專利名稱：一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列、方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列、方法及試劑盒，屬于檢驗檢疫領域。
背景技術：
瘋牛病的科學名稱是牛海綿狀腦病(Bovine spongiform Encephalopathy，BSE)，與羊癢病(Scrapie)、鹿的慢性消耗性疾病(CWD)、貓的海綿狀腦病(Feline spongiformEncephalopathy，F(xiàn)SE)以及人的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)等屬于同一組疾病，統(tǒng)稱可傳遞性海綿狀腦病((Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSEs)。這類疾病均引起發(fā)病動物腦組織漸進性空泡變性，致神經(jīng)紊亂、最終死亡。其臨床表現(xiàn)主要為精神失常，共濟失調(diào)，感覺(觸覺、聲音)過敏，易驚厥，故俗稱瘋牛病。該病自1985年首次在英國報道以來，目前全世界已有28個國家發(fā)現(xiàn)了該病。1994年在英國發(fā)現(xiàn)了一種與人的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)相似的疾病，即新的變化了的CJD(newvariant CJD，簡稱nvCJD)，隨即宣布人的nvCJD可能與人食用了被BSE病原污染了的牛肉有關，此事引起了世界各國的關注。近年來隨著國際貿(mào)易的日趨頻繁，瘋牛病疫情有向北美和亞洲地區(qū)蔓延擴散的趨勢，因此世界各國都投入巨資進行研究，期望在BSE病原、流行病學、傳播途徑、診斷方法及防治等方面有所突破。
瘋牛病之所以在全世界范圍內(nèi)引起如此關注，與其病原的特殊性是分不開的。盡管至今為止人們對瘋牛病病原及其發(fā)病機理仍不完全清楚，但接受朊病毒學說的人越來越多。該理論認為，BSE病原和癢病病原一樣，是一種朊病毒。與普通病毒不同，朊病毒具有許多異常特性對外界理化因素具有極強的抵抗力，對高壓、高熱耐受力很強，普通理化消毒方法及高壓滅菌措施均不能使其完全滅活；該病原對離子輻射和超聲的抵抗力也很強；也能耐受福爾馬林處理，不被多種核酸酶滅活。一旦污染或感染該病原，將難以消除。另外，朊病毒在電鏡下見不到病毒顆粒，不形成包涵體、不含非宿主蛋白、不引起宿主的免疫反應，不產(chǎn)生抗體，一旦感染，臨床上難以診斷。目前還沒有一種可用于臨床的活體診斷瘋牛病的方法，所有的方法都是死后診斷，而且沒有任何特異性治療方法可以用于該病，這使得瘋牛病的診斷和防治都陷入困境。因此，防控瘋牛病的主要措施還是預防為主。
最近幾年瘋牛病有從歐洲向亞洲和美洲地區(qū)蔓延擴散的趨勢，周邊國家相繼發(fā)生了瘋牛病，我國已處于重重包圍之中。再加上我國加入WTO后，國際貿(mào)易往來日趨頻繁，許多原來受限制的產(chǎn)品逐漸解禁，這也增加了BSE病原傳入的風險。隨著北京2008年奧運會的日益臨近，奧運會期間可能面臨的食品安全問題也是我國政府和北京奧組委一直重視的問題。其中進口牛肉是否會攜帶和傳播瘋牛病也是一個十分重要的問題。
從科學的角度講，牛肉中本身是否攜帶瘋牛病病原，目前還沒有定論。但來自牛體可引起瘋牛病傳播的一些高危險組織(被稱為特殊風險性物質(zhì)，SRM)卻是瘋牛病的主要感染性物質(zhì)，其中99％的感染性集中在牛的中樞神經(jīng)組織?？茖W研究證明，人患瘋牛病就是由于人們食用了污染了瘋牛病病原(污染源主要是牛的中樞神經(jīng)組織)的牛肉引起的。因此，世界各國在防止瘋牛病的傳入和傳出方面都嚴格要求將SRM從食物鏈條中剔除。
瘋牛病屬于神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，瘋牛病特殊風險性物質(zhì)主要集中于中樞神經(jīng)組織，感染性占總感染性的99％。目前國際上對瘋牛病特殊風險性物質(zhì)的檢測都是通過檢測其中樞神經(jīng)組織標記物來實現(xiàn)的，最常用的中樞神經(jīng)組織標記物是膠原纖維酸性蛋白(GFAP)。現(xiàn)有的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，該方法需要制備高效價的特異性抗體，操作繁瑣，費時費力。而且，我國目前也沒有該試劑，所以試劑都要依靠進口，費用昂貴，而且來貨周期很長，給檢測工作帶來不便。另外，隨著牛肉生產(chǎn)加工企業(yè)生產(chǎn)工藝的改進，污染的中樞神經(jīng)組織可能是很微量的，其敏感性已經(jīng)不能滿足檢測的需要，所以有必要建立更加敏感快速的檢測方法。
熒光RT-PCR技術是近幾年來建立起來的比較成熟的檢測技術之一，該技術的原理是在普通PCR反應的基礎上引入了更加特異的熒光探針，結果通過有無熒光釋放及釋放的熒光強度來檢測，因而與普通PCR相比，具有更加快速、更加敏感、更加特異的優(yōu)勢。本研究建立的熒光RT-PCR原理是在探針的5‘端帶有熒光物質(zhì)(6-FAM)，3’端帶有淬滅集團(MGB)，當探針完整時，5‘端的熒光物質(zhì)受到3’端淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。而當探針被分解后，5‘端的熒光物質(zhì)便會游離出來，發(fā)出熒光。當PCR反應液中加入熒光物質(zhì)后，在PCR反應的退火過程中，由于熒光探針的退火溫度高，它首先和模板雜交。在PCR反應的進一步延伸過程中，DNA聚合酶的5‘——3’內(nèi)切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，熒光集團被游離出來，游離出來的熒光物質(zhì)便會發(fā)出熒光。這樣通過檢測反應體系中的熒光強度，就可以檢測PCR產(chǎn)物擴增情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的第一個技術問題是提供一組檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列。
本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、經(jīng)濟實用的檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法。
本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供一種可實現(xiàn)商品化的檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的試劑盒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一組檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQID No.3所示的堿基序列。
本發(fā)明應用熒光RT-PCR技術對牛肉中的瘋牛病特殊風險物質(zhì)污染物進行檢測，其檢測原理為中樞神經(jīng)組織是瘋牛病的主要感染性物質(zhì)，其99％的感染性都集中于中樞神經(jīng)組織，目前對牛肉是否含有BSE病原存在爭議，但牛肉在屠宰過程中被中樞神經(jīng)組織污染的機會很多，所以有必要對來自于BSE疫區(qū)的牛肉進行瘋牛病特殊風險物質(zhì)污染情況進行檢測。對中樞神經(jīng)組織的檢測都是通過檢測其生物標記物來實現(xiàn)的，比較通用的中樞神經(jīng)組織的標記物是膠原纖維酸性蛋白(GFAP)，該蛋白只是穩(wěn)定表達于中樞神經(jīng)組織，其他組織中很少或者沒有，因此是檢測中樞神經(jīng)組織的理想的標記物。
從GenBank中讀取牛、綿羊、山羊、豬的GFAP全基因序列進行同源性比較，選擇種間變異、種內(nèi)保守的區(qū)域設計引物和探針。經(jīng)過分析比較發(fā)現(xiàn)，GFAP基因組DNA全長8797bp，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，其中mRNA全長1287bp?？紤]到要擴增的是GFAP的mRNA片段，所以引物和探針設計時要避免擴增出DNA。因此要選擇橫跨一個內(nèi)含子兩側的兩個外顯子上，考慮到種間差異，最后上下游引物分別選在第5、6號外顯子上，而探針序列要橫跨兩個外顯子，位于上下游引物區(qū)域內(nèi)。選定的引物和探針序列如下SEQ ID No.1上游引物序列5’ACC TGC GAC CTG GAG TCC T 3’共19bp，Tm＝57℃；SEQ ID No.2下游引物序列5’CTC GCG CAT CTG CCG 3’共15bp，Tm＝57℃；SEQ ID No.3熒光探針序列5’6-FAM-ACT CGT TCG TGC CGC GC-MGB 3’共17bp，Tm＝57℃擴增片段長度為60bp。
一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，以中樞神經(jīng)組織的標記物GFAP mRNA為靶目標進行檢測。該方法使用的引物和探針具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的堿基序列。
一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，為RT-PCR法，包括如下步驟(1)提取待檢物的RNA；
(2)檢測待檢物的GFAP mRNA反應體系25μl上游引物 0.5ul(10pmol/μl)下游引物 0.5ul(10pmol/μl)探針 0.25ul(10pmol/μl)10×buffer1.25uldNTP 1.25ulMg2+3ulTaq 0.25ulBeads 1bead/5reactionsH2O 15ulRNA模板 3ul反應條件第一階段反轉錄反應，42℃，30min；第二階段預變性94℃，3min；第三階段94℃，10s45℃，30s72℃，1min，5個循環(huán)；第四階段94℃，10s60℃，30s，40個循環(huán)熒光收集設置在第四階段每次循環(huán)的退火延伸時進行；第五階段40℃，1min 降溫(3)繪制標準曲線將提取的RNA從1∶10開始進行10倍梯度稀釋，分別以稀釋倍數(shù)的負對數(shù)為橫坐標、以CT值為縱坐標，繪制標準曲線，求出相關性系數(shù)；(4)對結果進行判定讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準。
一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的試劑盒，包括如下試劑(1)總RNA提取試劑TRIzolReagent Total RAN Isolation kit，Invitrogen Life Technologies產(chǎn)品，購自新經(jīng)科公司。
(2)Ready-To-GoTMRT-PCR Beads Amersham Biosciences產(chǎn)品，購自深圳匹基生物公司。
(3)RT-PCR反應液TaqTMPCR試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品，購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，包括10×PCR Buffer(Mg2+free)dNTP Mixture(各2.5mmol/L)Taq DNA聚合酶(5U/μl)MgCl2(25mM)(4)DEPC處理水TaKaRa公司產(chǎn)品，購自購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。
(5)氯仿分析純等級，新開啟后用無RNA酶的容器分裝。
(6)異丙醇分析純等級，新開啟后用無RNA酶的容器分裝。
(7)75％乙醇分析純等級無水乙醇用DEPC水配制，用無RNA酶的容器分裝。
(8)PBS121oC，15min高壓滅菌。
(9)引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；探針SEQ ID No.3，5’端標記FAM，3’端標記MGB，引物由TaKaRa(大連寶生物)公司合成，探針由ABI(美國總部)合成，分別用DEPC處理水配成10pmol/μl，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 本研究以中樞神經(jīng)組織的標記物GFAP mRNA為檢測的靶目標，建立了檢測牛肉中的瘋牛病特殊風險物質(zhì)污染的檢測方法。組織特異性實驗結果表明，GFAP mRNA在中樞神經(jīng)組織中特異性表達，其他組織中都沒有，證明可以用作檢測靶物質(zhì)。敏感性檢測結果表明，該方法可以檢測的最低檢測限為0.001％。穩(wěn)定實驗結果表明，該方法經(jīng)100℃加熱處理30min基本對檢測結果無影響，耐熱性很強；組織樣品可以在30℃以上室溫穩(wěn)定存放4天、4℃穩(wěn)定冷藏2周，檢測結果仍為陽性，穩(wěn)定性很好。符合性實驗結果表明，用該方法對市售牛肉和牛肉制品進行檢測，在檢測的20份重復樣品中，檢測結果為牛腿和牛林全部為陰性，牛肩1份陽性，牛腩5份陽性，黃瓜條6份陽性，熟制牛肉9份陽性。分析其原因，還是與不同部位牛肉被中樞神經(jīng)組織污染的機會不同有關。目前我們國家的屠宰場基本上還都是先劈半后再剔除脊髓，因此在劈半的過程中污染是難以避免的。腿和牛林等部位容易分割，被污染的機會少，所以檢測結果為陰性。黃瓜條和牛腩接觸脊髓的機會多，容易污染，所以有可能檢出陽性。而陽性率最高的是熟制牛肉，這可能與熟制牛肉本身不太清楚其來源，很可能是由許多部位的碎肉所制，所以存在被中樞神經(jīng)組織污染的幾率還是很高的。此結果表明，該檢測方法用于牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的污染檢測是可行的，也可以用于牛肉熟制品的檢測。
將該方法與目前市售的ELISA檢測試劑盒進行比較性實驗，結果表明該技術可以檢測到牛肉中含有0.001％的中樞神經(jīng)組織，而ELISA實驗可以檢測到0.01％，前者比后者的敏感性提高了10倍。穩(wěn)定性實驗結果表明，牛肉在室溫(夏天)存放4天、4℃存放2周、95℃加熱處理30min，不會影響檢測敏感性，穩(wěn)定可靠；而ELISA實驗的穩(wěn)定性不如前者，加熱處理敏感性降低，室溫可以存放2天，4℃可以冷藏1周。熒光RT-PCR技術全過程需要3小時，而且可以對實驗過程進行適時監(jiān)控，因而更能滿足與口岸快速、批量檢驗檢疫的需要。更重要的是，目前市售的ELISA試劑盒都要從國外訂購，來貨周期長，價格昂貴，此研究建立的熒光RT-PCR可以開發(fā)成具有自主知識產(chǎn)權的試劑盒，輕便易放，適合于在口岸推廣使用。
本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新之處在于本研究利用熒光RT-PCR技術無可比擬的優(yōu)越性，以檢測中樞神經(jīng)組織的標記物——膠原纖維酸性蛋白(GFAP)的核酸mRNA為靶目標，通過檢測牛肉中有無GFAP mRNA，就可以判斷該批牛肉是否被瘋牛病特殊風險物質(zhì)所污染。與傳統(tǒng)ELISA技術相比，該方法更加敏感、快速、穩(wěn)定性更好。敏感性實驗結果表明，該技術可以檢測到牛肉中含有0.001％的中樞神經(jīng)組織。穩(wěn)定性實驗結果表明，牛肉在室溫(夏天)存放4天、4℃存放2周、100℃加熱處理30min，不會影響檢測敏感性，穩(wěn)定可靠。實驗全程只需要3個小時即可完成，而且可以對實驗過程進行適時監(jiān)控。因而，更能滿足口岸快速、批量檢驗檢疫的需要。
下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1為實施例1的標準曲線。
圖2為實施例1不同稀釋倍數(shù)陽性樣品的擴增曲線。
圖3為實施例1組織特異性擴增反應圖。
圖4為腦或脊髓勻漿梯度稀釋后靈敏性檢測結果。
圖5為腦或脊髓勻漿實驗性污染牛肉后敏感性檢測結果。
具體實施例方式
實施例1.
一.材料1.試驗材料從郁香苑屠宰場采取的無污染牛肉和從超市隨機買的牛肉若干。
2.試驗試劑(1)總RNA提取試劑盒TRIzolReagent Total RAN Isolation kit，Invitrogen Life Technologies產(chǎn)品，購自新經(jīng)科公司。
(2)Ready-To-GoTMRT-PCR Beads Amersham Biosciences產(chǎn)品，購自深圳匹基生物公司。
(3)RT-PCR反應液TaqTMPCR試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品，購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，包括10×PCR Buffer(Mg2+free)dNTP Mixture(各2.5mmol/L)Taq DNA聚合酶(5U/μl)MgCl2(25mM)(4)DEPC處理水TaKaRa公司產(chǎn)品，購自購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。
(5)氯仿分析純等級，新開啟后用無RNA酶的容器分裝。
(6)異丙醇分析純等級，新開啟后用無RNA酶的容器分裝。
(7)75％乙醇分析純等級無水乙醇用DEPC水配制，用無RNA酶的容器分裝。
(8)PBS121℃，15min高壓滅菌。
3.儀器設備(1)LightCycle3.0 Roche熒光PCR儀(2)LightCycler Capillaries毛細管，Roche產(chǎn)品，購自深圳匹基公司。
(3)其他常用儀器高速臺式冷凍離心機(最高離心力12 000g以上)混勻器2℃～8℃冰箱-20℃冰箱
-80℃冰箱10μL、50μL、200μL、1000μL微量可調(diào)移液器及配套帶濾芯吸頭1.5mL、2mL、10mL eppendorf管。
4.采樣工具一次性棉簽剪刀、鑷子，每次用完必須經(jīng)121℃，15min高壓滅菌并烘干一次性手術刀一次性自封口袋研缽，每次用完必須經(jīng)121oC，15min高壓滅菌并烘干。
二.方法1.樣品制備(1)從屠宰場采的無污染牛肉用高壓滅菌剪剪開，從內(nèi)部挖取一塊約2g重的肌肉，放于滅菌并烘干的研缽中充分研磨，將研磨的碎組織放裝于無菌2mL eppendorf管中，每管25mg左右，編號，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)從超市隨機買的牛肉從每塊肉的表面不同部位隨機取幾塊約2mm厚的肉，放于滅菌并烘干的研缽中充分研磨，將研磨的碎組織放裝于無菌2mL eppendorf管中，每管25mg左右，編號，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)試驗性污染牛肉制備不同濃度的中樞神經(jīng)組織勻漿液，每個濃度的勻漿液均勻涂布于一塊10×10cm的無污染牛肉表面，用一次性棉簽在涂抹過的牛肉表面檫拭，將棉簽放入2mL eppendorf管中(事前加入800ul TriZoL試劑)充分擠壓將棉簽內(nèi)的液體擠出，編號，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.RNA提取使用TRIzol Reagent Total RNA Isolation kit，按照說明書要求操作如下。
(1)變性培養(yǎng)的淋巴細胞用PBS洗3次之后離心沉淀，按1ml TRIzol溶解5×106細胞，反復吹吸。
(2)分相15～30℃溫育5min使核蛋白復合體完全溶解，按每毫升TRIzol加0.2ml氯仿。蓋緊蓋子，劇烈搖動15sec，15～30℃溫育2～3min。不超過12,000×rpm，2～8℃離心15min。離心之后，混合物分為紅色酚-氯仿相、交界面、無顏色上清水相，RNA包括在水相中。
(3)RNA沉淀轉移水相到新管，按每毫升TRIzol加入0.5ml異丙醇，15～30℃溫育10min，不超過12,000×rpm，2～8℃離心10min。
(4)RNA洗滌去上清，按每毫升TRIzol至少加入75％乙醇1ml洗一次，以不超過12,000×rpm，2～8℃離心5min。
(5)RNA重溶快速干燥RNA但不要完全干燥(空氣中干燥5～10min)，用DEPC處理水溶解RNA，每25mg肉組織加入20ulDEPC，反復吹吸，65℃溫育10min，測OD260/OD280，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.牛肉中GFAP mRNA的檢測(1)引物、探針設計與合成引物和探針序列如下上游引物序列5’ACC TGC GAC CTG GAGTCC T 3’下游引物序列5’CTC GCG CAT CTG CCG 3’熒光探針序列5’6-FAM-ACT CGT TCG TGC CGC GC-MGB 3’引物由TaKaRa(大連寶生物)公司合成，探針由ABI(美國總部)合成，分別用DEPC處理水配成10pmol/μl，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)RT-PCR擴增反應反應體系25μl上游引物 0.5ul(10pmol/μl)下游引物 0.5ul(10pmol/μl)探針 0.25ul(10pmol/μl)10×buffer1.25uldNTP 1.25ulMg2+3ulTaq 0.25ulBeads 1bead/5reactionsH2O 15ulRNA模板 3ul
總體積25ul操作程序(A)首先在反應液配置區(qū)將各個反應成分混合，分裝到PCR毛細管中，每管加入22ul，陰性對照管中再補加3ul DEPC水至總體積25ul，并蓋緊蓋子；(B)將這些管轉移到加樣區(qū)，首先往檢測管中分別補加相應的模板RNA3ul，蓋緊蓋子；(C)再將陽性樣品從冰箱取出，在陽性對照管中補加陽性模板RNA3ul，蓋緊蓋子。
(D)將毛細管500rpm離心1min。
(E)放入熒光PCR儀內(nèi)，記錄樣品擺放順序，檢測。
反應條件第一階段反轉錄反應，42℃，30min；第二階段預變性94℃，3min；第三階段94℃，10s45℃，30s72℃，1min，5個循環(huán)；第四階段94℃，10s60℃，30s，40個循環(huán)熒光收集設置在第四階段每次循環(huán)的退火延伸時進行。
第五階段40℃，1min 降溫。
4.標準曲線的繪制將從腦組織或脊髓組織提取的RNA從1∶10開始進行10倍梯度稀釋(1∶101，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106，1∶107，1∶108，分別以稀釋倍數(shù)的負對數(shù)為橫坐標、以CT值為縱坐標，繪制標準曲線，求出相關性系數(shù)，驗證方法的有效性。
5.結果判定標準的確定從屠宰場采取無特殊風險物質(zhì)污染的不同牛肉產(chǎn)品各50份，提取RNA，進行熒光RT-PCR，計算平均CT值，確定結果判定標準。
6.組織特異性試驗從屠宰場采取無中樞神經(jīng)組織污染的牛肉產(chǎn)品及中樞神經(jīng)組織(腦和脊髓)若干，提取RNA，進行熒光RT-PCR，對方法特異性進行分析。
三.結果
1.標準曲線的繪制分別從3份25mg新鮮腦組織或脊髓中提取RNA，溶解在20uL DEPC處理水中，測定OD260和OD280，計算總RNA濃度，計算公式如下總RNA濃度＝OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)×1/1000(μg/μl)表1 組織樣品總RNA濃度

將上述陽性組織進行10倍梯度稀釋，再分別以每個稀釋度為模板進行熒光RT-PCR，用所得的CT值和稀釋倍數(shù)的負對數(shù)作標準曲線，結果如表2和圖1。
表2 總RNA不同稀釋比例所對應CT值

一般情況下，對于已知濃度的標準品，每進行1個10倍梯度稀釋，其CT值大約升高3.0左右。由表2可以看出，隨著稀釋倍數(shù)的10倍遞增，其CT值基本以差3的順序增長，比較規(guī)律，說明樣品之間誤差很小，結果不具有偶然性。
從標準曲線可以看出，隨著稀釋倍數(shù)的遞增，其CT值趨于一條直線，直線的斜率為-2.8277，相關性系數(shù)為0.9978，表明此曲線線形回歸良好，可以對模板進行定量。
2.結果判定標準的確定表3 不同組織樣品的平均CT值

通過對大量樣品的組織特異性擴增實驗結果以及對已知濃度的模板梯度稀釋實驗結果進行比較分析，可以看出陰性對照的檢測結果均為一條平滑直線，無CT值或CT值＞30；陽性對照的檢測結果都為一標準的擴增曲線，根據(jù)模板濃度不同，CT值一般在10-30之間，為了不引起其他樣品交叉污染同時又能很好地對照，建議以后用作陽性對照的模板CT值為20左右。如果被測樣品的CT值＞30，與陽性對照曲線和陰性對照直線相比，該樣品的擴增線與陰性對照相同，是一條平滑直線，因此可以設定CT值＞30為陰性樣品的界定值。經(jīng)過上述分析，結果判定標準如下直接讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，可根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。
質(zhì)控實驗標準陰性對照無CT值或CT值＞30，擴增線是一條平滑直線；
陽性對照的CT值應≤30.0，擴增線是一條典型的擴增曲線；否則，此次實驗視為無效。
陰性判定標準無CT值或CT值＞30、擴增線為一條平滑直線的樣品為陰性；陽性判定標準CT≤30、擴增線為擴增曲線的樣品為陽性。
對于可疑結果要進行重復性試驗進行驗證。
實施例2、敏感性試驗一.方法1.RNA最低檢測濃度的確定分別將從腦組織或脊髓提取的RNA作無限10倍梯度稀釋，確定最低檢測的RNA濃度。
2.組織勻漿最低檢測限的確定將腦組織或脊髓用滅菌PBS作成10％勻漿，然后進行10倍梯度稀釋，再分別提取RNA進行熒光RT-PCR，確定組織勻漿最低檢測限。
3.試驗性污染牛肉最低檢測限的確定將腦組織或脊髓用滅菌PBS作成10％勻漿，然后進行10倍梯度稀釋，再用棉簽分別將各個稀釋度的組織勻漿500ul均勻涂抹到10×10cm的一塊無污染牛肉表面，再用棉簽在這些涂抹過的牛肉表面擦拭，在裝有800ul TriZol試劑的管內(nèi)充分擠壓棉簽，再提取RNA，進行熒光RT-PCR，進行試驗性污染敏感性試驗。
二.結果1.模板RNA最低檢測限的確定將從腦組織或脊髓提取的RNA作無限10倍梯度稀釋，結果如圖2和表2。由圖2和表2可以確定，將已知濃度的陽性樣品RNA作10倍梯度稀釋后，最低可以檢測到1∶107倍稀釋。如果以起始平均腦組織濃度0.403μg/μl計算，1∶107稀釋后，最低檢測的RNA濃度是0.0403pg/uL；如果以起始平均脊髓組織濃度0.432μg/μl計算，1∶107稀釋后，最低檢測的RNA濃度是0.0432pg/uL；由此可以看出，本研究所建立的熒光RT-PCR可以檢測到的RNA濃度限為0.04pg/uL。
2.組織勻漿最低檢測限的確定將腦組織或脊髓用滅菌PBS作成10％勻漿，將組織勻漿進行10倍梯度稀釋的檢測結果如表4和圖4。
表4 腦或脊髓勻漿梯度稀釋后靈敏性檢測結果

由表4和圖4可以看出，腦或脊髓勻漿進行10倍梯度稀釋后，最低檢測限為0.001％倍稀釋，其CT值為29.34，有擴增信號。
3.試驗性污染牛肉最低檢測限的確定將不同稀釋度的腦組織或脊髓勻漿試驗性污染牛肉后，其靈敏性檢測結果表5和圖5。
表5 腦或脊髓勻漿實驗性污染牛肉后敏感性檢測結果

從表5和圖5可以看出，不同濃度的腦或脊髓勻漿試驗性污染牛肉后，檢測結果與直接檢測組織勻漿的結果基本相同，最低檢測限為0.001％倍稀釋，CT值為28.34。說明牛肉即使被少量的中樞神經(jīng)組織污染后，也可以通過熒光RT-PCR檢測出來。
實施例3、穩(wěn)定性試驗一.方法分別將腦或脊髓組織進行下列不同處理，進行穩(wěn)定性試驗1.熱穩(wěn)定性試驗將腦或脊髓組織原液、20％、10％、1％、0.1％和0.01％稀釋液經(jīng)100℃加熱30min，再提取RNA作熒光RT-PCR，進行熱穩(wěn)定性試驗。
2.室溫存放穩(wěn)定性試驗將不同份相等量的腦或脊髓組織分別于室溫存放1d、2d、3d、4d、5d后，再提取RNA作熒光RT-PCR，進行室溫穩(wěn)定性試驗。
3.4℃冷藏穩(wěn)定性試驗將腦或脊髓組織原液、20％、10％、1％、0.1％和0.01％稀釋液在4℃存放1d、2d、3d、4d、5d、8d、11d、15d后，再提取RNA作熒光RT-PCR，進行冷藏穩(wěn)定性試驗。
二.結果1.熱穩(wěn)定性試驗結果將不同濃度的腦或脊髓組織液經(jīng)100℃加熱30min后，穩(wěn)定性檢測結果如表6。
表6 不同濃度組織勻漿熱處理后穩(wěn)定性檢測結果

由表6可以看出，將不同濃度的腦或脊髓組織勻漿進行100℃加熱30min處理后，均還能檢測到陽性結果，說明該方法的檢測不受熱處理的影響或者影響很小。
為了進一步探討加熱處理到底對檢測結果有多大影響，同時準備了兩份樣品，一份進行熱處理，另一份作為不處理對照，然后將二者的檢測結果比較如表7。
表7 不同濃度組織勻漿熱處理后前后結果比較

由表7熱處理前后檢測結果進行比較，可以看出100℃加熱30min處理對檢測結果影響不是很大。對于一個給定的濃度而言，加熱處理后其CT值比加熱處理前有所升高，但升高的幅度非常小，大部分增幅都不足1.0，擴增曲線基本一致。說明加熱處理對該方法的檢測結果無明顯影響。
2.室溫放置穩(wěn)定性實驗結果將腦或脊髓組織分別于室溫存放1d、2d、3d、4d、5d后的檢測結果如表8。
表8 室溫放置不同時間后檢測結果

由表8可以看出，與陽性對照相比，在室溫下每多放置1天，其檢測CT值平均升高3.0左右，室溫放置對檢測結果有所影響，放置時間越久，對其檢測影響越大，在室溫可以存放的最長時間為4天，從第5天開始幾乎檢測不到陽性信號。這也可能與夏天炎熱的氣候、室溫本身高大30℃以上有關，如果保存在25℃常溫下，應該可以存放更長時間。
3.4℃冷藏穩(wěn)定性實驗結果將腦或脊髓組織液分別于4℃存放1d、2d、3d、4d、5d、8d、11d、15d后，穩(wěn)定性檢測結果如表9。
表9 4℃冷藏不同時間后檢測結果

由表9可以看出，4℃冷藏對檢測結果的影響隨著時間的延長在增大，冷藏5天期間影響CT值有所升高，但升高幅度不是很大，每多冷藏1天，CT值基本升高1.0左右。冷藏15天后，CT值升高為29.67，基本趨向于陰性。因此建議，用該方法檢測的樣品4℃冷藏時間以不超過2周為宜。
實施例4、符合性試驗一.方法為了驗證方法的有效性和可行性，隨意從市場上買了不同部位的生牛肉和熟制牛肉產(chǎn)品，從每塊牛肉表層隨機去一塊約2mm后的一薄層，提取RNA，進行熒光RT-PCR，驗證方法的有效性和可行性。
二.結果對從市場上買來的不同部位的生牛肉和熟制牛肉制品隨機進行檢測，每種牛肉20份，檢測結果如表10。
表10 市售牛肉檢測結果

由表10可以看出，從檢測的20份牛肉中，牛腿和牛林沒有檢測到陽性；牛肩檢測到1份陽性樣品，黃瓜條檢測到6份陽性樣品，牛腩檢測到5份陽性樣品，熟制牛肉制品檢測到9份陽性。分析其原因，還是與不同部位牛肉被中樞神經(jīng)組織污染的機會不同有關。目前我們國家的屠宰場基本上還都是先劈半后再剔除脊髓，因此在劈半的過程中污染是難以避免的。腿和牛林等部位容易分割，被污染的機會少，所以檢測結果為陰性。黃瓜條和牛腩接觸脊髓的機會多，容易污染，所以有可能檢出陽性。而陽性率最高的是熟制牛肉，這可能與熟制牛肉本身不太清楚其來源，很可能是由許多部位的碎肉所制，所以存在被中樞神經(jīng)組織污染的幾率還是很高的。此結果表明。該檢測方法用于牛肉中中樞神經(jīng)組織的污染檢測是可行的，也可以用于牛肉熟制品的檢測。
實施例5、熒光RT-PCR與市售ELISA試劑盒比較一.方法1.敏感性比較分別配制20％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％和0.00001％的腦組織或脊髓組織勻漿，做完全相同的雙份處理，一份提取RNA用于熒光RT-PCR試驗，另一份直接用于ELISA檢測，對這兩種方法檢測的敏感性進行比較分析。
2.熱穩(wěn)定性比較分別配制20％、10％、1％、0.1％和0.01％的腦組織或脊髓組織勻漿，做完全相同的雙份，100℃加熱處理30min后，一份提取RNA用于熒光RT-PCR試驗，另一份直接用于ELISA檢測，對這兩種方法檢測的熱穩(wěn)定性進行比較分析。
3.室溫放置穩(wěn)定性比較將腦或脊髓組織原液分別于室溫放置1d、2d、3d、4d和5d后，一份提取RNA作熒光RT-PCR試驗，另一份直接做ELISA檢測，對這兩種方法的穩(wěn)定性進行比較分析。
4.4℃冷藏穩(wěn)定性比較將腦或脊髓組織原液分別于4℃冷藏放置1d、2d、3d、4d、5d、8d、11d和15d后，一份提取RNA作熒光RT-PCR試驗，另一份直接做ELISA檢測，對這兩種方法的穩(wěn)定性進行比較分析。
二.結果1.敏感性比較結果對不同濃度的組織勻漿分別用熒光RT-PCR和ELISA同時檢測，比較這兩種方法的檢測敏感性，結果如表11。
表11 熒光RT-PCR與ELISA方法檢測敏感性比較結果

由表11可以看出，對不同濃度的組織勻漿用兩種方法同時進行檢測，熒光RT-PCR檢測的最低限為0.001％倍稀釋，而ELISA檢測的最低限為0.01％倍稀釋，前者更加敏感，敏感性比后者提高了10倍。
2.熱穩(wěn)定性比較結果將不同濃度的組織勻漿經(jīng)100℃加熱處理30min后，將熱處理前后的樣品同時用熒光RT-PCR和ELISA進行檢測，比較二者的熱穩(wěn)定性，比較結果如表12。
表12 熒光RT-PCR與ELISA方法熱穩(wěn)定性比較結果

由表12可以看出，不同濃度的組織勻漿經(jīng)100℃加熱處理30min，熒光RT-PCR檢測結果表明，熱處理前后同一濃度的樣品其CT值變化不明顯，熱處理后平均CT值有所升高，但升高的幅度不足1.0，熱處理前檢測陽性的樣品，熱處理后仍然檢測為陽性。而ELISA試驗結果表明，熱處理后同一濃度的樣品其OD值明顯降低，原來檢測限0.01％稀釋度的樣品熱處理后檢測結果為陰性。這一結果說明，熒光RT-PCR比ELISA方法更加穩(wěn)定，對熱處理的耐受性更強，檢測結果基本不受加熱處理的影響。
3.室溫放置穩(wěn)定性比較結果將腦或脊髓組織原液分別于室溫放置1d、2d、3d、4d和5d后，同時用熒光RT-PCR和ELISA進行檢測，二者的穩(wěn)定性比較結果如表13。
表13 熒光RT-PCR與ELISA方法室溫放置穩(wěn)定性比較結果

由表13可以看出，腦或脊髓組織原液分別于室溫放置1d、2d、3d、4d和5d后，熒光RT-PCR可以檢測到第4天，而ELISA試驗可以檢測到第2天。結果表明，熒光RT-PCR比ELISA更加穩(wěn)定，前者可以在30℃以上室溫存放4天，而后者可以在相同條件下存放2天，前者更加穩(wěn)定。
3.4℃冷藏穩(wěn)定性比較結果將腦或脊髓組織原液分別于4℃冷藏1d、2d、3d、4d、5d、8d、11d和15d后，熒光RT-PCR試驗和ELISA穩(wěn)定性檢測結果如表14。
表14 熒光RT-PCR與ELISA方法室溫放置穩(wěn)定性比較結果

由表14可以看出，腦或脊髓組織原液分別于4℃冷藏1d、2d、3d、4d、5d、8d、11d和15d后，熒光RT-PCR可以檢測到第15天，而ELISA試驗可以檢測到第5天。結果表明，熒光RT-PCR比ELISA穩(wěn)定性更好，前者可以在4℃冷藏2周，后者可以在4℃冷藏1周。
序列表<110>北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列、方法及試劑盒<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1acctgcgacc tggagtcct 19<210>2<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>2ctcgcgcatc tgccg 15<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成
<400>3actcgttcgt gccgcgc1權利要求
1.一組檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的堿基序列。
2.一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，其特征在于以中樞神經(jīng)組織的標記物GFAP mRNA為靶目標進行檢測。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，其特征在于所述以中樞神經(jīng)組織的標記物GFAP mRNA為靶目標進行檢測使用的引物和探針具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的堿基序列。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，其特征在于所述方法為RT-PCR法，包括如下步驟(1)提取待檢物的RNA；(2)檢測待檢物的GFAP mRNA反應體系 25μl上游引物 0.5ul(10pmol/μl)下游引物 0.5ul(10pmol/μl)探針 0.25ul(10pmol/μl)10×buffer 1.25uldNTP 1.25ulMg2+3ulTaq 0.25ulBeads1bead/5reactionsH2O 15ulRNA模板 3ul反應條件第一階段反轉錄反應，42℃，30min；第二階段預變性94℃，3min；第三階段94℃，10s45℃，30s72℃，1min，5個循環(huán)；第四階段94℃，10s60℃，30s，40個循環(huán)熒光收集設置在第四階段每次循環(huán)的退火延伸時進行；第五階段40℃，1min 降溫(3)繪制標準曲線將提取的RNA從1∶10開始進行10倍梯度稀釋，分別以稀釋倍數(shù)的負對數(shù)為橫坐標、以CT值為縱坐標，繪制標準曲線，求出相關性系數(shù)；(4)對結果進行判定讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的方法，其特征在于所述引物和探針的濃度為10pmol/μl。
6.一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的試劑盒，包括如下試劑(1)總RNA提取試劑；(2)RT-PCR Beads；(3)RT-PCR反應液10×PCR Buffer，Mg2+freedNTP Mixture，各2.5mmol/LTaq DNA聚合酶，5U/μlMgCl2，25mM(4)DEPC處理水；(5)氯仿分析純等級；(6)異丙醇分析純等級；(7)75％乙醇分析純等級無水乙醇用DEPC水配制；(8)PBS121℃，15min高壓滅菌；(9)引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；探針SEQ ID No.3，5’端標記FAM，3’端標記MGB，引物和探針分別用DEPC處理水配成10pmol/μl，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權利要求6所述的一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的試劑盒，其特征在于所述總RNA提取試劑為TRIzolReagent Total RAN Isolation kit。
8.根據(jù)權利要求6所述的一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的試劑盒，其特征在于所述RT-PCR Beads為Ready-To-GoTM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列、方法及試劑盒，屬于檢驗檢疫領域。一組檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質(zhì)的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的堿基序列。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過檢測牛肉中有無GFAP mRNA，可以判斷該批牛肉是否被瘋牛病特殊風險物質(zhì)所污染。與傳統(tǒng)ELISA技術相比，該方法更加敏感、快速、穩(wěn)定性更好。敏感性實驗結果表明，該技術可以檢測到牛肉中含有0.001％的中樞神經(jīng)組織。穩(wěn)定性實驗結果表明，牛肉在室溫(夏天)存放4天、4℃存放2周、100℃加熱處理30min，不會影響檢測敏感性，穩(wěn)定可靠。實驗全程只需要3個小時即可完成，而且可以對實驗過程進行適時監(jiān)控。因而，更能滿足口岸快速、批量檢驗檢疫的需要。
文檔編號C12N15/11GK101033488SQ20061014432
公開日2007年9月12日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權日2006年12月1日
發(fā)明者馬貴平, 史喜菊, 李冰玲, 王宇, 李炎鑫, 劉旭輝 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心