專利名稱：一種篩選cd18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選優(yōu)良種牛的方法及其專用引物，特別是涉及一種利用牛CD18基因的單核苷酸多態(tài)性篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
牛白細(xì)胞黏附缺陷癥(bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD)是一種常染色體上由單基因控制的隱性遺傳疾病，是由編碼嗜中性粒細(xì)胞表面糖蛋白的CD18基因的一個點突變引起的(Shuster，D.E.，Bosworth，B.T.，Kehrli，M.E.Jr.Sequenceof the bovine CD18-encoding cDNAcomparison with the human and murineglycoproteins.Gene.1992，114(2)267-271.)。CD18基因已經(jīng)被定位在1號染色體上。Shuster等對1頭患BLAD的荷斯坦牛的CD18基因進行了序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自5’端第383位堿基由A突變?yōu)镚，該突變是錯義突變，導(dǎo)致128位的天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?D128G)，致使白細(xì)胞表面的β2整合素表達(dá)明顯減少或缺乏而引起臨床發(fā)病。BLAD臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的重復(fù)性感染、膿液形成減弱、傷口愈合延遲和白細(xì)胞增多，也表現(xiàn)在犢牛初生重低和發(fā)育不良(Muller KE，Bernadina WE，Kalsbeek HC，et al.Bovine leukocyte adhesion deficiency--clinical course andlaboratory findings in eight affected animals.Vet Q.1994，16(2)65-71；Gerardi AS.Bovine leucocyte adhesion deficiencya review of a modern diseaseand its implications.Res Vet Sci.1996，61(3)183-186.)。BLAD的生理基礎(chǔ)是白細(xì)胞粘附及相關(guān)功能(包括吞噬和趨化作用)的缺陷。BLAD多發(fā)生于1-14月齡的荷斯坦奶牛，當(dāng)隱性突變基因CD18純合時奶牛表現(xiàn)為發(fā)病，當(dāng)隱性突變基因雜合時奶牛表現(xiàn)為正常，但該牛是BLAD的攜帶者。Janosa等研究發(fā)現(xiàn)，BLAD還對奶牛的產(chǎn)奶量產(chǎn)生負(fù)面影響(Janosa A，Baranyai B，Dohy J.Comparison of milk productionof the progeny of BLAD-carrier and healthy Holstein bull s in Hungary.ActaVet Hung.1999；47(3)283-289)。
目前，BLAD遺傳缺陷的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起了世界各國奶牛育種協(xié)會和育種工作者的重視，在美國、日本、丹麥和荷蘭等國家相繼報道了在荷斯坦牛群中存在BLAD有害基因(Olchowy TW，Bochsler PN，Nei lsen NR，et at.Bovine leukocyte adhesiondeficiencyin vitro assessment of neutrophil function and leukocyteintegrin expression.Can J Vet Res.1994，58(2)127-33；Bernadina WE，DuitsAJ，Kalsbeek HC，et at.Leukocyte adhesion deficiency in a Dutch Holsteincalfa case with a clear-cut family history.Vet Immunol Immunopathol.1993，37(3-4)295-308.)。隨后美國、加拿大和歐洲一些國家大量的基因檢測和系譜分析發(fā)現(xiàn)，世界非常著名的公牛通常攜帶該隱性突變基因，如Hawkeye bull(CANM369995)就是BLAD的攜帶者。一頭優(yōu)秀種公牛一生可以生產(chǎn)幾十萬劑甚至上百萬劑的冷凍精液，由于冷凍精液和人工授精技術(shù)的普及和廣泛應(yīng)用，優(yōu)秀種公牛的遺傳影響是顯而易見的。由此可見，荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)的BLAD遺傳缺陷帶來的是世界性問題，這導(dǎo)致近年來奶牛育種工作者在重視優(yōu)秀種公牛生產(chǎn)性能表現(xiàn)的同時，更加重視優(yōu)秀種公牛是否攜帶隱性有害基因。
通過基因檢測和分子選育技術(shù)，可以在分子水平上解決奶牛的遺傳改良問題。一方面，通過基因檢測技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)種公?；蚍N子母牛攜帶隱性有害基因的情況，并加以選擇剔除，避免了通過人工授精技術(shù)傳播遺傳缺陷基因的風(fēng)險；另一方面，通過遺傳標(biāo)記基因或候選基因可以對數(shù)量性狀基因(QTL)進行定位分析，從而實現(xiàn)對后備種公牛的早期選擇，可以縮短奶牛世代間隔，加快遺傳改良的速度。歐美等奶業(yè)發(fā)達(dá)國家已將分子選育技術(shù)應(yīng)用于小公牛的選育和淘汰中。據(jù)有關(guān)專家預(yù)測，隨著奶牛和其它主要家畜品種質(zhì)量和數(shù)量性狀基因圖譜的完成及分子選育技術(shù)的滲入，整個育種體系將發(fā)生革命性改變。
近幾年，在美國、加拿大和日本等國家相應(yīng)建立了種公牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法和育種方案，并在種公牛系譜上明確標(biāo)注了隱性基因的攜帶情況，從而可合理的指導(dǎo)種公牛的選種選配，有效地降低了隱性有害基因CVM的不良影響。目前，BLAD有害基因的分子檢測方法主要是PCR-RFLP法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)(Mukhopadhyaya PN，Mehta HH，RathodRN.A method for the simulation of normal，carrier and affected controls forPCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle.Mol Cell Probes.2000，14(6)381-384；Norouzy A，Nassiry MR，Eftekhari Shahrody F.Identificationof bovine leucocyte adhesion deficiency(BLAD)carriers in Holstein and BrownSwiss AI bulls in Iran.Genetika.2005.41(12)1697-1701.)，但是，PCR-RFLP法要求建立陽性對照才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且成本較高，不適合規(guī)?；瘷z測。因此，迫切需要一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟的BLAD有害基因的分子檢測方法。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP檢測方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。具體采用哪一種方法，需要結(jié)合靶序列的特點和實驗條件來確定。
日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同，因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。將SSCP用于檢測PCR擴增產(chǎn)物的基因突變而建立的PCR-SSCP技術(shù)，進一步提高了基因突變檢測方法的便捷性和靈敏性。
PCR-SSCP技術(shù)(Orita M，Iwahana H，Kanazawa H.Detection of polymorphismsof human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformationalpolymorphisms.Proc Natl Acad Sci.1989，862766-2770.；Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.A rapid and sensitive detetion of point mutation and geneticpolymorphism using polymerase chain reaction.Genomics.1989，5874-879.)是檢測DNA突變最為直觀而精確的實驗技術(shù)手段之一，該方法對長度在100-300bp之間的DNA片段突變檢測的靈敏度可達(dá)100％，結(jié)合序列分析，可做到對大批量樣品的目的DNA片段的“全掃描”分析，不僅成本低，而且自動化程度較高，因此，在進行基因診斷和多態(tài)性分析，包括單核苷酸多態(tài)(SNP)的檢測中，PCR-SSCP技術(shù)不失為一種準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用牛CD18基因的單核苷酸多態(tài)性篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物。
本發(fā)明所提供的用于篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。
將由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對命名為BLF/BLR，序列表中的序列1由20個堿基組成，序列表中的序列2由21個堿基組成。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法。
本發(fā)明所提供的篩選優(yōu)良種牛的方法，是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿基為A的種牛為CD18基因正常的優(yōu)良種牛；所述N為A和G的雜合體。
所述待測牛的基因組DNA的來源是廣泛的，可以從血液(新鮮或冷凍)、精液(新鮮或冷凍)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品中提取。
如果PCR擴增片段自5’端第32位堿基為A，即CD18基因第二外顯子自5’端第55位堿基為A時，其純合體的基因型命名為AA；如果PCR擴增片段自5’端第32位堿基為G，即CD18基因第二外顯子自5’端第55位堿基為G時，其純合體的基因型命名為BB；它們的雜合體基因型命名為AB。
基因型為AA的牛為CD18基因正常的優(yōu)良種牛；基因型為BB的牛為BLAD患者，根據(jù)牛的表型就能辨別，不需要專門設(shè)備和技術(shù)來檢測；基因型為AB的牛為攜帶隱性有害突變CD18基因的牛，即BLAD攜帶者。
其中，以25μl總體積為例，PCR擴增的反應(yīng)體系包括模板DNA 40ng，Taq酶1.5U，20pmol/L上、下游引物各0.5μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，10×PCR緩沖液2.5μl，用重蒸水補充反應(yīng)體系至25μl。10×PCR緩沖液的組成是Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
所述檢測擴增產(chǎn)物的方法可為對擴增產(chǎn)物進行14％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。具體方法可為取1.5μl擴增產(chǎn)物，加入6μl上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，10％甘油，0.025％溴酚藍(lán)和0.025二甲苯青)，98℃變性10min后，立即放入冰水混合物中冷卻，點樣，用14％非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在2種不同基因型AA型和AB型，基因分型結(jié)果如附圖4所示。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，AA基因型牛的CD18基因第2外顯子(exon2)第55位堿基為A，該基因型屬正常牛只，在國際上統(tǒng)一采用“TL”標(biāo)識；而AB基因型牛的CD18基因第2外顯子第55位堿基為N，該基因型的牛是BLAD攜帶者，在國際上統(tǒng)一采用“BL”標(biāo)識。
本發(fā)明提供了一種篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物。該方法利用CD18基因第二個外顯子自5’端第55位堿基的多態(tài)性，并根據(jù)基因型對種牛進行篩選，剔除不利等位基因。本發(fā)明的篩選方法操作簡單，快捷，費用低廉，準(zhǔn)確度高(可達(dá)99％)，并可實現(xiàn)自動化的直接檢測。此外，可根據(jù)本方明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，用于篩選攜帶有利等位基因(AA)的個體，為種牛的育種工作提供便利。本發(fā)明將在BLAD有害基因的檢測及優(yōu)良種牛的分子選育中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。


圖1為特異性引物BLF/BLR在CD18基因中的位置示意2為特異性引物BLF/BLR的PCR擴增片段的大小及BLAD突變位點示意3為退火溫度為64℃的PCR擴增產(chǎn)物的2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4為牛CD18基因的PCR-SSCP分析檢測圖，其中AA型為正常牛，AB型為BLAD攜帶者圖5為不同基因型的測序峰圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、用于篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的引物設(shè)計及PGR反應(yīng)條件的優(yōu)化一、引物設(shè)計依據(jù)牛CD18基因的核苷酸序列(GenBank號Y12672)，用Oligo6.0軟件設(shè)計用于PCR-SSCP篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的特異性PCR引物，PCR產(chǎn)物長度為150-300bp左右比較適合PCR-SSCP檢測。通過對一系列PCR引物的設(shè)計、篩選和優(yōu)化，最終根據(jù)如序列表中序列3所示的核苷酸序列，該序列中包含引起B(yǎng)LAD的突變位點(第32位堿基，即A55GCD18基因Exon2自5’端第55位堿基，正常牛為堿基A，BLAD牛為堿基G)，設(shè)計出引物BLF(上游引物)5’-ACCTTCCGGAGGGCCAAGGG-3’(序列表中序列1)和引物BLR(下游引物)5’-AGTAGCTGCCTCACCAATGCG-3’ (序列表中序列2)，特異性PCR引物BLF和BLR在CD18基因中的位置示意圖見圖1，其擴增片段的大小及BLAD突變位點示意圖如圖2所示，將該引物對命名為BLF/BLR。
二、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化選擇北京市種公牛站的荷斯坦公牛為實驗材料，提取新鮮血液的基因組DNA(基因組DNA可以從冷凍血液、精液(新鮮或冷凍)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品中提取)并以此為模板，在引物對BLF/BLR的引導(dǎo)下利用梯度PCR儀進行PCR擴增，25μl PCR反應(yīng)體系為dNTP混合物(4×2.5mol/L)2μl，10×PCR緩沖液(Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM)2.5μl，正、反向引物(20pmol/L)各0.5μl，Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.5μl，模板DNA(20ng/μl)2μl，ddH2O 17μl；PCR反應(yīng)條件初步設(shè)定為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55±10℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，對不同退火溫度的PCR擴增產(chǎn)物各取3ul進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中退火溫度為64℃的PCR擴增產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示(泳道1-8PCR擴增產(chǎn)物，泳道M100bp ladder Marker)，PCR擴增產(chǎn)物長度為162bp，與預(yù)期結(jié)果一致，且擴增條帶單一，濃度較高，可用于PCR-SSCP檢測，因此，將優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件定為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。
實施例2、PCR-SSCP篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛及其測序鑒定一、PCR-SSCP篩選提取54頭種公牛新鮮血液的基因組DNA并以此為模板，在實施例1獲得的特異性引物對BLF/BLR的引導(dǎo)下進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系與實施例1相同，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，54頭種公牛的PCR擴增產(chǎn)物各取1.5μl置于PCR管中，分別加6μl上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，10％甘油，0.025％溴酚藍(lán)和0.025二甲苯青)，98℃變性10min后，立即置于冰上冰浴5min，點樣，進行14％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(120V，16-18h)，其中14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(30mL體積，0.1cm膠條)的制作方法為清洗玻璃板，烘干，用0.8％瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙；配制30mL 14％的聚丙稀酰胺膠工作液(30％聚丙烯酰胺12.0mL，50％甘油3mL，10×TBE 3mL，10％過硫酸銨200μl，TEMED 12μl，純水12mL)，混合后迅速灌膠；當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時停止灌膠，插入梳子，室溫聚合約半小時，多余的聚丙烯酰胺4℃保存，并隨時觀察凝膠聚合情況，補加聚丙烯酰胺；凝膠聚合后，向電泳槽中加入1×TBE，為了保證電泳條帶的整齊性，用注射器沖洗加樣孔，預(yù)電泳20min后，可上樣。電泳結(jié)束后，采用硝酸銀染色方法進行染色，具體方法包括以下步驟1)小心取下凝膠，置于70％乙醇中，放在水平搖床上緩慢搖動15min(乙醇用完可以回收)進行固定；2)去離子水洗凝膠2遍，每次2-3min，盡量除去乙醇；3)用200mL染色液(NH3·H2O 2mL，3.6％NaOH 4.2mL，20％AgNO33.6mL，加去離子水至200mL)染色30min；4)去離子水洗凝膠3遍，每次2-3min，盡量洗去多余的染色液；5)用200mL顯色液(1％檸檬酸鈉1mL，甲醛100ul，加去離子水至200mL)顯色約10-30min，當(dāng)單鏈DNA條帶的清晰度合適時，倒掉顯色液；6)用去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相。
基因分型結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)存在2種不同基因型，AA為純合基因型，表示正常牛只，采用“TL”標(biāo)識；AB為雜合基因型，表示BLAD攜帶者，采用“BL”標(biāo)識。在所檢測的54頭種公牛中，AA基因型53頭，AB基因型僅有1頭，也就是說僅有1頭公牛是BLAD突變基因攜帶者。
二、測序鑒定用測序的方法對步驟一的檢測結(jié)果進行鑒定，具體方法為采用Geneclean試劑盒(購自北京天為時代科技有限公司)回收并純化步驟一中以54頭種公牛新鮮血液為模板的PCR-SSCP擴增產(chǎn)物，使用ABI PRISM377 DNA測序儀，通過Dye primer試劑盒(購自美國PE公司)對純化的PCR擴增產(chǎn)物直接進行正、反方向測序，進一步驗證步驟一的基因分型檢測結(jié)果。測序結(jié)果表明，AA基因型公牛PCR擴增片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，第32位堿基為A，即CD18基因第2外顯子自5’端第55位堿基為A；AB基因型公牛PCR擴增片段的核苷酸序列中第32位堿基為N，即CD18基因第2外顯子自5’端第55位堿基為N(N表明的是未檢出的堿基，實際上在樣品中該位點存在兩種情況即A和G，測序結(jié)果顯示為N，本發(fā)明亦以N來表示在該位點的堿基，即N表示A和G雜合)。兩種基因型的部分基因測序峰圖見圖5。CD18基因第二外顯子A55G錯義突變即為引起B(yǎng)LAD的堿基突變，上述測序結(jié)果證明步驟一的基因分型結(jié)果正確，本發(fā)明的方法及其專用引物可用于篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛，據(jù)統(tǒng)計，檢測準(zhǔn)確率達(dá)99％以上。
序列表<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1accttccgga gggccaaggg20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2agtagctgcc tcaccaatgc g21<210>3<211>162<212>DNA<213>牛(Bos taurus)
<400>3accttccgga gggccaaggg ctaccccatc gacctgtact acctgatgga cctctcctac 60tccatggtgg atgacctcgt caacgtcaag aagctggggg gtgacctgct ccgggccctc 120aatggcatca ccgagtcggg ccgcattggt gaggcagcta ct16權(quán)利要求
1.用于篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。
2.一種篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法，是以待測牛的基因組DNA為模板，在權(quán)利要求1所述的引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿基為A的種牛為CD18基因正常的優(yōu)良種牛；所述N為A和G的雜合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為模板DNA40ng，Taq酶1.5U，20pmol/L上、下游引物各0.5μl，2.5mmol/LdNTPs 2μl，10×PCR緩沖液2.5μl，用重蒸水補充反應(yīng)體系至25μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選CD18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物。該引物是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。該方法是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿基為A的種牛為CD18基因正常的優(yōu)良種牛；所述N為A和G的雜合體。本發(fā)明的篩選方法操作簡單，快捷，費用低廉，準(zhǔn)確度高(可達(dá)99％)，并可實現(xiàn)自動化的直接檢測。此外，可根據(jù)本發(fā)明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，用于篩選攜帶有利等位基因(AA)的個體，為種牛的育種工作提供便利。
文檔編號C12N15/11GK1970793SQ200610144259
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者李艷華, 張勝利, 韓廣文, 薛建華, 朱玉林, 劉振君 申請人:北京奶牛中心