專利名稱：：包含向日葵Hahb-10基因編碼序列的DNA構(gòu)建體、包含該序列的轉(zhuǎn)基因植物及該植物的制...的制作方法包含向日葵好flA^M基因編碼序列的DNA構(gòu)建體、包^ff列的轉(zhuǎn)基因植物及該植物的制備旅獄繊本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說，涉及植物遺傳工程。本發(fā)明提供了有用的DNA序列和構(gòu)建體，以獲得具有較短生命周期并更耐受除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。更具體而言，本發(fā)明提供了包含向日葵(他/^^/^0""泌)/^;^-/0基因編碼序列的新型構(gòu)建體，和一種^ffl這些構(gòu)建體獲得植物的方法，所述植物對如甲基紫精的產(chǎn)生氧化脅迫的除草劑具有高耐受性，并與同種野生型植物相比具有縮減的生命周期。背景獄同源異型框基因和植物發(fā)育中的參與。植物發(fā)育是由空間上和時間上的基因,禾歸決定的。這些禾對芋由起轉(zhuǎn)錄因子作用的調(diào)節(jié)蛋白所控制。植物的一個與眾不同的特征在于它們能夠?qū)Νh(huán)境斜科乍出應(yīng)魏改變其發(fā)育，以便適應(yīng)環(huán)境條件。這種反應(yīng)的第一個環(huán)節(jié)是由轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)引發(fā)(shoot)植物的生物化學(xué)上和生理上的改變。驅(qū)動這些反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的知識可用于制備會辦鵬不利環(huán)境割牛的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)錄因子具有期巴基因中的DNA啟動子區(qū)中的特別序列的特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該同源結(jié)構(gòu)域是一個60個酸的蛋白質(zhì)基序，該基序存在于通常參與發(fā)育過程調(diào)節(jié)的眾多真核生物轉(zhuǎn)錄因子之中(Gehring，1987)。該同源結(jié)構(gòu)域存在于己研究過的幾乎每種^t亥生物中。己經(jīng)從真菌、動物和植物中分離一些同源異型框基因(Gehring等人，1994)。在植物中，一些同源結(jié)構(gòu)域蛋白家族已被描述(Chan等人，1998)。這些家族之一，戶刑胃的IOZip,包括具有與同源結(jié)構(gòu)域的C-末端臨近的典型的亮氨酸拉鏈基序的蛋白質(zhì)。正如戶舒頁料的，這些蛋白以二聚體形式結(jié)合DNA。去除亮氨酸拉鏈或在同源結(jié)構(gòu)鄉(xiāng)n亮氨酸拉鏈之間引入額外的氨基酸，顯著地降低結(jié)合親和力，這表明亮氨酸拉鏈負(fù)責(zé)用于有效結(jié)合的同源結(jié)構(gòu)域的正確定位。對于在不同蛋白質(zhì)濃度(concentration)上的結(jié)合的分析表明二聚體形成是DNA結(jié)合的前提(Sessa等人，1993;Palena等人，1999)。己經(jīng)提出并且隨后得到實衞正據(jù)的支持，H>Zip蛋白參與調(diào)節(jié)與植物環(huán)境^f牛應(yīng)答相關(guān)的發(fā)育過程(Carabelli等人，1993;Chan等人，1998;Deng等人，2002;Hanson等人，2001;Mmmelbach等人，2002;Sawa等人，2002;Schena等人，1993;Soderman等人，1999)。擬南芥"ratofo戸is)亞家族II的一個成員Ato-2/股7^的表達(dá)由遠(yuǎn)紅光調(diào)節(jié)，其功能與避陰反應(yīng)相關(guān)(Carabelli等人，1993;Morelli和Ruberti，2000;Morelli和Ruberti，2002;Sreindler等人，1999)。/￡472也是擬南芥亞家族II的一個成員，并MiiDNA微陣列篩選已鑒定其是生長素可誘導(dǎo)基因(Sawa等人，2002)。以前已報道一些來源于向日葵的同源異型框基因的分離和鑒定(Chan和Gonzalez,1994;Gonzalez和Chan,1993;Gonzalez等人，1997;Valle等人，1997)。是該亞家族I的一個成員，并且它的功能與水脅迫反應(yīng)有關(guān)(Dezar等人，2005a;Dezar等人，2005b;Gago等人，2002)。植物的生命周期植物的生命周期開始于種子萌發(fā)并且隨著幼苗生長繼續(xù)，直到其構(gòu)成開花并產(chǎn)生含有將再次開始該植物周期的種子的果實的成熟植株。獲得具有較短生命周期的植物將在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中非常重要。雜草和除草劑雜草是不想要的植物，其通過與農(nóng)作物競爭水分、養(yǎng)分和光照降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。雜草蔭蔽農(nóng)作物，吸收其水分和養(yǎng)分，并且使收割困難?？偹苤?，雜草可與農(nóng)作物競爭養(yǎng)分，引起家畜中毒，可能作為許多不同昆蟲和瘟疫的宿主，妨礙收割任務(wù)，并且釋放一些會,影響目的農(nóng)作物正常發(fā)育的物質(zhì)。這就fet于農(nóng)業(yè)活動來說，雜草被看作是應(yīng)當(dāng)從鄉(xiāng)村清除的有害的和不想要的植物的原因。一些化學(xué)物質(zhì)，所謂的除草劑，己經(jīng)Mffl于控制這樣的雜草，引起其死亡或抑制其生長，而不影響目的農(nóng)作物。百草枯是一種活性成分是甲基紫精的除草劑。這種除草劑iM控制各種各樣的一年生植物和某些多年生雜草來保護(hù)農(nóng)作物。百對古的廣泛應(yīng)用已經(jīng)導(dǎo)致了雜草的抗性。在那些進(jìn)化的抗性生物型中，其已無有意義的農(nóng)業(yè)影響。百草枯的活性成分是甲基紫精，一種在被處理的細(xì)胞中產(chǎn)生特殊的活性氧類超氧化物、在敏感植物中產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化釋放的氧化還原循環(huán)物。超氧化物弓l起細(xì)胞膜減弱，進(jìn)一步導(dǎo)致離子不平衡，并通過破壞葉綠素分子而造成片層中的漂白現(xiàn)象。用除草劑進(jìn)行處理的選擇根據(jù)農(nóng)作物的種植而改變。IOT的量取決于植物的發(fā)育程度和要除去的雜草。人們?yōu)榱双@得對除草劑處理具有良好耐受性的種類，以鵬用那些除草齊,不損害目的農(nóng)作物，已經(jīng)付出了巨大的努力。在這種意義上說，植物改良的不同方法己經(jīng)作出貢獻(xiàn)。但是，已知不論是經(jīng)典的交聯(lián)方法，還是分子標(biāo)記參與選擇，還是突變體獲得都沒有成功，劍門不能指望(countWith)表現(xiàn)出抗性的所有可培育種類的基因型。在這種意義上說，遺傳工程已經(jīng)作出貢獻(xiàn)，即向目的植物中摻入特定基因來產(chǎn)生對于使用會維除雜草的這^H七，的抗性。那么，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的主要目標(biāo)之一是鑒定那些對于不同除草劑產(chǎn)生植物抗性或耐受性的基因，從而使得這些除草劑的使用對目的農(nóng)作物不存在有害的影響。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種編碼向日葵的轉(zhuǎn)錄因子的基因序列/fo/^-肌戶;M基因的活性片段、有功能活性的缺失或遺傳變體。戶/f^列確定為SEQIDNol，其來源于向日葵的DNA、mRNA或cDNA。/^/26-川轉(zhuǎn)錄因子與一個DNA區(qū)(啟動子區(qū))的DNA序列5'-CAAT(C/G)ATTG-3'相結(jié)合，來調(diào)節(jié)一掛革E基因的轉(zhuǎn)錄，這些耙基因參與植物對于環(huán)境斜牛變化的應(yīng)答。本發(fā)明的另一目的是衝共載體或DNA構(gòu)建體，戶，載體或DNA構(gòu)建體包含與核,列SEQNol、禾口/或其片段、缺失或遺傳變體可操作連接的啟動子序列。戶艦載懶每導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子他/2W0的魏。該轉(zhuǎn)錄因子將增加植物對如百草枯的除草劑的耐受性，百草枯用甲基紫精作為其活性成分并且將縮短植物的生命周期。本發(fā)明的另一目的是Jlf共一種轉(zhuǎn)基因植物，戶，轉(zhuǎn)基因植物是用核列SEQNo.l、其活性片段、缺失或遺傳變體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的，其中所述序列編碼/fo/z6-M轉(zhuǎn)錄因子，并且其中所述植物是包括那些樹可經(jīng)濟(jì)目的的任何植物。所述穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的植物高度耐受除草劑，艮卩，百草枯的活性成分甲基紫精，所述除草劑使用氧化釋放作為其功能原理，并且這些植物的生命周期比其在同等條件下生長的野生的對應(yīng)植物短。本發(fā)明的另一目的是提供一種穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的種子，戶脫種子包含DNA序列SEQNol、和/^5腿序歹啲片段，其中戶;M^列編碼轉(zhuǎn)錄因子/fo/^-川或其片段或變體。本發(fā)明的另一目的是樹共一種宿主細(xì)胞，戶腿宿主細(xì)胞是用核1列SEQNo1、或其活性片段、缺失或遺傳變懶急定地轉(zhuǎn)化的，其中戶;M序歹輪碼/foM-州轉(zhuǎn)錄因子，并且其中所述細(xì)胞是細(xì)菌、真菌、植物或動物細(xì)胞。在實施方式中爿，細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是掛共一種植物載體，所述植物表達(dá)載體包含與核,列SEQNol、禾口/或其活性片段、缺失鵬傳變體可操作連接的啟動子區(qū)，和3,-UTR。本發(fā)明的又一目的是^f共一種獲得抗除草劑并且具有較短生命周期的遺傳〈it布的植物的方法，所述方S^括設(shè)計并構(gòu)建一種DNA^T，戶皿DNA分子包含與編碼轉(zhuǎn)錄因子的核,列、其活性片段、缺失或遺傳變體可操作連接的啟動子序列，和3'-UTR;將戶/M構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中；再生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以得至嶋定轉(zhuǎn)化的，轉(zhuǎn)錄因子Hahb-lO的全植株；以及獲得顯示比野生型植物具有更短生命周期和/或更高除草劑耐受性的農(nóng)作物。在iM實施例中，所述啟動子是花W^嵌合病毒35S啟動子。本發(fā)明的另一目的是^f共一種產(chǎn)生與野生植物相比具有較短生命周期的植物的方法。該方法應(yīng)包括用包含核,列SEQNol、和/^0fW列的片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞培,，以^^人這個/這些細(xì)胞再生，植株。本發(fā)明的又一個目的是提供一種植物表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括a)在植物中的功能啟動子，b)編碼序列、其活性片段、缺失或遺傳變體，和c)連接5'-3'的3'-UTR。本發(fā)明的另一目的是Jil共一種轉(zhuǎn)化的植物或其后代、或種子，至少在其一個細(xì)胞中包含在植物功能啟動子的控制下的/MW0編碼序列、其活性片段、缺失或遺傳變體，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，并且屬于包括水稻、就、小麥、苜蓿、旭、煙草和/或棉花的組的一些種。本發(fā)明的另一目的是提供一種在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種目的蛋白的方法，其包括將戶腿盒引入到宿主細(xì)胞中，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白。本發(fā)明的另一目的是^f共一種包含至少100個連續(xù)^tt、與l~989bp之間的cDNA的序列具有80%同源性的DNA分子的片段、遺傳變體或缺失，戶腿序歹偽SEQNol。fflii聯(lián)系附圖和說明，將更好地理解本發(fā)明的以上和其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。在以下附圖中ilil實例說明本發(fā)明，其中圖1顯示/fo/26-^主要在成熟的葉中表達(dá)。為了進(jìn)行毅分析，我們已4頓包含他M-川的5，端部分的特異性探針。ftffl該探針對從不同的向日葵組織中提取的總RNA進(jìn)行RNA印跡分析30天齡的葉中顯示高^ii;K平，在幼苗、莖和子葉中顯示較低水平(圖1)。在根、心皮和雌花中觀察到更低但可測7jC平的轉(zhuǎn)錄本。信號定量表明在成熟葉中的表達(dá)是在幼苗中測得的表ii/JC平的5倍。結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄因子可能在光合組織中的營養(yǎng)/生殖發(fā)育狀態(tài)期間起作用。通過電泳分析從4天齡的幼苗(1)、14天齡的莖(2)、14天齡的葉(3)、或30天齡的葉(4)、心皮(5)或雌花(6)提取的總RNA樣品(各10ug)，將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并與32p標(biāo)記的他M)-^cDNA特異性探^i4行雜交(上方的板)。同樣的濾膜與作為RNA加樣和轉(zhuǎn)移的對照的rRNA探針雜交(下方的板)。用特異性探針獲得的點(diǎn)通過圖象增強(qiáng)(ImageProPlus)軟件來定量，以其rRNA為參照。下方的板中的圖象顯示相對于幼苗中的水平/fo/26-州轉(zhuǎn)錄水平。圖2顯示在黃化的幼苗中//"/26-表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。A:從經(jīng)過如下戶皿不同處理的4天齡的幼苗中提取的總RNA樣品(各20Ug)與32p標(biāo)i己的/MW0cDNA特異性探爭說行雜交(A，上方的板)。同樣的濾膜與作為RNA加樣和轉(zhuǎn)移的對照的rRNA探針雜交。用特異性探針獲得的點(diǎn)通過圖象增強(qiáng)軟件來定量，以其rRNA為參照。下方的板中顯示的圖象顯示相對在熱激處理的幼苗中測得的水平轉(zhuǎn)錄水平。已進(jìn)行信號的定量，采用在這些幼苗中測得的信號作為標(biāo)準(zhǔn)值，因為通過用于此目的的軟件，對照幼苗中測得的信號幾乎不可檢測。B:M51電泳分析從在正常光照割牛下(泳道l)、在黑暗中(泳道2)、或在額外3天期間御巨離光源40cm處在黑暗中萌發(fā)的4天齡的幼苗連續(xù)光照下(泳道3)培養(yǎng)的7天齡幼苗中分離的總RNA樣品(各20ug)，將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與32p^H己的/MW0cDNA特異性探!憤行雜交(上方的板)。同樣的濾膜與作為RNA加樣和轉(zhuǎn)移的對照的rRNA探針雜交(下方的板)。圖3顯示向日葵/fo/^-川基因在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的RNA印跡分析。從野生型(WT)和三個獨(dú)立的過表達(dá)/fo/zZ)-^的轉(zhuǎn)基因植株(TG-A、B和C)中提取總RNA(10pg)。如上戶M使用對或rRNA特異的探針。圖4顯示355*,/fo/^-M轉(zhuǎn)基因植物的表IM。轉(zhuǎn)化的和對照植株之間的比較。A:子葉的俯視圖；B:子葉的須艦圖；C:14天齡的葉；D:四種表現(xiàn)型的21天齡植株的俯視圖。(WT:野生型植株；TG:來源于A、B、C系的轉(zhuǎn)基因植株)。圖5顯示光照纟驢的變4樹15&7M6-川轉(zhuǎn)基因植物的影響t瀏其相鵬生型的影響小。A:在35yEm—2s—1下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的和對照的7天^J苗之間(上方的板)以及在57yEm'2s—1的下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的和對照的14天齡植駄間(下方的板)的比較。B:以不同的光量在土壤中培養(yǎng)的5天齡幼苗的下胚軸長度。這是一個用每一種基因型20個植株來做的有代表性的實驗。用直尺測量下胚軸長度。植物在正常的光照條i牛下或受到富含紅光或富含遠(yuǎn)紅光的光照。對照如后所述用正常光照處理。(WT:野生型植株；TG-A、-B和-C:三種3蟲立的、過表達(dá)/fo/^-70的轉(zhuǎn)基因系)。圖6顯示35^他/z6-川轉(zhuǎn)基因植株比一瞎化植株發(fā)育快。A:在土±生長的轉(zhuǎn)化的和對照的21天齡植株8cm直徑的盆4個植株)之間的發(fā)育狀態(tài)的比較。B:在每個8cm直徑的盆20個植株來做的標(biāo)準(zhǔn)實驗中，轉(zhuǎn)基因植概向囀化植粒間發(fā)育狀態(tài)的差異。圖7顯示在赤霉素處理的轉(zhuǎn)基因植株中莖的伸長幾乎不受影響。在與囀化植株(1)或35S-他M川轉(zhuǎn)基因植株(2:A系；3:B系和4:C系)用直尺測量莖高。灰條表示三個轉(zhuǎn)基因系，白條表示野生型植株。每個板上右側(cè)系列表示GA3處理的植株，而左側(cè)系列表示其未處理的相應(yīng)植株。第一±央板顯示20天齡植株中的觀測結(jié)果，而第二±央板顯示30天齡植株中在第二次激素處理后的觀測結(jié)果。圖8顯示在他/zZ)-^過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中尸^S基因的表達(dá)減少。為了對一瞎化和轉(zhuǎn)基因擬南芥植M行RNA印跡分析，A規(guī)生型(WT)或過，他/^-川的轉(zhuǎn)基因植株的4天齡幼苗中提取總RNA(10ug)，戶M的植物在正常光照條件下生長或經(jīng)歷如后所述的8小時的黑暗處理。使用了對AW、C452、C/ZS或rRNA特異的探針。圖9顯示施用后2天除草齊陌草枯的作用。(WT:野生型植株；TG-A、-B和-C:三種獨(dú)立的、過皿7^M)-州的轉(zhuǎn)基因系)。A:在正常條件下培養(yǎng)30天的對照植株。B:用10uM甲基紫精處理的植株。C:用20txM甲基紫精處理的植株。D:用30uM甲基紫精處理的植株。E:用10uM甲基紫精處理的21天齡轉(zhuǎn)基因植概n野生型植株的上視圖。圖10顯示/fo/^-w轉(zhuǎn)基因植株不如其相應(yīng)的野生型植株對甲基紫精敏感。用10uM甲基紫精處理植物，48小時后觀測。(WT:野生型植株；TG-A、-B和-C:/fo/^-W轉(zhuǎn)基因系)。圖11顯示在本發(fā)明中{頓的/^/-他/^-^敏載體的圖譜，其包含KanamicinR:卡那霉素抗性基因；腿-P:月朋歸酸合M因啟動子；顧-T:胭月歸齡因終止子；//a/2Z)-M:向日葵/fo/^-70基因編碼序列；LB:左側(cè)鵬；RB:右側(cè)末端；。MK^S:花鵬嵌合病毒35S啟動子；CHi^2:原核復(fù)制起始點(diǎn)；I:I限制位點(diǎn)；:Bam//1限帝!H立點(diǎn)?，F(xiàn)在詳細(xì)參照本發(fā)明，本發(fā)明包括包含向日葵/MWO基因編碼序列的DNA構(gòu)建體，和用該構(gòu)建,化的轉(zhuǎn)基因植株，以獲得具有較短生命周期和對如甲基紫精的產(chǎn)生氧化脅迫的除草齊嫩高耐受性這兩個有農(nóng)學(xué)價值的特性的植株。在構(gòu)建體中敏的序列相當(dāng)于SEQEDNol的第35745個鵬。起始密碼子和終止密碼子被標(biāo)出(見序列表中用下劃線標(biāo)示的部分)。在本發(fā)明中，我們對向日葵HI>ZipII亞家族的一個成員W進(jìn)行,和功能的研究。前述實驗結(jié)果暗示氧化還原條件可會m調(diào)節(jié)該亞家族的這個和其它成員的活',作用(Tron等人，2002)。本發(fā)明中進(jìn)行的研究表明他/z6-70主要在成熟的葉和其它光合組織中表達(dá)。而且，其表達(dá)受黃化和赤霉素的正調(diào)控。我們已觀領(lǐng)倒過親他/76-^的擬南芥植株有一1^寺征性表現(xiàn)型，其在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下影響葉的形狀、形態(tài)和顏色、生，率和生命周期。另外，在植株中的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)為其提供對除草劑甲基紫精的耐受性。此外，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比，顯示了對光照條件變化的不同反應(yīng)。我們提出該基因的產(chǎn)物可能參與與植物發(fā)育相關(guān)的光性反應(yīng)。植物獨(dú)有的M>Zip蛋白，被認(rèn)為引M環(huán)境條件變化的發(fā)育應(yīng)答的良好候選者，這種反應(yīng)是植物的典型特征。一些作者已經(jīng)報告了轉(zhuǎn)錄因子HE^Zip家族的一些成員的表達(dá)被不同的外界因素(如光照或水脅迫)所調(diào)節(jié)(Carabelli等人，1993;Carabelli等人，1996;Chan等人，1998;Gago等人，2002;Lee和Chun，1998;Schena和Davis，1992;Schena等人，1993;S6deman等人，1994;S6derman等人，1996;S5derman等人，1999)。具有改變/i4r福礎(chǔ)2(擬南芥HD"ZipII亞家族的一個經(jīng)過充分研究的成員)魏的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出在形態(tài)學(xué)和發(fā)育速率上的改變(Carabelli等人，1993;Schena等人，1993)。,股7^^^-2反義構(gòu)建體的植物比正常的短小、發(fā)育緩侵，反之，毅似7^/4秘-2正義構(gòu)建體的植物比野生型的高大、發(fā)育較快。Schena等人得出結(jié)論說7VZ4艦-2起發(fā)育速率的關(guān)鍵調(diào)控者的作用。這些觀察^A想起那些基于發(fā)光環(huán)^IJ激的效果。通過DNA微陣列篩選，HD^ZipII亞家族的另一個成員別72被鑒定為幼苗中的早期生長素誘導(dǎo)基因(Sawa等人，2002)。似72過鋭植株產(chǎn)生長的下胚軸、偏上性的子葉、長的葉柄和小的葉，這些都是一些生長素過量產(chǎn)生的突變體的典型特征(Delarue等人，1998)。這些植株與野生型植株相比表現(xiàn)出降低的生長素敏感性。另一方面，這些轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出減少的側(cè)樹申長。這些觀測使Sawa等人(2002)提出股72在苗和根組織中起相反的作用，從而調(diào)節(jié)生長素介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生。己表明i/o^-M編碼一種屬于向日葵HI>ZipII亞家族的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子(Gonzalez等人，1997;Tron等人，2002)。在黃化幼苗中//a/^-M表達(dá)的誘導(dǎo)說明其在報知光照條件上可能具有潛在的作用。為了說明這個問題，我們通過選擇擬南荊乍為模型體系并《頓育,導(dǎo)致基因鋭的構(gòu)建條化3陛植物的過皿策略。在我們的研究中所用的35&他/^州轉(zhuǎn)基因系中/fo/^-州的表達(dá)水平比在對照條件下其相應(yīng)的擬南芥植株更高，達(dá)到了在向日葵中其自身的表脈平。在轉(zhuǎn)基因植物中開花發(fā)生的比與瞎化植物早?；ǖ男纬墒且粋€復(fù)雜的形態(tài)學(xué)上的事件，當(dāng)植物達(dá)至U—定的年齡或大小時才能實現(xiàn)。植物的一個重要組群，包括擬南芥，需要合適的環(huán)境^f牛來發(fā)育花。光照和溫度是深刻影響花期的兩個因素。似乎是M某種方式影響參與開花的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。需要進(jìn)行另外的實驗來闡明涉及的機(jī)制。用他M)-^所做的實驗觀測部分類似于Schena用爿船-2/股7￥所做的實驗觀測。相i(^處包括在暗適應(yīng)植物中兩個基因的誘導(dǎo)，和在植物生長的營養(yǎng)期領(lǐng)幌的高穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。過表達(dá)這兩個基因之一的植物與野生型植物相比綠得更深、有更小的根、更少延伸的子葉，并且因為早的開花時間，在兩者中生命周期都縮短了。另一方面，在這兩個轉(zhuǎn)基因中存在一些明顯的不同似7V/4AW在開花植物中增加了其轉(zhuǎn)錄水平，而/fo/z6-川不增加；紅外光照強(qiáng)烈誘導(dǎo)擬南芥基因的表達(dá)而對向日葵基因的誘導(dǎo)很低。似7￥放/^2的過表達(dá)導(dǎo)致在黑暗條件下萌發(fā)的缺損，而向日葵基因引起相反的作用，即過皿植株比野生型植株萌發(fā)更快，在長時期的黃化后更健康。另外，與一囀化植株相比，似7￥/4礎(chǔ)2過敏植株呈現(xiàn)更長的下胚軸，而/foM)-^轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)更短的下胚軸(Schena等人，1993;Steindler等人，1999)。這些觀測使我們得出結(jié)論這蝶因不是直向同源的，它們有不同的功能。j艦-2/股r4已被描述為一種共生同源基因的負(fù)調(diào)控子。它識別其自身的啟動子區(qū)并且其內(nèi)源表達(dá)在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中受阻遏(Ohgishi等人，2001;Steindler等人，1999)。再次，在他/^-"轉(zhuǎn)基因植株中所作的觀測不育獬釋為擬南芥同源基因fflil的產(chǎn)物。實際上，在/fo/^-^過毅植株中，似r4/MW和鮮"轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化。赤霉素是一組參與許多種發(fā)育過程的激素，所述發(fā)育過程包括蓬伸長和種子萌發(fā)的各種方面。在生殖發(fā)育中，赤霉素能影響從幼年到成熟期的轉(zhuǎn)變，也能影響花啟動、性別決定和座果。在本研究中可以觀領(lǐng)倒GA3誘導(dǎo)向日葵中他/zW0的鋭，過載植株顯示已用赤霉素處理的植株的某對爭性。這個事實使我們推測7/fl/^-M可能是赤霉素生物合成和/或功能的正調(diào)控子。這一結(jié)論基本上依據(jù)三個觀測在黑暗條件下主要的種子萌發(fā)、從幼年到成年階段的加速轉(zhuǎn)變和較早的花啟動，所有那些觀測導(dǎo)致植物的較短生命周期。這些現(xiàn)象是受赤霉素影響的，并且在未iOT赤霉素處Sil的/M6，過，植株中也觀測到。用赤霉素處理植物后基因的行為與用生長素處理植物后擬南芥股72基因的行為相似。在這兩個例子中，HD-Zip基因的敏都被激素附秀導(dǎo)，過表達(dá)的植物幾乎對用激素處理不敏感。這兩個例子都暗示基因參與了這些發(fā)育過程，并且其由激素介導(dǎo)。光敏色素是調(diào)節(jié)對光量、量和照射時間的反應(yīng)的光染色蛋白。在擬南芥中，有五種基因編碼光敏色素PHYA.E。光敏色素A和B在一個拮抗物途徑中參與開花時間的調(diào)控(Ma等人，2001)。過表達(dá)PHYA的轉(zhuǎn)基因植物與其相應(yīng)的3瞎化植物相比顯示較早的開花時間(Bagnall等人，1995)。光敏色素B是一種參與檢測與植物密度相關(guān)的紅光與紅外光比例的光受體。在種植轉(zhuǎn)基因馬鈴薯農(nóng)作物的農(nóng)田里，異常擬南芥PHYB基因的轉(zhuǎn)基因植物增加了±央莖的產(chǎn)量(Casal等人，2004)。已經(jīng)報道了在非常高密度的播種下這種效應(yīng)更大(Boccalandro等人，2003)。我們已經(jīng)描述了通過/fo/2WO過鋭植物觀須倒的發(fā)育加決也在高密度下更加顯著。可能向日葵基因也涉及PHYA和PHYB誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。很多基因由光敏色素所調(diào)節(jié)，構(gòu)成了在遠(yuǎn)會I/紅光下光敏色素-發(fā)育變化的分子基礎(chǔ)(Ma等人，2001)?？紤]到在向日葵中HahblO,中所產(chǎn)生的效應(yīng)禾口該基因過表達(dá)的植物的行為，我們決定分析一下一些被光誘導(dǎo)的表達(dá)基因的水平。謝門己檢測三個光誘導(dǎo)基因(C45、AM和CHS)的轉(zhuǎn)^7jC平，并發(fā)現(xiàn)與3瞎化植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中A&S的遠(yuǎn)紅光表達(dá)的轉(zhuǎn);l7K平強(qiáng)烈降低。這一發(fā)現(xiàn)可能表明//fl^-川直接或間接調(diào)節(jié)的，f寺別是在遠(yuǎn)紅光照條件下。在野生型和轉(zhuǎn)基因植物之間，另外兩個基因沒有顯示不同的行為，表明其調(diào)節(jié)可能通過其它途徑誘導(dǎo)。使用非常不同的策略，其他作者也提出這些光誘導(dǎo)基因的不同調(diào)控機(jī)制(Dae-Shik等人，2003)。多年以來，對于不同脅迫類型的耐受性和縮短植物生命周期已作出了巨大的努力。從這種意義上說，正面的結(jié)果是使可耕作的土壤獲得更好的收益，并育樹世界范圍的農(nóng)業(yè)產(chǎn)生重要的經(jīng)濟(jì)影響。但是，涉及形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)過程的反應(yīng)的復(fù)雜性己限制了成功。對于這雖因編碼的蛋白在對不同環(huán)境^j牛的適應(yīng)上所起的作用的更好理解，將提供形成生產(chǎn)更好適應(yīng)的植物的有效策略的基礎(chǔ)。本發(fā)明的結(jié)果暗示獲得轉(zhuǎn)基因植物將能夠得到一種具有較短生命周期、更耐受除草劑、并育,在高密度下生長的植物。在本發(fā)明中，我們分析了在轉(zhuǎn)基因擬南芥中向日葵轉(zhuǎn)錄因子7^/^-70過表達(dá)的效果。選定這個基因是因為它屬于HD-ZipII亞家族。過表達(dá)35S花椰菜嵌合病毒啟動子之下的的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物顯示了如深色的子葉、平面的葉的特別的表型特征，發(fā)育顯著加速，由于縮短的開花時間，縮短大約25%的生命周期。當(dāng)每盆中植株的數(shù)量增加時，轉(zhuǎn)基因個體與一瞎化個體之間在發(fā)育速率上的差異增加。為了展開本發(fā)明，向日葵(/fe/力加^tfL.X向日葵cv.contiflor15，來自于捷利康公司(Zeneca))種子經(jīng)表面滅菌，在培養(yǎng)皿中的濾紙上在黑暗中或在如圖例所描述的不同光照^f牛下i咅養(yǎng)4天。然后，將幼苗轉(zhuǎn)移至含有土壤的塑料支持物上，根據(jù)實驗的目的培養(yǎng)不同的時間。通過將7天齡的幼苗從濕潤的培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到有千燥的濾紙的培養(yǎng)皿中施加水月辦迫。iM將生長在濕潤的培養(yǎng)皿中7天齡的幼苗轉(zhuǎn)移到保持在4"C的冷室中4小時施加冷激。以類似的方式施加熱刺激，但是將植物轉(zhuǎn)移到45"的調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中1小時。激素處理是將7天齡的幼苗轉(zhuǎn)移到有雜羊MS培養(yǎng)掛Gamboig維生素的培養(yǎng)皿，戶腿培養(yǎng)基加入200yM赤霉素(赤霉酸，用于植物組織培養(yǎng)的GA3，Sigma)、10uMABA或者噴霧Ethre膨，一種乙烯釋放劑(2-氯乙基膦酸)。除草劑百對古處理是將轉(zhuǎn)基因和野生型21天齡的植物在正常條件下培養(yǎng)并用10uM、20yM或30txM濃度的甲基紫精對其噴霧。擬南芥生態(tài)型1H侖比亞C4raZ)iii9戸i^/wf/ii3wa/^);/2".EcotypeColumbia)禾中子(Col-0)是從LehleSeeds(Tucson,AZ)購買的。在200pEm'2s"強(qiáng)度長日照光周期(用冷白光和GroLux熒光燈混合光照16小時)下于2224"生長室的土壤中培養(yǎng)植物。在圖中所示的時間內(nèi)在8cm直徑x7cm高度的盆中培養(yǎng)用于不同處理或轉(zhuǎn)化的植物。轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌菌株GV2260被用于iiil浸花^(floraldipprocedure)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(Clough和Bent，1998)。在卡那霉素抗性和i頓具有特異性寡核苷酸hom5(5'-CggTggTTCgTCgTTCT-3，)禾tl10cys(5'-CCgAAITCCCgATCTgTTCACACgAC-3')的基因組DNA上進(jìn)行的正PCR的基礎(chǔ)±轉(zhuǎn)化植株，。為了評價/foM-M的表達(dá)，在T2轉(zhuǎn)化體，行RNA印跡分析。進(jìn)一步再生三種陽性3拉株系(從兩個不同的轉(zhuǎn)化實驗中產(chǎn)生)，用純合的T3和T4植物來分析/fo/z6-"的表ii7K平和轉(zhuǎn)基因植株的表現(xiàn)型。用pBI101.3或pBI121轉(zhuǎn)化的植株作為對照。擬南芥轉(zhuǎn)基因鵬生型植株正常光照割牛下培養(yǎng)15天。此后，用200pMGA3噴霧植物。在第25天重復(fù)該處理。用直尺測量20天齡和30天齡植株的莖長。如Almoguera和Jordano(1992)或Caipenter和Simon(1998)^M分別分離和制備來源于向日葵或擬南芥的總RNA。對于RNA雜交分析，基本上如Sambrook等人(1989)戶脫，用甲使RNA變性，在1.5。/。(Wv)瓊月^/6。/。甲膨lK中分離RNA，再印跡在尼;fe)3莫上(HybondN，Amersham-Pharmacia)。在6xSSC(1xSSC是0.15MNaCl，0.015MNarM酸，pH7.0)、aio/o(w/v)聚乙烯妣咯烷酮、0.1%(w/v)BSA、0.1。/c(w/v)菲可、0.5%(w/v)SDS中65。C下進(jìn)行雜交過夜。通過隨機(jī)引發(fā)用[32p]dATP(1x108dpm/ug)標(biāo)記￡boiII片段(從+l至U+275)(Sambrook等人，1989)，并用作探針，戶脫&oiI"戶I片段(從+l至U+275)對應(yīng)于/fo/Z)-^cDNA的5，-非編碼區(qū)加上編碼區(qū)開始的241個核苷酸，其不包含Hd-Zip結(jié)構(gòu)域。使用Bio^VIax膠片和transcreen(柯達(dá))過teJ^慮膜進(jìn)行放射自顯影。為了核對在每道中加樣和轉(zhuǎn)移的總RNA量，在除了雜交在62。C進(jìn)行之外與如JJM類似的條件下，用來源于蠶豆(Wc^/a&)的25SrRNA再次探測濾膜。/^foS、和CHS基因的探針分別獲得自APZ10gl0、APZ49a09和RZ115ffl4克隆，戶腿克隆由K謹(jǐn)aDNA研究所(日本)惠贈。實施例實施例h/fe秘-州主要在成熟的葉中皿為了進(jìn)行毅分析，我們已4頓包含//"/^川的5，部分的特異性探針。使用該探針與從不同的向曰葵器官中提取的總RNA所做的RNA印跡分析表明在30天齡的葉中有高^7K平，在纖的葉和莖中有較低水平(圖1)。在幼苗、心皮、育S育和不育的花(未顯示)中觀觀倒更低但明顯可檢須沐平的轉(zhuǎn)錄本。信號的定量表明在成熟的葉中的,是在心皮中發(fā)現(xiàn)的水平的10倍，心皮是Z/a/zW0轉(zhuǎn)^7jC平最低的植物器官，但是仍然可測。結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄因子可能在光合組織的營養(yǎng)發(fā)育狀態(tài)中起作用。實施例2:/fa/26-川的皿受光調(diào)節(jié)因為/foM-M屬于M>Zip家族，而這個家族的成員被!慘與了由外界因子和/或激素調(diào)節(jié)的發(fā)育過程，劍門已把向日葵植物進(jìn)行不同處理來研究這種可能性。使用從鄉(xiāng)Si如上所述的不同處理的4天齡的幼苗中提取的總RNA樣品(各20ug)進(jìn)行RNA印跡。對樣品進(jìn)行電泳，將其轉(zhuǎn)移到尼劃莫上，與"P牛斜己的/fo/^-川cDNA特異性探針雜交(A，上方的板)。同樣的濾膜與rRNA探針雜交來作為RNA加樣和轉(zhuǎn)移的對照。用特定探針獲得的點(diǎn)M:ImageProPlus軟件來定量，以其rRNA為參照。下方板所示的圖象顯示相對于在熱激處理的幼苗中測得的水平/foM-川轉(zhuǎn)錄水平。圖2A顯g樣的處M/foM-川轉(zhuǎn)錄水平的影響。冷或熱激、7jC脅迫和低氧輕tti也提高了/foM-/0mRNA水平(圖2)。加入蔗糖(10%w/v)或30mM乙烯利產(chǎn)生類似的效果，而100uM赤霉酸提高了//"M-W的轉(zhuǎn)^7K平，其為熱激處理的5倍。當(dāng)植物在黑暗中培養(yǎng)7天時，觀測到了最強(qiáng)的誘導(dǎo)(14倍)，表明該基因的,可能被光照^j牛所i周節(jié)。實施例3:在他M-川皿的誘導(dǎo)中最重要的效果是由黑暗產(chǎn)生的為了研究這個問題，向日葵植株受到不同的光照條件在距光源不同距離的持續(xù)光照或在黑暗中。圖2B顯示了在黑暗中Hahb-10表達(dá)高，在持續(xù)光照下樹氐。光照驢的改變不影響在25天齡的葉中Hahb-10的表達(dá)(未顯示數(shù)據(jù))。實施例4:獲得過表達(dá)Hahb-10的擬南芥株系為了研究Hahb-10的體內(nèi)功能，我們已4頓過敏的方法。/MWO的編碼區(qū)與花椰菜嵌合病毒35S啟動子融合，用該構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化擬南芥植株。發(fā)現(xiàn)了一些純合系，并且經(jīng)過初步的分析后，選擇出三種名為35S:Hahb-10-A、-B和-C的獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系用于更詳細(xì)的分析。圖3顯示了與不包含HI>Zip結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的/MW0的5'區(qū)進(jìn)行的RNA印跡，其分析了來源于一囀化植滅轉(zhuǎn)基因植株的總RNA。該探針不與從野生型植株中提取的RNA雜交，表明缺少與擬南芥HD-Zip家族的成員或其它基因的交叉反應(yīng)。用來自不同轉(zhuǎn)基因植株的RNA觀觀倒可變強(qiáng)度的信號，暗示它們在不同水平上表達(dá)Hahb-10mRNA。我們也已試驗該基因的擬南芥同源物在轉(zhuǎn)基因植株中是否改變其表達(dá)水平。HAT22和Athb/HAT4的轉(zhuǎn)錄水平都不受轉(zhuǎn)基因存在的影響(未顯示數(shù)據(jù))。實施例5:Hahb-10過表達(dá)株系的表現(xiàn)型與野生型植株相比較，35S-Hahb-10轉(zhuǎn)基因植株在正常條件下培養(yǎng)時表現(xiàn)出特有的表現(xiàn)型。當(dāng)在土壤中培養(yǎng)時，根長比其相應(yīng)的野生型更短(表I)，子葉延伸更少且與下胚軸保持更小的角度，而在非轉(zhuǎn)化植株中，如戶舒員料的，子葉定位于與下胚軸垂直的位置(圖4A和4B)。另外，所有的光合組織vM示更深的綠色。葉在轉(zhuǎn)基因株系中比一瞎化植株的葉中更小且平(圖4C和4D)。表達(dá)在花椰菜嵌合病毒35S啟動子下的/Hahb-10的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株顯示特殊的表型特征，如更深的子葉和平的葉片，以及由于縮短開花時間而縮短植物25%的生命周期的顯著的發(fā)育加速。表I:根在轉(zhuǎn)基因植株中比在與瞎化植株中更短<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>用直尺測量正常條件下在培養(yǎng)皿中i咅養(yǎng)的8天齡的Hahb-10過表達(dá)植株(TG株系A(chǔ)、B、C)或一瞎化植株的根長。這是用每個基因型的20個植株所做的代表實驗。根長用mm表示。實施例6:轉(zhuǎn)基因植株的光^且織比相應(yīng)的野生型植株呈現(xiàn)更深的鄉(xiāng)tfe如表II中所示，轉(zhuǎn)基因植株中的色素含量比野生型植株中高。與野生型植株相比，葉綠素a和b以及花青素在3級他/zW0植株中顯示相對每mg組織的增加值。表II:轉(zhuǎn)基因植株中的色素含量比野生型植株中高<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如前所述，定量色素。數(shù)值表示100mg組織中各色素的Ug數(shù)。這是用每個基因型的20個植株所做的代表實驗。實施例7:轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中光照條件的影響他/2W0過敏株系的表型說明它們可能改變了對光的發(fā)育反應(yīng)。為了研究這個問題，劍門在盆中在距離光源不同的距離處或在完全的黑暗中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株，在該盆中插入一瞎化植株(圖5A和B)。正如所會^見察到的，在黑暗中(圖5A的上方的板)轉(zhuǎn)基因植株顯示下胚軸伸長的缺陷。下胚軸延伸是在黃化的野生型植物中可觀察到的典型反應(yīng)。類似地，光照強(qiáng)度的降低不影響轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育(圖5A，下方的板)，而野生型植物在這些條件下表現(xiàn)出伸長的下胚軸。在富含紅光或富含遠(yuǎn)紅光的光照下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比表現(xiàn)出減少的下胚軸伸長(圖5B)。這些結(jié)果表明他M-^過株系對于光照斜牛的變化更不敏感。實施例8:轉(zhuǎn)基因擬南芥植株比野生型植^^現(xiàn)出更短的生侖周期轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物表現(xiàn)出更決的莖伸頓率(圖6)。在轉(zhuǎn)基因植株中開花發(fā)生的也比較早。野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在高度上的不同在發(fā)育的生殖期變得進(jìn)展不明顯。在轉(zhuǎn)基因植株中種子大約在萌發(fā)之后50天開始成熟，而在同等條件下野生型植株大約在萌發(fā)之后65天開始這^1程。莉II說明用在正常條件下生長的三個獨(dú)立的/fo/26-M過皿株系和野生型植株所做的實驗。直到萌發(fā)后35天，在所有的轉(zhuǎn)基因株系中植物高度更大。該差別在第45天消失，顯示出兩種植物類型有相同的高度，但是有不同的成熟程度。轉(zhuǎn)基因植株比3囀化植株成熟更早，可以提前1-2周收集種子。在轉(zhuǎn)基因植辭口非轉(zhuǎn)化植株中種子的產(chǎn)生是類似的。已經(jīng)進(jìn)行了一些實驗，在這些實驗中觀l慮了兩種基因型的植株所產(chǎn)生的種子的總干重。在重量上觀勝的差射成用每種基因型的12個個體所做的各實驗中中計算的標(biāo)準(zhǔn)差要小。除此以外，轉(zhuǎn)基因植物更耐受在黑暗中的長期培育。表W顯示了經(jīng)過5天黑暗之后存活的植物的百分率。與瞎化組中只有18%的植物存活，而轉(zhuǎn)基因組中顯示平均75%的存活者。觀察到了用每盆2個、5個或20個植株所做的實驗之間的顯著差別。當(dāng)每盆植株的數(shù)量增加時，轉(zhuǎn)基因個體與一瞎化個體之間在發(fā)育速率上的差別成比例地增加，艮口在空地和/或營養(yǎng)限制的^(牛下，過魏植株比一瞎化植株所受的影響要小(圖7，下方的板)。莉II:轉(zhuǎn)基因植株與野生型植概目比表現(xiàn)出更快的莖伸長，并具有更短的生命周期<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在播種后的不同時間，用直尺測量離/M6J的轉(zhuǎn)基因植概叫瞎化擬南芥植株的莖高。這是一個用每個基因型的20個植株所做的代表實驗。莖長用mm表不。表IV:他/^-M過親轉(zhuǎn)基因植株克服長期的黑暗。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在不同時期，將植株放在處于絕對黑暗的培養(yǎng)室中。經(jīng)過黃化處理之后，將它們轉(zhuǎn)移到正常的光照^#下10天。在轉(zhuǎn)移后的4天里記數(shù)健康的植株。顯示了黃^t后在所示時期內(nèi)存活者的百分率。實施例9:赤霉素對7J^)-州過,植株的影響在測試的作為/foM-川載的交她物的激素中，赤霉素被證明是正調(diào)控子。為了研究他M-川過魏株系對于該激素的反應(yīng)，劍門如上戶艦用200"M赤霉素處理植物。正如在圖7中可以觀察到的，在處理后5天^j瞎化植株與其未處理的對照植椒目比莖長增加了3.7倍，而轉(zhuǎn)基因植株的莖長只增加了1.6倍。第二次處理后，觀察到了類似的結(jié)果；如轉(zhuǎn)基因植株(平均誘導(dǎo)L2倍)與野生型植株(平均誘導(dǎo)1.5倍)相比，Xt激素處理幾乎不敏感，這表明/fo/76-M過親植驗現(xiàn)出赤霉素處理糊囀化植株的特征。實施例10:的可能的革隨因由于//WW0屬于向日葵HD^Zip家族，劍門i微了在轉(zhuǎn)基因植概口野生型植株中擬南芥同源基因^艦-2Z/"7^和/￡4722的表ii7jC平。如RNA印跡實驗所推導(dǎo)出的，2/股7￥和/￡4722的轉(zhuǎn)錄水平都不受顯著影響(未顯示)。該結(jié)果強(qiáng)化了如下結(jié)論/M6-M的過皿^t成觀察至啲表型的直接原因。為了研究/fo/26-州的作用機(jī)制，我們也已分析受光照^f牛調(diào)節(jié)的一些基因的表達(dá)水平(Dae-Shilk等人，2003)。我們已準(zhǔn)備針對尸A5(Atlg44575)、C4g2(Atlg29920)和CHS(At5gl3930)的探針，來研究這個問題，所述的^W(Atlg44575)、C452(Atlg29920)和CHS(At5gl3930)分別編碼光系統(tǒng)II相關(guān)蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白和査耳酮合酶。顯著地，與對照植附目比，他/^-/0過皿植株的尸^S的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平顯示了顯著變化，尤其是在紅外光照下(圖8)。與在正常光照條件下其表達(dá)水平相比，在遠(yuǎn)紅光照下在轉(zhuǎn)基因植物中該基因降低了其^ii7K平5倍，而在同樣^[牛下在一瞎化植株中^^見察到1.5倍的降低。同時，在正常光照剝牛下在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平比在其相應(yīng)糊囀化植株中略低。由于與結(jié)合的體外序列未在AM的啟動子區(qū)(轉(zhuǎn)錄起始16位點(diǎn)的上游300(^)，/^^可能是轉(zhuǎn)錄因子//"/^-"的一個間接$巴基因。//"/^-州可能影響參與調(diào)節(jié)PsbS對不同光照斜牛的反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。實施例ll://"/zZk/O過皿植株比野生型植株更耐受除草劑百對古(甲基為了5開究除草劑的耐受性上/MZ)-州過,的影響，在正常條{牛下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因和野生型21天齡的擬南芥，用10、20或30iiM濃度的甲基紫精對其噴霧。噴霧后，將它們放在相同的光照和》鵬剝牛下24小時，在那時容易觀察到葉損傷。MV處理后一周，分析了來源于兩種基因型的葉中的葉綠素含量。容許植株恢復(fù)3天，記識生型或鋭他/76-州基因的轉(zhuǎn)基因植株中幫舌者的百分率。來自于不同轉(zhuǎn)化事件的三種^5:株系的轉(zhuǎn)基因植株顯示以劑量依賴方式耐受l(K30ixM之間的濃度的除草齊岬基紫精(圖9和10)。相反地，同樣的處理顯著影響相應(yīng)糊囀化植株，其與f頓的甲基紫精的濃度相關(guān)。錄娜1.Almogu叫C.andJordano，J.1992.Developmentalendenvironmentalconcurrentexpressionofsunflowerdiy-seed-storedlow-molecular-weightheat-shockproteinandLeamRNAs.PlantMol.Biol.19:781-792.2.BagnallDJ，KingRW，WhitelamGC，BoylanMT，WagnerD，QuailPH.1995.Floweringresponsestoalteredexpressionofphytochromeinmutantsandtransgenticlinesof爿ra6/db戸isf/za/^a(L.)Heynh.PlantPhysiol.108:1495-503.3.BoccalandroH.E.jPloschukE.L.，YanovskyMJ.，SanchezR.A.,GatzC.A.andCasalJ丄2003.IncreasedphytochromeBalleviatesdensityeffectsontuberyieldoffieldpotatocrops.PlantPhysiol.133:153946.4.CarabelliM.，MorelliG"WhitelamG.andRubertiI.1996.Twilight-zoneandcanopyshadeinductionofthehomeoboxgeneingreenplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3530-3535.5.CarabelliM,SessaG3aimaS.沐relliG.andRubertiI.1993.Thev4ra6/db/wiyand-4genesarestronglyinducedbyfar-red-richlightPlantJ.4:469479.6.Carpenter,CD.andSimon,A.E.1998.PreparationofRNA.InMethodsinMolecularBiology,vol.82:/ira編，is1Protocols(eds.J.Martinez-ZapaterandJ.Salinas)，pp.85-89.HumanPressInc.，Totowa^NJ，USA.7.Casal,J丄jFankhauser，C.,Coupland^G.andBlazquez,M.A.2004.Signallingfordevelopmentalplasticity.TrendsPlantSci.9:309-14.8.Chan,RL.,Gago,GMPale叫CMandGonzalezD.H..腦.Homeboxesinplantdevelopment.Biochim.Biophy.Acta1442:1-19.9.Ch叫RX.andGonzalez,D.H.1994.AcDNAencodinganHD-Zipproteinfromsunflower.PlantPhysiol.106:1687-1688.10.Clough，S丄andBen^A.F.1998.Floraldip:asimplifiedmethodfor11.Dae-Shilk^C，Sung-Hyun，H.3ong陽Gil，N.andM謹(jǐn)-Soo,S.2003.FM5Positivelyregulatesfar-redlightresponsesin爿raZ^，is^a//am.PlantCellPhysiol.44:565-572.12.Del證，ML^Prinsen,E"Onckelen,H.V"Caboche，M.andBellini，C.腦.Swr2mutationsof爿ra6/6fepyis^za//aadefineanewlocusinvolvedinthecontrolofauxinhomeostasis.PlantJ.14:603-611.13.Deng,X"Phillips,J.>leijer，A.H"Salamini，F(xiàn).andBartelsA2002.Characterizationoffivenoveldehydration-responsivehomeodomainleucinezippergenesfromtheresurrectionplantCraterostigmaplantagineum.PlantMol.Biol.49:601-610.14.DezarCA,GagoGM，GonzalezDH,ChanRL.2005.編"，asunflowerhomeobox-leucinezippergene,isadevelopmentalregulatorandconfersdroughttoleranceto爿ra6/(i9戸isf/Kz/i^waplants.TransgenicRes.14:429-440.15.Gehring，W丄，Affolter,M3Urglin，T.1994.Homeodomainproteins.Annu.Rev.Biochem.63:487-526.16.Gehring,W.J.1987.HomeoboxinthestudyofdevelopmentScience236:1245-1252.17.Gonzalez,D.H.andChanRL1993.ScreeningcDNAlibrariesbyPCRusinglambdasequencingprimersanddegenerateoligonucleotides.TrendsGenet.9:231-232.18.Gonzalez,D.H.，Valle,E.M"Gago，G.M.andChan,R丄.1997.Interactionbetweenproteinscontaininghomeodomainsassociatedtoleucinezippersfromsunflowers.Biochim.Biophys.Acta1351:137-149.19.Hanson,J"Johannesso^nH.andEngstrom,P.2001.SugatniependentalterationsincotyledonandleafdevelopmentintransgenicplantsexpressingtheHDZipgeneJ77^".PlantMol.Biol.45:247-262.20.Himmelbach,A,^Hoffinann,T.^Leube，M.,Hobener,B.andGrill，E.2002.Homeodomainprotein爿ZHS6isatarg改oftheproteinphosphataseAS//andregulates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示比野生型植株更短的生命周期和對除草劑的更高耐受性。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于戶皿的dna構(gòu)建體還包含一個3，utr。3、如權(quán)利要求2戶，的方法，其特征在于戶;M的啟動子是花椰菜嵌合病毒35S啟動子。4、一種植物魏盒，其包含a贈物中的功能啟動子；禾口by/"/^-川編碼序列、其活性片段、缺失，傳變體。5、如權(quán)利要求4戶脫的基因盒，其還包含c)一個連接5,一3，的3，ujr。6、如權(quán)利要求5戶脫的基因盒，其特征在于戶腿的啟動子是花椰菜嵌合病毒35S啟動子。7、一種植物敏載體，其包含權(quán)利要求4臓的毅盒。8、如權(quán)利要求7戶/M的載體，其還包含一個連接5，-3，的3'UTR。9、宿主細(xì)M其I對可后代，其通過權(quán)利要求1戶，的方法轉(zhuǎn)化。10、一種細(xì)IM其ftf可后代，其使用權(quán)利要求7所述的載,化。11、如權(quán)利要求10戶艦的細(xì)胞，其特征在于戶欣的細(xì)胞是細(xì)菌。12、如權(quán)利要求10戶腿的細(xì)胞，其特征在于戶艦的細(xì)胞是植物細(xì)胞。13、如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其特征在于卵悉的細(xì)胞，/^M)-M編碼序列、其活性片段、缺失或遺傳變體。14、一種j頓權(quán)利要求4戶艦的盒轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于戶腿所述細(xì)胞具有穩(wěn)定地^在其基因組中的戶，的盒。15、一種轉(zhuǎn)基因植物及其^i可后代，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物是由權(quán)利要求14戶皿的植物細(xì)胞再生的。16、如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于其細(xì)胞中的至少一個在包含在權(quán)利要求4戶脫的敏盒中的啟動子的控制下敏//iW0基因編碼序列。17、如權(quán)利要求16戶;M的植物，其特征在于戶，的植物是單子葉植物。18、如權(quán)利要求16戶皿的植物，其特征在于戶，的植物^X子葉植物。19、如權(quán)利要求15所述的植物，其特征在于戶，的植物與野生型植物相比具有更短的生命周期。20、如權(quán)利要求19所述的植物，其特征在于至少在戶皿植物的一個細(xì)胞中，在植物功能啟動子的控制下鋭ifo/^-編碼序列、其活性片段、缺失或遺傳變體，其中，戶艦植物屬于由水稻、玉米、小麥、苜蓿、大豆、煙草和棉花組成的組中的種。21、一種在宿主細(xì)胞中魏至少一種目的蛋白的方法，其包括將權(quán)利要求4所述的盒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，和使宿主細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白。22、一種獲得對產(chǎn)生氧似辦迫的除草劑具有高耐受性的植物的方法，戶腿的方、跑含構(gòu)建一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含與編碼轉(zhuǎn)錄因子/foM-州的核列、其活性片段、缺失或遺傳變體連接的功能啟動子；將戶，構(gòu)建體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中；和再生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的全植株，所述植株表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子/feto-M，并顯示比野生型植株具有更短的生命周期和對除草劑的更高耐受性。23、如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述的DNA構(gòu)建體分子還包含一個3,UTR。24、一種用權(quán)利要求22戶，的方法獲得的植物，所述的植物與野生型植物相比，對通過產(chǎn)生氧^l辦迫來起作用的除草劑具有高耐受性。25、一種分離的DNA分子，其特征在于所述的分子編碼轉(zhuǎn)錄因子26、如權(quán)利要求25戶脫的好，^f寺征在于戶脫的針包含SEQIDNoi序列、其活性片段、缺失^s傳變體，當(dāng)戶;fw列定位在植物功能啟動子控制下時，其保留增弓頓通過在植物細(xì)胞中產(chǎn)生氧化脅迫而起作用的除草齊啲耐受性的功能。27、如權(quán)利要求25戶脫的分子，^#征在于戶腿的針包含SEQIDNoi序列、或其片段、缺失或遺傳變體，當(dāng)戶;iw列定位在植物功能啟動子控制下時，其保留縮^fi物生命周期的功能。28、權(quán)利要求26戶艦的DNA好的片段、遺傳變體或缺失，辦征在于:當(dāng)序列為SEQNo1時，所述分，含至少100個與1989bp之間的cDNA序列具有80%的同源性的連續(xù)。29、權(quán)利要求27戶腿的DNA針的片段、其遺傳變體或缺失，其特征在于當(dāng)序列為SEQNo1時，戶腿^P&含至少100個與l~989bp之間的cDNA序列具有80%同源性的連續(xù)鵬。全文摘要本發(fā)明涉及一種來源于向日葵(Helianthusannuus)的編碼一種轉(zhuǎn)錄因子的基因，所述轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)與亮氨酸拉鏈相關(guān)的同源結(jié)構(gòu)域。該基因被命名為Hahb-10。轉(zhuǎn)錄因子Hahb-10可用于DNA構(gòu)建體，以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和植物。過表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植物更耐受除草劑、并具有更短的生命周期。文檔編號C12N15/09GK101157917SQ200610144759公開日2008年4月9日申請日期2006年10月8日優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日發(fā)明者丹尼爾·H·岡薩雷斯,利亞·拉克爾·贊,卡洛斯·A·德扎爾,埃娃·C·呂埃達(dá)申請人:百塞生技公司;國家科技委員會;利托瑞爾國立大學(xué)