專利名稱：玉米胚乳adp－葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應(yīng)用，特別是涉及來(lái)源于玉米胚乳的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與該突變體及其編碼基因在玉米品種改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉在人類生活中占有重要地位，因此研究人員對(duì)于淀粉合成的研究一直沒(méi)有中斷過(guò)。在農(nóng)業(yè)和林業(yè)領(lǐng)域，人們長(zhǎng)期致力于提高農(nóng)作物(如玉米等)產(chǎn)量，為持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口提供足夠的食物和工業(yè)原料。同時(shí)，從可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的角度出發(fā)，對(duì)玉米生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量的需求將會(huì)日益增加和提高。此外，因?yàn)榈矸酆扛叩闹参锛?xì)胞或器官吸收脂肪或煎炸油少，因而可用于生產(chǎn)低熱量的“更健康”的產(chǎn)品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界80％以上的淀粉來(lái)自于玉米，其中美國(guó)的這一比例更高達(dá)95％以上，我國(guó)在這方面的研究還存在許多缺陷，因此，加速工業(yè)用高淀粉玉米品種的培育和改良已勢(shì)在必行。
在淀粉合成過(guò)程中涉及到一系列酶的參與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphorylase，簡(jiǎn)寫為AGPase)、淀粉合成酶(strarchsynthase，簡(jiǎn)寫為SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，簡(jiǎn)寫為SBE)、淀粉去分支酶(starch debranching enzyme，簡(jiǎn)寫為DBE)等。其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是細(xì)菌糖原和植物淀粉合成的關(guān)鍵酶，催化1-P-Glucose和ATP生成的ADPG作為淀粉合成酶的底物參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，它的活性高低是決定淀粉積累速率的關(guān)鍵因素。在高等植物中，該酶具有一復(fù)雜的異源四聚體結(jié)構(gòu)。到目前為止，AGPase已從玉米、小麥、菠菜、甜菜、擬南芥、大麥和馬鈴薯等多種植物中得到分離和純化。
AGPase活性的高低受多種因素的調(diào)節(jié)，其中別構(gòu)調(diào)節(jié)是一種重要的調(diào)節(jié)方式，該方式通過(guò)調(diào)節(jié)激活劑3-PGA和抑制劑無(wú)機(jī)磷的比例來(lái)達(dá)到控制酶活性的目的。1969年，Cattaneo等(Cattaneo J，O.M.，Sigal N，Sanchez-Medina G，Puig J.Geniticstudies of E.coliK12 mutants with alterations in glycogenesis and propertiesof an altered AGPase.Biochem Biophys Res Commun.1969，34694-701.)發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌(E.coli)K12株系中的一個(gè)突變菌株，其糖原含量比野生型菌株提高了33％以上。進(jìn)一步的研究證實(shí)突變體糖原提高的原因是由于控制糖原合成的關(guān)鍵酶AGPase發(fā)生了突變，改變了該酶對(duì)別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)，即對(duì)別構(gòu)調(diào)節(jié)不敏感(LeeY M，K.A.，Preiss J.Amino acid sequence of an E.coli ADPglucose synthetaseallostefric mutants as deduced from the DNA sequence of the glgCgene.NucleicAcids Res，1987，1510603.)。1992年，Monsanto公司的Stark等人(David M.Stark，Kurt P.Timmerman et al.Regulation of the amount of starch in planttissues by AGPase.Science，258287-291.)將突變的AGPase基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，獲得了淀粉含量提高的轉(zhuǎn)基因植株，平均含量比對(duì)照提高了35％，有的可達(dá)60％，這是利用基因工程手段提高植物淀粉含量第一個(gè)成功的例子。
為深入研究AGPase的催化及調(diào)控性質(zhì)，從而達(dá)到調(diào)控淀粉合成的目的，研究人員用化學(xué)修飾和突變的方法研究了該酶的底物及別構(gòu)劑結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果證實(shí)，該酶含有多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，除底物ATP和G-1-P催化位點(diǎn)外，還存在激活劑3-PGA的結(jié)合位點(diǎn)及無(wú)機(jī)磷的抑制結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)，也得到了一些相應(yīng)的突變體，如對(duì)激活劑3-PGA比較敏感的突變體(Greene，T.W.，I.H.Kavakli，et al.Generation ofup-regulated allosteric variants of potato ADP-glucose pyrophosphorylase byreversion genetics.″Proc Natl Acad Sci USA.1998，95(17)10322-10327.)等。但研究較多的是來(lái)源于馬鈴薯塊莖的AGPase和菠菜葉片的AGPase，而玉米胚乳AGPase的突變體相對(duì)較少。用轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)突變的方法誘導(dǎo)玉米胚乳中AGPase的大亞基基因(Shrunken-2)產(chǎn)生突變，突變株的種子重量比野生型增加了11-18％，進(jìn)一步的分析表明，種子重量的增加是由于突變的AGPase降低了對(duì)抑制劑無(wú)機(jī)磷的敏感性(Giroux，M.J.，J.Shaw，et al.A single mutation that increases maizeseed weight.Proc Natl Acad Sci USA.1996，93(12)5824-5829.)。此外，玉米胚乳的AGPase是一熱不穩(wěn)定的酶，Green等(Greene，T.W.and L. C.Hannah.Enhanced stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase isgained through mutants that alter subunit interactions.″Proc Natl Acad SciUSA.1998，95(22)13342-13347.)利用突變技術(shù)得到了一個(gè)熱穩(wěn)定的突變體，分析結(jié)果表明熱穩(wěn)定的原因是由于大小亞基之間相互作用增強(qiáng)的結(jié)果。
雖然玉米胚乳的AGPase與馬鈴薯塊莖和菠菜葉來(lái)源的AGPases在氨基酸序列上具有很高的同源性，但在亞細(xì)胞定位、調(diào)控性質(zhì)以及熱穩(wěn)定性方面，玉米胚乳AGPase與二者來(lái)源的AGPase存在著很大的區(qū)別，如馬鈴薯塊莖AGPase定位于儲(chǔ)藏器官的淀粉體內(nèi)，而玉米胚乳的AGPase主要定位于淀粉體外的胞質(zhì)中；馬鈴薯塊莖AGPase對(duì)激活劑和抑制劑相當(dāng)敏感，在沒(méi)有激活劑存在的情況下，其活性可以忽略不計(jì)(檢測(cè)活性比較困難)，而玉米胚乳AGPase不同，在無(wú)激活劑存在的情況下，酶活性仍然較高，而且激活劑的存在可以部分彌補(bǔ)抑制劑對(duì)活性的影響；此外，馬鈴薯AGPase可以受不同水平的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯后還原修飾調(diào)控等。而在玉米的籽粒中，AGPase的大小亞基的含量變化與其編碼基因Shrunken-2和Brittle-2的轉(zhuǎn)錄水平一致，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它水平的調(diào)控；在熱穩(wěn)定性方面，由于馬鈴薯塊莖AGPase兩個(gè)小亞基N端均有半胱氨酸，因此形成了比較穩(wěn)定的二硫鍵結(jié)構(gòu)，而玉米AGPase的大小亞基均沒(méi)有此結(jié)構(gòu)。因此，深入對(duì)玉米胚乳AGPase的探討不僅有助于揭示單子葉植物與雙子葉植物在淀粉合成途徑中的異同點(diǎn)，同時(shí)，對(duì)進(jìn)一步提高玉米淀粉含量也有幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)簡(jiǎn)便易行的篩選酶活性提高的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體的方法。
本發(fā)明所提供的篩選玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體的方法，包括以下步驟1)用鹽酸羥胺突變劑對(duì)玉米胚乳AGPase大小亞基基因(Sh2和Bt2)的cDNA在70-80℃溫浴條件下進(jìn)行隨機(jī)突變；所述鹽酸羥胺突變劑配方為0.15-0.25g鹽酸羥胺，125mM pH7.0的焦磷酸鈉1.0-1.6mL，1M的NaCl0.2-0.4mL，500mM pH8.0的EDTA10-14μl，用無(wú)離子水定容至3mL；2)將步驟1)中經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和作為對(duì)照的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，篩選分別轉(zhuǎn)化有經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA的陽(yáng)性單克??；3)將步驟2)篩選的陽(yáng)性克隆接種于Conberg加富固體培養(yǎng)平板上，在35-39℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)；所述Conberg加富固體培養(yǎng)基配方為磷酸二氫鉀8-9g，磷酸氫二鉀10-12g，酵母提取物5-7g，葡萄糖8-12g，瓊脂15-25g，用水定容至1L，最終pH7.0；4)用碘-碘化鉀(I2-KI)溶液對(duì)在步驟3)中Conberg加富固體培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行染色，與對(duì)照菌落的顏色進(jìn)行比較，比對(duì)照顏色深的為突變體菌株，測(cè)序，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體；所述碘-碘化鉀溶液是含0.08-0.12mol/L碘和0.25-0.35mol/L碘化鉀的水溶液。
在上述篩選方法中，步驟1)中的溫浴溫度優(yōu)選為75℃，鹽酸羥胺突變劑的配方優(yōu)選為0.2084g鹽酸羥胺，125mM的焦磷酸鈉(pH7.0)1.2mL，1M的NaCl0.3mL，500mM的EDTA(pH8.0)12μl，無(wú)離子水1.488mL。
步驟2)中經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和作為對(duì)照的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA可通過(guò)含有經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA或野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，所述原核表達(dá)載體可為任意可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的原核表達(dá)載體，如pGEX-KG、pET28a、pET30a、pET-11c、pET-22b等。
步驟3)中的接種方式優(yōu)選為劃線接種，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37℃；Conberg加富固體培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為磷酸二氫鉀8.5g，磷酸氫二鉀11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，瓊脂20g，用水定容至11，最終pH7.0。
步驟4)中的碘-碘化鉀溶液的配方優(yōu)選為含0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化鉀的水溶液。
此外，為篩選出活性更高的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體，可將上述篩選方法中的步驟1)-4)重復(fù)1-3次。
用上述方法篩選獲得的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體，名稱為AGPase-10-3-53，可具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有AGPase活性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由475個(gè)氨基酸殘基組成，與未突變的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相比，自氨基端(N端)第323位由Ile突變?yōu)镸et，自氨基端第499位由Met突變?yōu)锳rg。
編碼上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體的基因(AGPase-10-3-53)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有AGPase活性的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由1428個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1428位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第967-969位堿基編碼突變氨基酸殘基Met，自5’端第1345-1347位堿基編碼突變氨基酸殘基Arg。
含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因AGPase-10-3-53的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌，以及擴(kuò)增AGPase-10-3-53中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高玉米種子淀粉含量的方法。
本發(fā)明所提供的提高玉米種子淀粉含量的方法，是將所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因AGPase-10-3-53導(dǎo)入玉米組織或細(xì)胞，玉米種子的淀粉含量得到提高。
所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因AGPase-10-3-53可通過(guò)含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因AGPase-10-3-53的植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米組織或細(xì)胞。
用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等均具有類似功能。
使用AGPase-10-3-53構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、根部特異表達(dá)啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
具體來(lái)講，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明AGPase-10-3-53的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化玉米組織或細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化的玉米組織或細(xì)胞培育成植株。
本發(fā)明提供了一種玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法。該篩選方法是對(duì)野生型玉米胚乳AGPase基因隨機(jī)突變后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，再將重組子接種于Conberg加富固體培養(yǎng)基上，最后用碘染色法對(duì)長(zhǎng)出的單克隆進(jìn)行篩選，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體。該篩選方法具有簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，此外，檢測(cè)結(jié)果表明，用本發(fā)明篩選方法獲得的玉米胚乳AGPase突變體的酶活性是野生型AGPase的134％，且該AGPase突變體在大腸桿菌中積累糖原的能力與野生型AGPase相比也得到顯著提高；動(dòng)力學(xué)及調(diào)控性質(zhì)分析結(jié)果表明，與該突變體對(duì)底物(ATP和G-1-P)的親和力增強(qiáng)，但對(duì)激活劑和抑制劑的敏感性與野生型AGPase相同，說(shuō)明該突變體對(duì)底物親和力增強(qiáng)是該突變體酶活提高及糖原積累能力提高的原因。本發(fā)明的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法將在玉米的品種改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增的玉米胚乳AGPase大、小亞基基因cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為玉米胚乳AGPase大小亞基基因原核表達(dá)載體pGEX-KG-Sh2-Bt2的部分結(jié)構(gòu)示意3為玉米胚乳AGPase大小亞基基因在無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變菌株中表達(dá)情況的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果及與glgC的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4為玉米胚乳AGPase大小亞基經(jīng)隨機(jī)突變后的第一輪篩選結(jié)果圖5為突變體10-3和10-3-53與對(duì)照的碘染色深淺比較結(jié)果圖6為玉米胚乳AGPase突變體與其它來(lái)源的AGPase小亞基部分的氨基酸殘基序列比對(duì)結(jié)果圖7為經(jīng)純化的玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物合成和測(cè)序工作均由上海生工完成。
實(shí)施例1、玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因的獲得一、玉米胚乳AGPase大、小亞基cDNA的獲得1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)玉米胚乳AGPase大亞基基因Shrunken-2和小亞基基因Brittle-2的cDNA序列(GenBank號(hào)分別為M81603，AF334959)設(shè)計(jì)兩對(duì)RT-PCR引物(Sh和Bt)，同時(shí)為了便于載體構(gòu)建，在設(shè)計(jì)引物時(shí)針對(duì)以下2點(diǎn)做了特殊設(shè)計(jì)a.在Shrunken-2的5’端添加限制性內(nèi)切酶NdeI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI的識(shí)別位點(diǎn)；b.因Brittle-25’端ATG的位置存在一個(gè)限制性內(nèi)切酶NcoI識(shí)別位點(diǎn)，于是將Brittle-2自5’端第39位的A突變?yōu)镃，去掉在該位點(diǎn)存在的第二個(gè)NcoI識(shí)別位點(diǎn)，并在Brittle-23’端添加限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下擴(kuò)增玉米胚乳AGPase大亞基基因Shrunken-2 cDNA的引物對(duì)ShSh2F5’-CCCATATGCAGTTTGCACTTGCATTGGACACG-3’Sh2R5’-GAGAGCTCCCCGGGCTATATGACAGACCCATCGTTGATG-3’；擴(kuò)增玉米胚乳AGPase小亞基Brittle-2 cDNA的引物對(duì)BtBt2F5’-CAAACCATGGACATGGCTTTGGCGTCTAAAGCCTCCCCTCCGCCCTGGAATGCCACCGCCGCCG-3’Bt2R5’-GAGCTCTCATATAACTGTTCCACTAGGGAGTAAAGC-3’。
2、第一鏈cDNA的合成用Trizol RNA提取試劑盒(購(gòu)自天為時(shí)代公司)并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取授粉后18天玉米種子的總RNA，并以此為模板反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈eDNA取1μLOligo(dT)18加到10μL濃度為200ng/μL的總RNA溶液中，70℃反應(yīng)5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘，然后用Promega公司的AMV Reverse Transcriptase并參照說(shuō)明書(shū)加入以下成分5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(試劑盒自帶)5μL，dNTPs(每種10mM)2.5μL，RNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/μL)1μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(30U/μL)3μL，用DEPC處理水定容至25μL。反應(yīng)條件為室溫10min，42℃60min，70℃10min，冰浴2min。
3、PCR擴(kuò)增以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，分別在引物對(duì)Sh和引物對(duì)Bt的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增Shrunken-2和Brittle-2 cDNA，反應(yīng)體系為10×緩沖液5μL，dNTPs(每種10mM)1μL，引物Sh2F(Bt2F)(濃度為10μM1μL，引物Sh2R(Bt2R)(濃度為10μM)1μL，Ex-Taq(5U/μL，TaKaRa公司)1μL，第一鏈cDNA(濃度為10ng/uL)5μL，用滅菌水定容至50μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃1min，62℃45s，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；再94℃1min，65℃45s，72℃2min，25個(gè)循環(huán)；最后72℃10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道Sh2PCR擴(kuò)增的Shrunken-2，泳道Bt2PCR擴(kuò)增的Brittle-2，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約1.5kbp的Shrunken-2cDNA片段和1.4kbp的Brittle-2 cDNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓@兩個(gè)目的片段，將其分別克隆入載體pGEM-T Easy(購(gòu)自Promega公司)中，對(duì)含有Shrunken-2 cDNA片段的克隆載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和SmaI進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了1.5kbp和3.0kbp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符；對(duì)含有Brittle-2 cDNA片段的克隆載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行單酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了1.4kbp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符再將上述克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，除了預(yù)期的Brittle-2自5’端第39位的堿基A突變?yōu)镃外，其它序列均與GenBank上登錄的序列一致，表明經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得序列正確的玉米胚乳AGPase大亞基基因Shrunken-2和小亞基基因Brittle-2的cDNA。
二、玉米胚乳AGPase大小亞基基因在無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變菌株中的異源表達(dá)1、原核表達(dá)載體pGEX-KG多克隆位點(diǎn)的改造由于馬鈴薯塊莖AGPase大小亞基的N端和C端對(duì)該酶的調(diào)控性質(zhì)起到重要作用，所以為使玉米胚乳AGPase大小亞基基因在利用載體pGEX-KG(購(gòu)自Invitrogen公司，該載體的物理圖譜、構(gòu)建方法參見(jiàn)文獻(xiàn)，Guan KL，Dixon JE.Eukaryotic proteinsexpressed in Escherichia colian improved thrombin cleavage and purificationprocedure of fusion proteins with glutathione S-transferase. Anal Biochem.1991，192(2)262-7)進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)不產(chǎn)生融合蛋白，現(xiàn)對(duì)該載體進(jìn)行改造，使載體上的GST蛋白既能提前終止表達(dá)，不產(chǎn)生融合蛋白，又不影響目的蛋白的表達(dá)，設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)(MCS)如下CTAGGA TCCTAA TAACCG GGC AGGTCT AGACCA TGGGAG CTCBamHI stop codonXbal Ncol SaclCAC CAC CAC CAC CAC CACAAG CTTACCHis Tag Hindlll合成該多克隆位點(diǎn)片段，對(duì)其用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-KG用T4 DNA連接酶相連，連接體系及反應(yīng)條件如下10×連接酶緩沖液2ul，pGEX-KG BamHI和HindIII雙酶切片段2ul，MCSBamHI和HindIII雙酶切片段10ul，T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)1ul，滅菌蒸餾水5ul，16℃連接12-24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)，挑取在LB抗性平板(含100mg/L氨芐青霉素)上長(zhǎng)出的單克隆，提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、XhoI和XbaI進(jìn)行單酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，再挑取其中一個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明新合成的多克隆位點(diǎn)片段替代了原載體中的多克隆位點(diǎn)，將改造后的載體pGEX-KG命名為pGEX-KG1。
2、玉米胚乳AGPase大小亞基基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)步驟一擴(kuò)增的玉米胚乳AGPase大亞基基因Shrunken-2的cDNA用限制性內(nèi)切酶NdeI和SacI進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET30a(+)(購(gòu)自Novagen公司)連接，得到含有Shrunken-2 cDNA的重組載體，命名為pET30Sh2；對(duì)步驟一擴(kuò)增的玉米胚乳AGPase小亞基基因Brittle-2的cDNA用限制性內(nèi)切酶NcoI和SacI進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET28a(+)(購(gòu)自Novagen公司)，得到含有Brittle-2 cDNA的重組載體，命名為pET28Bt2；再以pET28Bt2為模板，在引物SD5’-CGGAGCTCTTTAAGAAGGAGATATACC-3’和Bt2R的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增Brittle-2的eDNA及其上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增結(jié)束后，回收約3.0kbp的目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行單酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的重組載體pET30Sh2連接，經(jīng)鑒定后，得到連接有玉米胚乳AGPase大小亞基基因及各自核糖體結(jié)合位點(diǎn)的重組載體，命名為pET30Sh2-Bt2；最后用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI對(duì)pET30Sh2-Bt2進(jìn)行雙酶切，回收并純化約3.0kbp的具有各自核糖體結(jié)合位點(diǎn)的玉米胚乳AGPase大小亞基基因，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pGEX-KG1連接，得到玉米胚乳AGPase大小亞基基因的原核表達(dá)載體，命名為pGEX-KG-Sh2-Bt2，其部分結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。
3、玉米胚乳AGPase大小亞基基因在無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變菌株中的異源表達(dá)及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)1)玉米胚乳AGPase大小亞基基因在無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變菌株中的異源表達(dá)將步驟2構(gòu)建的玉米胚乳AGPase大小亞基基因原核表達(dá)載體pGEX-KG-Sh2-Bt2轉(zhuǎn)化無(wú)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC(菌株購(gòu)自北京天為時(shí)代公司，篩選方法參見(jiàn)文獻(xiàn)，Govons S，Vinopal R，Ingraham J，Preiss J.Isolation of mutants of Escherichia coli B altered in their ability tosynthesize glycogen.J Bacteriol.1969 Feb；97(2)970-972)，篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性單克隆接種于2mL LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中，于37℃振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到50mL LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3-0.5，加入不同濃度的IPTG(終濃度分別為0、0.005、0.01、0.1mM)，繼續(xù)于37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，當(dāng)菌液的OD600為1.0時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，10000rpm離心5分鐘，棄除上清液，向沉淀加入等體積的1×上樣緩沖液(250mM Tris·HCl(pH6.8)，500mM巰基乙醇，10％SDS，0.5％溴酚藍(lán)，50％甘油，4℃保存，使用時(shí)稀釋10倍)，充分懸浮菌體，沸水中煮沸變性5min，再冰浴2min，然后4℃、12000rpm離心1分鐘，上樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，以BSA標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3中的圖A(泳道1為終濃度為0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG1，泳道2為終濃度為0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG，泳道3為沒(méi)加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道4為終濃度為0.005mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道5為終濃度為0.01mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道6為終濃度為0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pGEX-KG-Sh2-Bt2)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，玉米胚乳AGPase 57kDa的大亞基和52kDa的小亞基蛋白均獲得表達(dá)，且不同濃度IPTG(0，0.005，0.01，0.1mM)誘導(dǎo)的玉米胚乳AGPase大小亞基的表達(dá)量并沒(méi)有明顯差異，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所加IPTG濃度越高(如1mM)，玉米胚乳AGPase大小亞基的表達(dá)量反而越低。
2)與glgC(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，GenBank號(hào)NC_000913)的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)挑取步驟1)獲得的玉米胚乳AGPase大小亞基基因表達(dá)菌株的單菌落，接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后于Conberg加富培養(yǎng)基(磷酸二氫鉀8.5g，磷酸氫二鉀11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，瓊脂15g，用水定容至1L，最終pH7)上進(jìn)行劃線，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，用碘-碘化鉀(I2-KI)溶液(0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化鉀)進(jìn)行染色，結(jié)果如圖3中的圖B所示(1為對(duì)照大腸桿菌glgC突變菌株，2為轉(zhuǎn)化有玉米胚乳AGPase大小亞基基因的重組大腸桿菌glgC突變菌株)，轉(zhuǎn)化有玉米胚乳AGPase大小亞基基因的重組大腸桿菌glgC突變菌株生長(zhǎng)狀況良好，表明玉米胚乳AGPase大小亞基在大腸桿菌glgC突變菌株中共表達(dá)，可使該glgC突變菌株在Conberg加富培養(yǎng)基上合成糖原，互補(bǔ)了所缺失的glgC的功能。
三、玉米胚乳AGPase大小亞基的隨機(jī)突變鹽酸羥胺突變劑0.2084g鹽酸羥胺，1.488mL ddH2O，1.2mL 125mM焦磷酸鈉(pH7.0)，0.3mL 1M NaCl，12μl 500mM EDTA(pH8.0)。
用限制性內(nèi)切酶NdeI和SacI對(duì)pGEX-KG-Sh2-Bt2進(jìn)行雙酶切，回收并純化約3.0kbp的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA片斷，然后取鹽酸羥胺突變劑1-3mL，將純化的待突變的20-30μg玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA片斷加到1mL突變劑溶液中，75℃溫浴條件下進(jìn)行隨機(jī)突變，分別于10、20、30、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130分鐘時(shí)各取出50ul，立即放置冰上，待樣品取完后，統(tǒng)一回收DNA片斷，然后將隨機(jī)突變片段連接入原核表達(dá)載體pGEX-KG中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，用與步驟二相同的碘染色法篩選突變菌株。
進(jìn)行第一輪篩選時(shí)，大部分突變菌株經(jīng)碘染色后呈淺黃色；一部分突變菌株經(jīng)染色后的顏色與轉(zhuǎn)化有野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA的大腸桿菌glgC突變菌株(對(duì)照)相似，呈棕色，只有少量的突變菌株經(jīng)染色后變成深棕色。此輪篩選共挑選出大約12000個(gè)單克隆，接種于96孔板中，37℃下振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后劃線于Conberg加富培養(yǎng)基上，再37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，用碘染色法進(jìn)行篩選，經(jīng)3輪篩選后，獲得了2個(gè)碘染色顏色比對(duì)照深的突變菌株，分別為命名為8-2和10-3，第一輪篩選的最后結(jié)果如圖4所示(CK野生型菌株)。
提取篩選到的2個(gè)突變菌株的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明10-3和8-2均是玉米胚乳AGPase小亞基基因Brittle-2自5’端第1345-1347位由編碼Met(M)的堿基突變?yōu)榫幋aArg(R)的堿基。
再以突變菌株10-3為原始材料，用與上述相同的方法進(jìn)行第二次隨機(jī)突變，以獲得活性更高的突變菌株。結(jié)果共獲得了4個(gè)較好的突變菌株，分別命名為10-3-14、10-3-24、10-3-33和10-3-53。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，突變菌株10-3-53重復(fù)性較好，其中，突變菌株10-3-53(53)與突變菌株10-3及對(duì)照菌株(CK)的碘染色情況如圖5所示。
提取突變菌株10-3-53的質(zhì)粒，測(cè)序，結(jié)果該玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因是在突變菌株10-3的玉米胚乳AGPase大小亞基基因的基礎(chǔ)上突變的，命名為AGPase-10-3-53，具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由1428個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1428位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該蛋白命名為AGPase-10-3-53，自5’端第967-969位堿基編碼突變氨基酸殘基Met(野生型為Ile)，自5’端第1345-1347位堿基編碼突變氨基酸殘基Arg(野生型為Met)。AGPase-10-3-53與其它來(lái)源AGPase小亞基部分的氨基酸殘基序列比對(duì)結(jié)果如圖6所示，自氨基端第323位的Ile在玉米胚乳和葉、大麥胚乳和葉、小麥種子來(lái)源的AGPase中是高度保守的，而來(lái)源于所有已知的雙子葉植物、玉米胚和水稻胚乳、葉的AGPase該位置的氨基酸殘基是Val。
實(shí)施例2、玉米胚乳AGPase突變體酶活及糖原含量測(cè)定一、玉米胚乳AGPase突變體粗提液的AGPase活性測(cè)定1、玉米胚乳AGPase突變體粗提液的獲得分別挑取含野生型玉米胚乳AGPase基因的大腸桿菌glgC突變菌株(對(duì)照)及實(shí)施例1經(jīng)篩選獲得的突變菌株10-3和10-3-53的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL的氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后按1∶100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中，在37℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD600為0.6-0.8后，加終濃度為0.1mM IPTG于常溫下誘導(dǎo)12-24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，6000rpm離心收集菌體，稱重，-20℃放置12-24小時(shí)，向每克菌體中添加5mL蛋白提取緩沖液(50mM Hepes(pH7.5)，5mM MgCl2，1mM EDTA(pH8.0)，20％蔗糖，100μM ATP，30％硫酸銨，10mM Pi，5mM DTT，500μg/mL溶菌酶(Lysozyme)，1μg/mL胃蛋白酶抑制(Pepstatin)，1μg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)，1mM Benzamidine，1mM PMSF，10μg/mL絲氨酸蛋白酶抑制劑(Chymostatin))，重懸菌體，冰浴30min后超聲10-15min，最后30000rpm離心20min，收集上清作為酶活測(cè)定的粗提液。
2、AGPase活性測(cè)定取10μl步驟1獲得的蛋白粗提液，與40μl反應(yīng)緩沖液(80mM pH8.0 Hepes，5mM MgCl2，0.5mg/mL BSA，1mM ADPGlc，5mM 3磷酸甘油酸，2mM Dithiotreitol，10μM 1，6-2磷酸葡萄糖)混合，然后加入2mM焦磷酸鈉溶液開(kāi)始反應(yīng)，25℃反應(yīng)10分鐘，煮沸5分鐘，5000rpm離心5分鐘，吸取上清，向上清中加入380μl ddH2O，測(cè)定OD340作為A1，然后再加入70μl反應(yīng)緩沖液(100mM pH7.5 Hepes，0.1mg/mL BSA，5mM MgCl2，1mM NADP，0.8U/mL磷酸葡萄糖變位酶，0.7U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶)，25℃反應(yīng)10分鐘，測(cè)OD340作為A2，以O(shè)D340的變化計(jì)算AGPase活性。
對(duì)照、10-3和10-3-53 AGPase粗提液的AGPase活性分別為0.058unit/mg、0.066unit/mg和0.078unit/mg，表明粗提液AGPase的活性高低與實(shí)施例1中的碘染色結(jié)果一致，突變菌株10-3 AGPase粗提液的AGPase活性是野生型玉米胚乳AGPase的113％，突變體菌株10-3-53 AGPase粗提液的AGPase活性是野生型玉米胚乳AGPase的134％。從碘染色結(jié)果和粗提液AGPase活性分析結(jié)果的一致性來(lái)看，本發(fā)明的篩選方法簡(jiǎn)單易行，可用于篩選AGPase活性提高的玉米胚乳AGPase突變體。
2、糖原含量分析分別挑取含野生型玉米胚乳AGPase基因的大腸桿菌glgC突變菌株(對(duì)照)及實(shí)施例1經(jīng)篩選獲得的突變菌株10-3和10-3-53的單菌落，接種于Conberg加富液體培養(yǎng)基(含100μg/mL的氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后12000rpm離心10min，收集菌體，稱重后用蒸餾水重懸菌體，再在100℃下培養(yǎng)15min，然后加入DMSO和鹽酸，60℃培養(yǎng)30min，用0.5M NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)液pH值至4.5，加3-5U的淀粉糖苷酶，在醋酸鈉(含有50mM醋酸納，pH5.2)培養(yǎng)緩沖液中，55℃反應(yīng)40min降解糖原，然后按葡萄糖的測(cè)定方法測(cè)定由糖原降解產(chǎn)生的葡萄糖含量加10μl培養(yǎng)物于250ul糖反應(yīng)緩沖液(100mM pH6.9 Imidazao-HCl，5mM MgCl2，2mM NAD，1mM ATP)中，加入1-2μl(1-2μ/μl)6-磷酸葡萄糖脫氫酶，室溫反應(yīng)10min，在340nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值，加入1-2μl己糖激酶(Hexokinase，HK)，測(cè)葡萄糖含量。
對(duì)照、10-3和10-3-53的糖原含量測(cè)定結(jié)果分別為32.6mg/g、46.2mg/g和71.9mg/g，結(jié)果與實(shí)施例1的碘染色結(jié)果基本一致，即碘染色淺的其糖原含量低，而碘染色深的其糖原含量相對(duì)較高，上述檢測(cè)結(jié)果表明，與野生型玉米胚乳AGPase相比，用本發(fā)明方法篩選的玉米胚乳AGPase突變體的AGPase活性不僅得到了提高，而且其在大腸桿菌中積累糖原的能力也得到了相應(yīng)的提高，進(jìn)一步證明了該篩選方法的可靠性。
實(shí)施例3、玉米胚乳AGPase突變體的純化1、蛋白的可溶性分析首先將實(shí)施例2獲得的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12-24小時(shí)的玉米胚乳AGPase突變菌株10-3-53的菌液于4℃、5000rpm離心5分鐘，收集誘導(dǎo)細(xì)胞，棄除上清液，用1/10體積的TE(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.2mM EDTA)重懸細(xì)胞沉淀，再加入10mg/mL溶菌酶(用新鮮的TE緩沖液配制)至終濃度為100μg/mL，然后加入1/10體積的Triton-100，30℃培養(yǎng)15分鐘，將離心管放入冰水浴中，超聲波處理，再4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液和沉淀物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳上清液含有可溶性蛋白，可以加入等體積的2×SDS上樣緩沖液后，煮沸5分鐘，室溫下12000rpm離心5分鐘，取30mL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；沉淀含有包涵體，可使用1×SDS上樣緩沖液重懸后，煮沸5分鐘，室溫下12000rpm離心5分鐘，取30mL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳分析結(jié)果表明，玉米胚乳AGPase突變體蛋白大部分存在于沉淀中(即胞內(nèi)表達(dá))，只有少量蛋白存在于上清中。
2、蛋白的大量誘導(dǎo)及粗提液的制備用與實(shí)施例2步驟1中相同的方法將含野生型玉米胚乳AGPase基因的大腸桿菌glgC突變菌株(對(duì)照)和突變菌株10-3-53的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL的氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后按1∶100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中，在37℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD600為0.6-0.8后，加終濃度為0.1mM IPTG于常溫下誘導(dǎo)12-24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，6000rpm離心收集菌體，稱重，-20℃放置12-24小時(shí)，向每克菌體中添加5mL蛋白提取緩沖液，重懸菌體，冰浴30min后超聲10-15min，最后30000rpm離心20min，收集上清，將沉淀再用1/2體積的蛋白提取緩沖液重洗一次，合并上清，得到玉米胚乳AGPase的蛋白粗體液，備用。
3、可溶性蛋白的硫酸銨的分級(jí)沉淀分別用25％、35％、45％、55％、65％、75％的飽和硫酸銨溶液對(duì)步驟2獲得的AGPase蛋白粗體液進(jìn)行分級(jí)沉淀，各個(gè)濃度段的沉淀用透析緩沖液(50mMHepes(pH8.0)，5mM MgCl2，1mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose)懸浮，4℃分別透析12-24小時(shí)，然后取少量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及AGPase活性測(cè)定，確定最適的硫酸銨沉淀濃度。結(jié)果表明大部分AGPase蛋白在45％-55％的硫酸銨濃度下沉淀下來(lái)，收集此濃度段的蛋白沉淀，將沉淀重懸于3mL的透析緩沖液中，4℃透析12-24小時(shí)。
4、離子交換層析利用快速蛋白液相層析(簡(jiǎn)稱FPLC)將步驟3經(jīng)透析的蛋白樣品先過(guò)離子交換層析柱子，樣品過(guò)柱前，先用離子交換層析buffer A(50mM Hepes(pH8.0)，1mM MgCl2，5mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose，5mM Pi，0.5mM DTT)平衡Mono Q5/50柱子(購(gòu)自Pharmacia公司)，平衡穩(wěn)定后再上樣，上樣前先將經(jīng)透析的蛋白樣品調(diào)pH值至8.0，上柱后先用5個(gè)柱床體積的離子交換層析buffer A繼續(xù)漂洗柱子，直至流出液的紫外吸收值達(dá)到穩(wěn)定，然后再用0-50％梯度的洗脫bufferB(50mM Hepes(pH7.0)，1mM MgCl2，5mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose，5mM Pi，0.5mM DTT，1M NaCl)洗脫柱子，流速8.0mL/min，收集流出液，迅速放于冰上暫時(shí)保存。取少量不同吸收峰的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果AGPase蛋白大約在400mM NaCl時(shí)被洗脫下來(lái)。收集該峰值的樣品流出液，測(cè)定AGPase酶活，結(jié)果表明此峰值下洗脫液的AGPase活性較高，合并該峰值的收集液，加固體硫酸銨至75％的終濃度進(jìn)行樣品的濃縮，用透析緩沖液重懸沉淀，4℃透析12-24小時(shí)，于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 5、凝膠過(guò)濾層析將步驟4于-80℃保存的經(jīng)透析的蛋白樣品再過(guò)FPLC的Hiload 16/60 superdex75柱子(購(gòu)自Pharmacia公司)，上樣前，先對(duì)滅菌的蒸餾水進(jìn)行超慮處理，盡可能的去掉水中的氣泡，然后用其洗滌柱子至穩(wěn)定，再用凝膠過(guò)濾層析bufferC(50mMHepes(pH7.5)，10mM MgCl2，5mM EDTA(pH8.0)，5％Sucrose，200mM KCl，1mM DTT)平衡柱子，穩(wěn)定后再上樣，上樣4mL(最大量為5mL)，壓力0.5Mpa，用同樣的bufferC進(jìn)行洗脫，0.2mL/管收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定目的蛋白的洗脫峰，洗脫蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖7所示(泳道M為Marker，泳道1-3為經(jīng)純化的目的蛋白AGPase-10-3-53)，表明獲得了純度較高的目的蛋白，同時(shí)測(cè)定該峰值收集液的AGPase活性，最后合并有活性的部分，分裝后于-80℃保存。
實(shí)施例4、玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53的動(dòng)力學(xué)及調(diào)控性質(zhì)分析對(duì)實(shí)施例3經(jīng)純化的用本發(fā)明方法篩選的玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase(對(duì)照)按如下方法進(jìn)行動(dòng)力學(xué)及調(diào)控性質(zhì)分析1)配制不同濃度的兩種底物(ATP和1-P-G，購(gòu)自Sigma公司)，即0、500nM、1μM、10μm、50μM、100μm、500μm、1mM和5mM，分別在上述不同濃度的底物中測(cè)定AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶活力，計(jì)算反應(yīng)速度v，以1/v對(duì)1/[S]作圖得一直線，其橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/Vmax。
不同底物(ATP和1-P-G)下玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表1所示，與野生型玉米胚乳AGPase比較，本發(fā)明的突變體AGPase-10-3-53對(duì)底物的親和力增加，分析引起該突變體對(duì)底物親和力增加的原因，可能與經(jīng)突變后Shrunken-2和Brittle-2大小兩個(gè)亞基相互作用增強(qiáng)有關(guān)，因?yàn)樾喕园被说?23位的突變位點(diǎn)Ile位于由55個(gè)氨基酸殘基形成的“motif”結(jié)構(gòu)內(nèi)，該“motif”結(jié)構(gòu)的作用是調(diào)控大小兩個(gè)亞基之間的相互作用(Joanna M.Cross，Maureen Clancy，Janine R，Shaw et al.A polymorphic motifin the small subunit of AGPase modulates interactions between the small andlarge subunits.The Plant Journal.2005，41，501-511) 。
表1 不同底物下玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)

2)配制不同濃度的激活劑3-磷酸甘油酸(購(gòu)自Sigma公司)和抑制劑無(wú)機(jī)磷(購(gòu)自Sigma公司)的濃度，即0mM、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2.5mM、5mM和10mM，分別在上述不同濃度的激活劑或抑制劑中測(cè)定AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶活力，以檢測(cè)不同濃度的激活劑或抑制劑對(duì)酶活力的影響。
檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53對(duì)激活劑和抑制劑的敏感性同野生型玉米胚乳AGPase，證明玉米胚乳AGPase突變體AGPase-10-3-53對(duì)底物親和力增強(qiáng)是該突變體酶活提高及糖原積累能力提高的原因。
序列表<160>2<210>1<211>475<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1Met Asp Met Ala Leu Ala Ser Lys Ala Ser Pro Pro Pro Trp Asn Ala1 5 10 15Thr Ala Ala Glu Gln Leu Ile Pro Lys Arg Asp Lys Ala Ala Ala Asn20 25 30Asp Ser Thr Tyr Leu Asn Pro Gln Ala His Asp Ser Val Leu Gly Ile35 40 45Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys50 55 60Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp65 70 75 80Ile Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Ser Lys Ile Tyr Val85 90 95Leu Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala100 105 110Tyr Gly Ser Asn Ile Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Val Glu Val115 120 125Leu Ala Ala Gln Gln Ser Pro Asp Asn Pro Asn Trp Phe Gln Gly Thr130 135 140Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Asn Val145 150 155 160Met Glu Phe Leu Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr165 170 175
Glu Lys Phe Ile Gln Ala His Arg Glu Thr Asn Ala Asp Ile Thr Val180 185 190Ala Ala Leu Pro Met Asp Glu Lys Arg Ala Thr Ala Phe Gly Leu Met195 200 205Lys Ile Asp Glu Glu Gly Arg Ile Ile Glu Phe Ala Glu Lys Pro Lys210 215 220Gly Glu Gln Leu Lys Ala Met Met Val Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu225 230 235 240Asp Asp Val Arg Ala Lys Glu Met Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Ile245 250 255Tyr Val Phe Ser Lys Asp Val Met Leu Gln Leu Leu Arg Glu Gln Phe260 265 270Pro Glu Ala Asn Asp Phe Gly Ser Glu Val Ile Pro Gly Ala Thr Ser275 280 285Ile Gly Lys Arg Val Gln Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp290 295 300Ile Gly Thr Ile Ala Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu Gly Ile Thr Lys305 310 315 320Lys Pro Met Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Phe Ala Pro Ile Tyr325 330 335Thr Gln Pro Arg His Leu Pro Pro Ser Lys Val Leu Asp Ala Asp Val340 345 350Thr Asp Ser Val Ile Gly Glu Gly Cys Val Ile Lys Asn Cys Lys Ile355 360 365Asn His Ser Val Val Gly Leu Arg Ser Cys Ile Ser Glu Gly Ala Ile370 375 380Ile Glu Asp Ser Leu Leu Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Glu Ala385 390 395 400Asp Lys Lys Leu Leu Ala Glu Lys Gly Gly Ile Pro Ile Gly Ile Gly405 410 415Lys Asn Ser Cys Ile Arg Arg Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile420 425 430
Gly Asp Asn Val Lys Ile Leu Asn Ala Asp Asn Val Gln Glu Ala Ala435 440 445Arg Glu Thr Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Gly Gly Ile Val Thr Val Ile450 455 460Lys Asp Ala Leu Leu Pro Ser Gly Thr Val Ile465 470 475<210>2<211>1428<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>2atggacatgg ctttggcgtc taaagcctcc cctccgccct ggaatgccac cgccgccgag 60cagctaattc caaagcgtga caaagccgct gcaaatgatt caacatacct caatcctcaa 120gctcatgata gtgttcttgg aatcattctg ggaggtggtg ctgggactag attgtacccc 180ttgacaaaga agcgtgccaa gcctgcagtg ccattgggtg ccaactatag actgattgat 240attcctgtca gcaattgtct caacagcaac atatccaaga tctatgtgct aacgcaattt 300aactctgctt ccctcaaccg tcacctctca agagcctacg ggagcaacat tggagggtac 360aagaatgaag ggtttgttga agtcttagct gcacagcaga gcccagataa tccaaactgg 420tttcagggta ctgcagatgc tgtaaggcag tacttgtggt tgtttgagga gcataatgtg 480atggaatttc taattcttgc tggcgatcac ctgtaccgga tggactatga aaagttcatt 540caggcacaca gagaaacaaa tgctgatatt accgttgctg ccctaccgat ggatgagaaa 600cgtgcaactg catttggcct catgaaaatt gatgaagaag ggaggatcat tgagtttgct 660gagaaaccga aaggagagca gttgaaagca atgatggttg acaccaccat acttggcctt 720gatgacgtga gggcaaagga aatgccttat attgctagca tgggtatcta tgttttcagc 780aaagatgtaa tgcttcagct cctccgtgaa caatttcctg aagccaatga ctttggaagt 840gaggttattc caggtgcaac cagcattgga aagagggttc aggcttatct gtatgatggt 900tactgggaag atatcggtac cattgcggca ttttataatg caaacttggg aataaccaag 960aagccaatgc cagatttcag cttctatgac cgttttgctc caatttatac acaacctcga1020cacctgccac cttcaaaggt tcttgatgct gatgtgacag acagtgttat tggtgaagga1080tgtgttatta aaaactgcaa gataaaccat tctgtagttg gactccgatc ttgcatatct1140
gaaggtgcta tcatagagga cagtttacta atgggtgcgg actactatga gacagaagct1200gataaaaaac tccttgccga aaaaggtggc attcctattg gtattgggaa aaattcatgc1260atcaggagag caatcattga caagaatgct cgaattggag acaatgttaa gatactcaat1320gctgacaatg ttcaagaagc tgcaagggag acagacgggt acttcatcaa aggtggaatt1380gtcacagtga tcaaggatgc tttactccct agtggaacag ttatatga 1428
權(quán)利要求
1.一種篩選玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體的方法，包括以下步驟1)用鹽酸羥胺突變劑對(duì)玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA在70-80℃溫浴條件下進(jìn)行隨機(jī)突變；所述鹽酸羥胺突變劑配方為0.15-0.25g鹽酸羥胺，125mM pH7.0的焦磷酸鈉1.0-1.6mL，1M的NaCl 0.2-0.4mL，500mM pH8.0的EDTA 10-14μl，用無(wú)離子水定容至3mL；2)將步驟1)中經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和作為對(duì)照的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，篩選分別轉(zhuǎn)化有經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA的陽(yáng)性單克隆；3)將步驟2)篩選的陽(yáng)性克隆接種于Conberg加富固體培養(yǎng)平板上，在35-39℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)；所述Conberg加富固體培養(yǎng)基配方為磷酸二氫鉀8-9g，磷酸氫二鉀10-12g，酵母提取物5-7g，葡萄糖8-12g，瓊脂15-25g，用水定容至1L，最終pH 7.0；4)用碘-碘化鉀溶液對(duì)在步驟3)中Conberg加富固體培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行染色，與對(duì)照菌落的顏色進(jìn)行比較，比對(duì)照顏色深的為突變體菌株，再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體；所述碘-碘化鉀溶液是含0.08-0.12mol/L碘和0.25-0.35mol/L碘化鉀的水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的溫浴溫度為75℃，鹽酸羥胺突變劑為含有質(zhì)量百分濃度6.9％鹽酸羥胺，50mM焦磷酸鈉，0.3M NaCl，2mM EDTA的水溶液；步驟2)中經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和作為對(duì)照的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA通過(guò)含有經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA或野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株；步驟3)中的接種方式為劃線，培養(yǎng)溫度為37℃，Conberg加富固體培養(yǎng)基的配方為磷酸二氫鉀8.5g，磷酸氫二鉀11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，瓊脂20g，用水定容至1L，最終pH 7.0；步驟4)中的碘-碘化鉀溶液為含0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化鉀的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述步驟1)-4)重復(fù)1-3次。
4.用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法獲得的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體，其特征在于所述玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有AGPase活性的蛋白質(zhì)。
6.編碼權(quán)利要求4或5所述的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有AGPase活性的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
8.含有權(quán)利要求6或7所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
9.一種提高玉米種子淀粉含量的方法，是將權(quán)利要求6或7所述的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因?qū)胗衩捉M織或細(xì)胞，玉米種子的淀粉含量得到提高。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因通過(guò)含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米組織或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應(yīng)用。該篩選方法包括以下步驟1)用鹽酸羥胺突變劑對(duì)玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA在70－80℃溫浴條件下進(jìn)行隨機(jī)突變；2)將經(jīng)突變的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA和作為對(duì)照的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌glgC突變菌株，篩選陽(yáng)性單克隆；3)將陽(yáng)性克隆劃線接種于Conberg加富固體培養(yǎng)平板上，在35－39℃下培養(yǎng)；4)用碘－碘化鉀溶液對(duì)在Conberg加富固體培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行染色，與對(duì)照菌落的顏色進(jìn)行比較，比對(duì)照顏色深的為突變體菌株，再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突變體。本發(fā)明的玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法將在玉米的品種改良中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1970744SQ20061014438
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日
發(fā)明者王國(guó)英, 王章英, 陳小平, 王建華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)