反向引物，分別是以序列號16記載的堿基序列的互補序列內(nèi)被選擇的18至32mer的反向引物、以序列號17記載的堿基序列的互補序列內(nèi)被選擇的18至32mer的反向引物、以序列號18記載的堿基序列的互補序列內(nèi)被選擇的18至20mer的反向引物以及以序列號19記載的堿基序列的互補序列內(nèi)被選擇的18至23mer的反向引物，作為優(yōu)選，分別是以序列號5、6、7以及8記載的引物。赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的反向引物分別稱為RED、NIP、ELK以及REIN。馴鹿作為白尾巴鹿亞科(Odocoilinae)的哺乳類，與梅花鹿、赤鹿以及馴鹿完全不同的物種(Geist 1982)，但馴鹿(Rangiger tarnadus)的角有時非法流通，因此為了識別鹿茸的物種與馴鹿而制作了對馴鹿特異的引物。作為內(nèi)對照制作了從線粒體DNA的細(xì)胞色素b(Cytochrome b)基因得到一定的489bp擴增產(chǎn)物的L14724引物和H14149引物。
對于各鹿的物種的DNA利用通過上述方式制作的引物執(zhí)行PCR的結(jié)果，與預(yù)料的一樣，對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿分別能夠確認(rèn)199bp、300bp、245bp以及375bp的PCR產(chǎn)物。相反，對于小白鼠、老鼠、貓、牛、狗以及人只能確認(rèn)489bp(細(xì)胞色素b)擴增產(chǎn)物，由此確認(rèn)了只有在鹿茸上預(yù)料到的帶(band)(參照圖3)。從而，確認(rèn)了本發(fā)明的引物是對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的線粒體基因的D-loop特異的引物。
另外，本發(fā)明提供由如下步驟構(gòu)成的鹿茸品種識別方法，該識別方法的步驟包括1)從對象體提取DNA的步驟；2)執(zhí)行多重PCR的步驟，將上述DNA為模板使用對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因的D-loop的共同引物和每一個物種的特異引物擴增對各物種特異的基因；3)實施電泳的步驟；和4)確認(rèn)PCR產(chǎn)物的步驟。
本發(fā)明者們試圖確認(rèn)在混合試樣中利用本發(fā)明的引物是否也能識別鹿的物種。首先將各個品種的整體DNA以1∶1混合后，在其中混合了對于D-loop具有共同性的正向引物、對于赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的每一個特異的反向引物以及用于擴增作為內(nèi)對照的細(xì)胞色素的引物對而實施多重PCR。其結(jié)果，即使同時使用多個引物，也依然可以互不相干地可同時識別在混合兩種到四種的鹿茸試樣的狀態(tài)下的擴增產(chǎn)物(參照圖5)。
為了在實際流通的干燥鹿茸中確認(rèn)物種識別的可能性，將市場上的鹿茸為對象提取DNA后用本發(fā)明地引物實施多重PCR。其結(jié)果，確認(rèn)了在混合多種鹿茸的試樣中也可以互不相干地正確地檢測出鹿茸品種的特異產(chǎn)物(參照圖6)。從而，確認(rèn)了以利用本發(fā)明的多重PCR在混合試樣中也可以正確地識別鹿茸的品種。
另外，本發(fā)明提供包括與赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的基因特異結(jié)合的引物以及線粒體基因的D-loop共同結(jié)合的引物的鹿茸品種識別用多重工具(Kit)。
上述工具可以附加包括轉(zhuǎn)錄(transcription)、擴增以及生成物檢測用的試劑和對該試劑的指示事項。例如，上述工具能夠包含轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核苷酸(Deoxynucleotide)、適用于DNA擴增反應(yīng)的熱穩(wěn)定性聚合酶和核酸的標(biāo)簽化(tagging)以及檢測用試劑。
上述工具從鹿茸試樣中能夠同時檢測出四種鹿茸品種，因此以少量試樣在短時間內(nèi)能夠知道鹿茸的品種以及真?zhèn)巍?br>

圖1是表示將赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的線粒體基因的D-loop為模板(template)實施PCR的結(jié)果的圖，其中1-Cervus elaphus(RED)；2-C.nippon(NIP)；3-C.elaphus canadensis(ELK)；4-Rangifer tarandus(REIN)；L-100bp梯形帶。
圖2是表示對按照各物種擴增的D-loop區(qū)進(jìn)行多重排列(multiplealignment)以及物種的特異設(shè)計的引物的圖，其中A是正向引物(FOR)、B是RED引物、C是ELK引物、D是SIKA引物、E是REIN引物。
圖3是利用物種的特異引物將各物種的線粒體基因的D-loop為模板實施PCR的結(jié)果的圖，其中1-Cervus elaphus；2-Cervus Nippon；3-Cervus elaphus Canadensis；4-Rangifer tarandus；5-小白鼠；6-老鼠；7-貓；8-牛；9-狗；10-人；11-陰性對照(Negative control)；L-100bp梯形帶(ladder)。
圖4是在利用物種的特異引物將各物種的線粒體D-loop為模板實施PCR的情況下表示PCR擴增靈敏度的圖，其中A-RED；B-NIP；C-ELK；D-REIN；1-1ng；2-500pg；3-100pg；4-50pg；5-10pg；6-5pg；7-1pg；8-0.5pg；L-100bp梯形帶。
圖5是表示在對混合了各鹿種的DNA的試樣以特異引物實施多重PCR(Multiplex-PCR)的情況下，比較擴增產(chǎn)物的圖案的結(jié)果的圖，其中1-Cervus elaphus∶Cervus nippon＝1∶1；2-Cervus elaphus∶Cervus canadensis.＝1∶1；3-Cervus elaphus∶Rangifer tarnadus＝1∶1；4-Cervus nippon∶Cervus canadensis＝1∶1；5-Cervus nippon∶Rangifer tarnadus＝1∶1；6-Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1；7-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Cervus canadensis＝1∶1∶1；8-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；9-Cervus elaphus∶Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；10-Cervus nippon∶Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；
11-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Cervus canadensis∶Rangifertarnadus＝1∶1∶1∶1；L-100bp梯形帶。
圖6是在對混合了各鹿種和馴鹿的DNA的試樣以特異引物實施多重PCR的情況下，比較擴增產(chǎn)物的圖案的結(jié)果的圖，其中A-Cervus elaphus(a)∶Rangifer tarnadus(b)；B-Cervus nippon(a)∶Rangifer tarnadus(b)；C-Cervus elaphus canadensis(a)∶Rangifer tarnadus(b)；1-a∶b＝1∶14；2-a∶b＝1∶9；3-a∶b＝3∶7；4-a∶b＝5∶5；5-a∶b＝7∶3；6-a∶b＝9∶1；7-a∶b＝14∶1；L-100bp梯形帶。
圖7是表示對在市場中流通的鹿茸試樣以特異引物實施多重PCR的結(jié)果的圖，其中1-韓國(ELK)；2-新西蘭；3-俄羅斯；4-韓國(進(jìn)口1)；5-韓國(進(jìn)口2)；6-中國；7-新西蘭；8-俄羅斯；9-加拿大；10-中國；11-中國；12-馴鹿(Rangifer tarandus)；13-陰性對照(D.W)；L-100bp梯形帶。
具體實施例方式
以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明。
但是，下述實施例僅僅例示本發(fā)明，而本發(fā)明并不限定于下述實施例。
(實施例1)準(zhǔn)備鹿茸試樣作為鹿茸的標(biāo)準(zhǔn)試樣采用了在首爾大公園飼養(yǎng)的赤鹿、梅花鹿、馬鹿、馴鹿的血液以及組織，作為其他血液購買了在國內(nèi)個人農(nóng)場中飼養(yǎng)的赤鹿、梅花鹿、馬鹿的血液和在國內(nèi)流通的干燥鹿茸而使用于實驗上。利用QIAamp DNA microkit(QIAGEN Germany)按照使用者指示提取出從鹿茸的血液或者組織中分離的全部DNA。
(實施例2)確認(rèn)鹿茸的D-loop部分堿基序列以及確定標(biāo)準(zhǔn)D-loop堿基序列為了擴增赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(Cervus nippon)、馬鹿(Cervuselaphus canadensis)以及馴鹿(Rangiger tarandus)的線粒體DNA(mtDNA)的D-loop區(qū)進(jìn)行堿基序列分析，使用了三種引物。以序列號1、2記載的CST2引物和CST39引物是采用了在Polziehn et al.(1998)中公布的引物，由于以序列號3記載的SeqR引物不能通過一次實驗對整個D-loop進(jìn)行堿基序列分析，因此基于以CST39引物進(jìn)行堿基序列分析的結(jié)果進(jìn)行重新合成，并且以此來完成剩余的堿基序列分析從而取得全部堿基序列。
D-loop區(qū)的堿基序列分析用Perkin-Elmer DNA terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit，DNA擴增器(GeneAmp PCR System 9700，Applied biosystems)以及BI 310 genetic analyser(Applied biosystems)來執(zhí)行。
用赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的血液以及組織、CST2和CST39引物來擴增所有D-loop(圖1)。PCR反應(yīng)條件為，用DNA聚合酶(TaqGold Polymerase，Applied biosystems)在95℃下使上述的一對引物和模板變性12分鐘，在94℃下1分鐘內(nèi)反應(yīng)30次、在52℃下1分鐘內(nèi)反應(yīng)30次以及在72℃下一分鐘內(nèi)反應(yīng)30次，在72℃下延長(extension)7分鐘后結(jié)束反應(yīng)。
排列與各個種類對應(yīng)的擴增產(chǎn)物的1134bp、1288bp、1209bp以及1142bp大小的擴增產(chǎn)物而確定D-loop標(biāo)準(zhǔn)堿基序列(圖2)。
堿基序列比較分析使用了ClustalW(ver.1.75，Thompson et.al.，1994)，并且利用以序列號9和10記載的L14724引物和H15149引物。為了制作對鹿茸品種特異的引物，比較現(xiàn)有登記的鹿種類的D-loop堿基序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)與在本研究中分離的D-loop區(qū)的鹿茸堿基序列而確認(rèn)被使用的堿基序列的正確性。赤鹿的D-loop堿基序列與genbank(AF016973)呈現(xiàn)98％相似性，梅花鹿的D-loop堿基序列與genbank(AF016965)呈現(xiàn)95％相似性，馴鹿亞種(Rangifer tarandusgroenlandicus，AF096413)與在本實驗中分離出的堿基序列呈現(xiàn)99％相似性而被認(rèn)定為馴鹿。還有，由于馬鹿的堿基序列未登記在genbank，因此與從飼養(yǎng)在首爾大公園中的馬鹿的血液和飼養(yǎng)在國內(nèi)農(nóng)場中的馬鹿的血液中分離出的D-loop區(qū)的堿基序列進(jìn)行比較時呈現(xiàn)99％的相似性，從而將該堿基序列確定為馬鹿的堿基序列。
(實施例3)制作以及確認(rèn)特異的引物確定赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿的標(biāo)準(zhǔn)D-loop堿基序列之后，作為正向引物使用了FOR引物(sense；Tm value 58℃)(序列號4)，作為反向引物制作了與赤鹿、梅花鹿、馬鹿以及馴鹿特異地反應(yīng)的引物(序列號5至8)，各引物稱為RED(Tmvalue 53℃)、NIP(Tm value 53℃)、ELK(Tm value 53℃)、REIN(Tm value 54℃)。為了制作引物而利用http//www.bioneer.co.kr/tools網(wǎng)站。
為了得到鹿茸的物種的特異D-loop mtDNA切片，將2pmole的FOR、RED、NIP、ELK、REIN引物和作為內(nèi)對照的40pmole的L14724(Masudaet.al.，1996)引物、10X reaction buffer(Applied biosystems，U.S.A.)、1.5mMMgCl2、0.2mM dNTP Mixture、1.25unit的AmpliTaq Gold polymerase(Applied biosystems，U.S.A.)還有1ng的DNA添加到25μl反應(yīng)液中。
DNA擴增利用GeneAmp PCR System 9700(Applied biosystems)在95℃下進(jìn)行12分鐘的前期處理之后，將在94℃下進(jìn)行的30秒的denaturation、在55℃下進(jìn)行的30秒的annealing、在72℃下進(jìn)行的30秒的extension的溫度變異過程重復(fù)進(jìn)行30次，最終在72℃下進(jìn)行7分鐘的extension。在包含0.5μg/Ml EtBr的2％agarose gel(Amresco)中利用0.5XTBE buffer(45mM Tris-borate and 1mM EDTA，pH8.0)對5μl的擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳而在UV transilluminator上確認(rèn)擴增結(jié)果。
用上述引物實施PCR的結(jié)果，與預(yù)料中的結(jié)果一樣對于赤鹿能夠確認(rèn)489bp和199bp的擴增產(chǎn)物、對于梅花鹿能夠確認(rèn)489bp和300bp的擴增產(chǎn)物、對于馬鹿能夠確認(rèn)489bp和245bp的擴增產(chǎn)物、以及對于馴鹿能夠確認(rèn)489bp和375bp的擴增產(chǎn)物，對于小白鼠、老鼠、貓、牛以及人只能構(gòu)確認(rèn)由細(xì)胞色素b生成的489bp的擴增產(chǎn)物，由此確認(rèn)了只有對于鹿茸可預(yù)料到的帶(圖3)。從而能夠確認(rèn)本發(fā)明的引物對鹿茸的特異性。
從上述結(jié)果與現(xiàn)有的僅識別一個種類的其他實驗不同能夠同時識別四個品種的這一點出發(fā)，認(rèn)為若利用RED、NIP、ELK、REIN的引物則在時間上、經(jīng)濟上比以往的結(jié)果((Gao et.al.2004，Dean et.al.2005，Wan &Fang 2003)更有用。
(實施例4)確認(rèn)利用物種的特異引物的多重(multiplex)PCR的靈敏度利用作為物種識別引物的RED、NIP、ELK以及REIN通過多重PCR進(jìn)行有效檢測濃度實驗。標(biāo)準(zhǔn)鹿品種的DNA濃度調(diào)整為1ng、500pg、100pg、50pg、10pg、5pg、1pg、0.5pg后執(zhí)行PCR的結(jié)果，能夠確認(rèn)對于四個品種可確認(rèn)的最小濃度(圖4)。在赤鹿的情況下(A.RED)，由物種特異引物可擴增的濃度為5pg，但內(nèi)對照可確認(rèn)到50pg為止，從而可進(jìn)行物種識別的所有DNA的最小濃度為50pg。在梅花鹿的情況下(B.NIP)，物種特異引物和內(nèi)對照可進(jìn)行物種識別的所有DNA的最小濃度均為5pg。在馬鹿的情況下(C.ELK)，由物種特異引物可擴增的濃度為10pg，但內(nèi)對照可確認(rèn)到50pg為止，從而可進(jìn)行物種識別的所有DNA的最小濃度為50pg。在馴鹿的情況下(D.REIN)的情況下，所有的物種特異引物和內(nèi)對照可進(jìn)行物種識別的所有DNA的最小濃度均為5pg。綜合以上結(jié)果，可知在鹿茸的物種識別上只要存在至少50pg以上的所有DNA就可以識別物種。
(實施例5)利用多重PCR在混合試樣中分類鹿茸品種確認(rèn)了本實驗在混合試樣中是否能夠識別物種。首先將各個品種的3ng的所有DNA以1∶1混合而將1ng的所有DNA使用于實驗上，其結(jié)果內(nèi)對照(489bp)的擴增不受影響，即使同時使用多個引物也可以互不相干同時識別在混合兩種到四種鹿茸的狀態(tài)下的擴增產(chǎn)物(圖5)。
還有，馴鹿的角是與鹿茸完全不同的品種因此不能用于鹿茸的藥材，但實際上像鹿茸一樣流通的事例比較多，因此為了確認(rèn)在切片鹿茸狀態(tài)下是否能區(qū)分，確認(rèn)了被混合的馴鹿的最小檢測濃度。從而，確認(rèn)了在赤鹿和馴鹿、梅花鹿和馴鹿以及馬鹿和馴鹿等混合著馴鹿的情況下的檢測可能性。將最終DNA濃度調(diào)整為1ng/ul之后以多種濃度來混合時，在混合赤鹿和馴鹿的情況下，大約混合30％為止的馴鹿時能夠確認(rèn)到馴鹿的混合，在混合梅花鹿和馴鹿的情況下，大約混合10％為止的馴鹿時能夠確認(rèn)到馴鹿的混合。還有，在混合馬鹿和馴鹿的情況下，大約混合7％為止的馴鹿時能夠確認(rèn)到馴鹿的混合(圖6)。從而，確認(rèn)了至少被混合另一品種的30％以上時可進(jìn)行被混合的物種識別。
(實施例6)對于流通鹿茸的多重PCR的實際應(yīng)用為了對于實際流通的干燥鹿茸確認(rèn)物種識別的可能性，將市場中的鹿茸為對象提取DNA后將1ng的DNA使用于物種識別(圖6)。其結(jié)果，對于國產(chǎn)馬鹿(圖7、線1)、俄羅斯產(chǎn)(圖7、線3)、作為援用在市場中銷售的俄羅斯產(chǎn)(圖7、線8)以及加拿大產(chǎn)(馬鹿、圖7、線9)的流通鹿茸，確認(rèn)了489bp和245bp的擴增產(chǎn)物而被確認(rèn)為馬鹿的鹿茸，對于新西蘭產(chǎn)的2種(圖7、線2和線7)、國內(nèi)進(jìn)口鹿茸(中醫(yī)協(xié)會、圖7、線4)以及國內(nèi)進(jìn)口鹿茸(中醫(yī)流通、圖7、線5)的流通鹿茸，確認(rèn)了489bp和199bp的PCR擴增產(chǎn)物而被確認(rèn)為赤鹿的鹿茸。在進(jìn)口馴鹿情況下，確認(rèn)了489bp和375bp的PCR擴增產(chǎn)物，在中國產(chǎn)三品種(圖7、線6、10、11)的情況下，只確認(rèn)到作為489bp的PCR擴增產(chǎn)物的內(nèi)對照的擴增產(chǎn)物，因此被確認(rèn)為不是馴鹿。從而，確認(rèn)了以利用本發(fā)明的引物的多重PCR方法能夠選別在市場上流通的鹿茸的品種。
(發(fā)明效果)如上所述，本發(fā)明的對于梅花鹿、赤鹿、馬鹿以及馴鹿特異的引物和利用上述引物識別鹿茸品種的方法為，通過利用對于各個物種特異的引物的多重PCR方法，以一次PCR能夠同時得到對于鹿茸品種特異的擴增產(chǎn)物，并且能夠快速且正確地特異反應(yīng)的新方法，因此能夠利用于與現(xiàn)有的使用一種引物對的PCR方法相比更有效地判別鹿茸的品種方面。
5P-05-05<110>Korea Institute of Oriental Medicine<120>The primers specific to Cervus elaphus，C.nippon，C.canadensisand Rangifer tarandus gene and the method to identify CerviParvum Cornu species<160>19<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>CST2 primer<400>1taatatactg gtcttgtaaa cc 22<210>2<211>24<212>DNA<213>CST39 primer<400>2gggtcggaag gctgggacca aacc 24<210>3<211>20<212>DNA<213>SeqR primer<400>3atgtcctgtg accattgact20<210>4<211>21<212>DNA<213>FOR primer<400>4ccctaagact caaggaagaa g 21<210>5<211>20<212>DNA<213>RED<400>5gtggttggtg gatgtaaaat20<210>6<211>20<212>DNA<213>NIP<400>6tatcttacgc accggtttat20<210>7<211>20<212>DNA<213>ELK<400>7ttttatgtac tacgagcgca20<210>8<211>21
5P-05-05<212>DNA<213>REIN<400>8gtgccatgta cgatcaataa t 21<210>9<211>28<212>DNA<213>L14724<400>9cgaagcttga tatgaaaaac catcgttg 28<210>10<211>35<212>DNA<213>H15149<400>10aaactgcagc ccctcagaaa tgatatttgt cctca 35<210>11<211>199<212>DNA<213>C.elaphus<400>11ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ccctgatgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaagtttt aatatttcaa tacagctttc cactcaacac ccattttaca180ttttacatcc accaaccac 199<210>12<211>299<212>DNA<213>C.nippon<400>12ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ctctgacgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaaatttt aatattttaa tacagttttc tactcaacac ccaatttaca180tttatgtcct actaattaca caacaaaaca cgtgatataa ccttatgcac ttgtagcaca240taaaattaat gcgttaagac ataccatgta caacagcaca taaaccggtg cgtaagata 299<210>13<211>245<212>DNA<213>C.e.canadensis<400>13ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ccctgacgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaaattta atattttaat acagctttct actcaacatc caatttacat180tttatgtcct actaattaca cagcaaaaca cgtgatataa ccttatgcgc tcgtagtaca240taaaa245<210>14
5P-05-05<211>375<212>DNA<213>R.tarandus<400>14ccctaagact caaggaagaa gctatagccc cactatcaac acccaaagct gaegttctaa 60traaactatt ccctggcgta tattaatata gctccacaaa attcaagagc cttgtcagta120ttaaatttct aaaaaccttc aagaatttaa tacagttctg cactcaatag ccatattata180tattaaatat cattaactac ataaatattt tataaacgta catatatggt cctgtacggc240tatagtacat aaaattaatg tattaagaca tattatgtat aatagtacat taaattatat300gccccatgct tataagcaag tacttgacat tatttacagt acatagtaca taatattatt360gatcgtacat ggcac 375<210>15<211>80<212>DNA<213>conserved sequence<400>15acctccctaa gactcaagga agaagccata gccccactat caacacccaa agctgaagtt60ctatttaaac tattctctga80<210>16<211>49<212>DNA<213>C.elapnus primer region<400>16tacattttac atccaccaac cacacaacaa aatatgtaat aaaacctta49<210>17<211>77<212>DNA<213>C.nippon primer region<400>17atgtacaaca gcacataaac cggtgcgtaa gatacattat gcatgatagt acataaatta60atgtattagg acatact 77<210>18<211>20<212>DNA<213>C.e.canadensis primer region<400>18tgcgctcgta gtacataaaa20<210>19<211>23<212>DNA<213>R.tarandus primer region<400>19atattattga tcgtacatgg cac2權(quán)利要求
1.一種反向引物，與赤鹿(Cervus elaphus)的線粒體基因的D-loop特異結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反向引物，其特征在于，所述引物是在以序列號16記載的堿基序列的互補序列內(nèi)選擇的18至32mer的反向引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列號5記載的堿基序列。
4.一種引物，與梅花鹿(C.nippon)的線粒體基因的D-loop特異結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列號17記載的堿基序列的互補序列內(nèi)選擇的18至32mer的反向引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列號6記載的堿基序列。
7.一種引物，與馬鹿(C.canadensis)的線粒體基因的D-loop特異結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列號18記載的堿基序列的互補序列內(nèi)選擇的18至20mer的反向引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列號7記載的堿基序列。
10.一種引物，與馴鹿(Rangifer tarandus)的線粒體基因的D-loop特異結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列號19記載的堿基序列的互補序列內(nèi)被選擇的18至23mer的反向引物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列號8記載的堿基序列。
13.一種正向引物，與梅花鹿、赤鹿、馬鹿以及馴鹿的線粒體基因的D-loop共同結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的正向引物，其特征在于，所述引物是在以序列號15記載的堿基序列內(nèi)選擇的18至32mer的正向引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的正向引物，其特征在于，所述引物具有以序列號4記載的堿基序列。
16.一種鹿茸品種的識別方法，包括1)從對象體提取DNA的步驟；2)執(zhí)行多重PCR的步驟，將在步驟1)提取的DNA為模板使用權(quán)利要求13所述的引物和權(quán)利要求1、4、7以及10所述的引物，擴增對赤鹿、梅花鹿、馬鹿或者馴鹿特異的基因；3)實施電泳的步驟；和4)確認(rèn)PCR產(chǎn)物的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的鹿茸品種的識別方法，其特征在于，步驟2)的赤鹿特異的基因以序列號11記載。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的鹿茸品種的識別方法，其特征在于，步驟2)的梅花鹿特異的基因以序列號12記載。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的鹿茸品種的識別方法，其特征在于，步驟2)的馬鹿特異的基因以序列號13記載。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的鹿茸品種的識別方法，其特征在于，步驟2)的馴鹿特異的基因以序列號14記載。
21.一種鹿茸品種識別用多重工具，包含權(quán)利要求1、4、7、以及13所述的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及對于赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(C.nippon)、馬鹿(C.canadensis)以及馴鹿(Rangifer tarandus)特異的引物以及使用該引物識別鹿茸品種的方法，尤其涉及，對于梅花鹿、赤鹿、馬鹿以及馴鹿的基因具有特異序列的各個引物以及通過利用該引物的多重聚合酶連鎖反應(yīng)(multiplex－PCR)來識別鹿茸的品種的方法。本發(fā)明的引物以及利用該引物的鹿茸識別方法正確地鑒別在切片狀態(tài)下不易鑒別的鹿茸而能夠有效利用于防止非鹿茸的其他動物的角的非法流通。
文檔編號C12N15/11GK1932041SQ200610141919
公開日2007年3月21日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者高柄燮, 吳承恩, 李美英, 金應(yīng)秀, 金令和 申請人:韓國韓醫(yī)學(xué)研究院